大鼠气虚血瘀肾虚型颈椎病模型的建立

目的：采用病、证模型复合的方法建立大鼠气虚血瘀肾虚型颈椎病模型。方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只,随机分为正常组、颈椎病模型组和气虚血瘀肾虚型颈椎病模型组,每组10只。颈椎病模型采用动静力失衡大鼠颈椎间盘退变模型,气虚血瘀肾虚型颈椎病模型采用动静力失衡大鼠颈椎间盘退变模型复合疲劳加饥饱失常法制造的气虚模型、肾上腺皮质激素和肾上腺素法制造的血瘀模型及去卵巢肾虚模型而制成。通过对大鼠行为体征观察和血液流变学、血小板表面α-颗粒膜糖蛋白（alpha-granular membrane protein,CD62p）、血清雌二醇（estradiol,E2）含量等检测,并用放射免疫法检测血浆环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）与环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）含量,验证气虚、血瘀、肾虚证;通过椎间盘组织病理学观察,免疫组织化学法检测椎间盘组织中Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白含量,实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测颈椎间盘聚集蛋白聚糖（aggrecan-1,Agc1）、Ⅱ型前胶原基因（typeⅡprocollagen gene,Col2a1）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP-13）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TI MP-1）的基因表达等评判椎间盘退变情况。结果：病证结合模型大鼠出现精神萎靡、倦怠、舌质瘀紫、尾色瘀青,体质量下降等气虚、血瘀证的表现,cAMP/cGMP降低,低切还原黏度增高,CD62p表达增高,血清E2含量降低。病理提示颈椎间盘组织结构发生退变,Ⅱ型胶原蛋白表达减少,Ⅹ型胶原表达增高,Agc1、Col2a1和TI MP-1的基因表达降低,MMP-13表达增高。结论：建立了大鼠气虚血瘀肾虚型颈椎病模型,气虚血瘀肾虚加重了颈椎间盘退变。     

大鼠血瘀型颈椎病模型的建立

目的：采用病、证模型复合的方法建立血瘀型颈椎病病证结合动物模型。方法：选择3月龄雌性SPF级sD大鼠30只,随机分为正常对照组、颈椎病模型组和血瘀型颈椎病模型组,每组10只。颈椎病模型采用动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型,血瘀型颈椎病模型在动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型基础上复合肾上腺皮质激素加肾上腺素法血瘀模型制成。通过动物体征、血液流变学、CD62p验证血瘀证;通过颈椎间盘组织病理学、Ⅱ型和X型胶原的免疫组织化学检测及Agc0、Col2a1、MMP-13和TIMP-1的基因表达评判椎间盘退变程度证实颈椎病模型的成立。结果：血瘀型颈椎病模型组动物舌质瘀紫、瘀斑,尾色瘀青;血液流变学指标及CD62p均有不同程度增高,颈椎间盘组织病理学观察可见退变更加明显,Ⅱ型胶原蛋白表达减少,X型胶原表达增高,与正常组和颈椎病组相比差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）;Agc1、Col2a1和TIMP-1的基因表达降低,MMP-13基因表达增高,Agc1、Col2a1的差异与正常组比较有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）,与颈椎病组比较无统计学意义。结论：通过病、证模型复合的方式建立了大鼠血瘀型颈椎病模型,血瘀可以加重颈椎间盘的退变。     

大鼠气虚型颈椎病模型的建立

目的：建立大鼠气虚型颈椎病动物模型。方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只,随机分为正常组、颈椎病模型组和气虚型颈椎病模型组,每组10只。颈椎病模型采用动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型,气虚型颈椎病模型采用动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型复合疲劳加饥饱失常法制造的气虚模型而制成。通过动物的行为、体征、体质量、环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、乳酸脱氢酶（LDH）来验证气虚证;通过颈椎间盘组织病理学、Ⅱ型和X型胶原的免疫组织化学检测及聚集蛋白聚糖（Agcl）、Ⅱ型前胶原基因（Col2a1）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的基因表达评判椎间盘退变程度,以证实颈椎病模型的成立。结果：与正常组和颈椎病组比较,气虚型组动物出现明显的精神委靡、倦怠、少动、喜卧、毛乱无光泽、眼睑下垂等气虚证的表现,体质量下降;cAMP、cGMP升高,cAMP／cGMP降低（P〈0．05,P〈0．01）,LDH升高（P〈0．05）;颈椎间盘组织病理学退变更加明显,Ⅱ型胶原蛋白表达减少,X型胶原表达增高,Agcl、Col2al和TIMP-1基因表达降低,MMP-13表达增高（P〈0．05,P〈0．01）。结论：通过病-证模型复合的方式可建立大鼠气虚型颈椎病模型,气虚可以加重颈椎间盘的退变。     

益气化瘀补肾方对大鼠气虚型颈椎病的作用机制研究

目的：探讨益气化瘀补肾方对气虚型颈椎病大鼠的作用机制。方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只,随机分为正常组、气虚型颈椎病模型组（模型组）和益气化瘀补肾方组（治疗组）,每组10只。正常组不施加任何手术,气虚型颈椎病模型采用动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型复合疲劳加饥饱失常法气虚模型建立,手术3个月后治疗组大鼠予益气化瘀补肾方灌胃治疗1个月。通过放射免疫学、颈椎间盘组织病理学、免疫组织化学、分子生物学等技术研究益气化瘀补肾方作用机制。结果：模型组动物出现精神委靡、少动、体质量下降等气虚表现,cGMP降低,cAMP／cGMP增高,三酰甘油和CD62p增高,E2降低,颈椎间盘退变,Ⅱ型胶原减少,Agc1、Col2a1表达减少,MMP-13表达增高;治疗组与模型组相比,动物精神状态恢复稍快,cAMP／cGMP增高,三酰甘油和CD62p降低,颈椎间盘退变有所改善,Ⅱ型胶原增加,C012a1和TIMP-1表达增高。结论：益气化瘀补肾方通过免疫、代谢、凝血等系统改善证候指标并延缓椎间盘退变。     

益气化瘀补肾方对大鼠肾虚型颈椎病的作用机制

目的：研究益气化瘀补肾方对大鼠肾虚型颈椎病的作用机制。方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只，随机分为正常对照组、肾虚型颈椎病模型组（简称模型组）和益气化瘀补肾方组，每组10只。除正常对照组不施加任何手术外，采用由动静力失衡大鼠颈椎间盘退变模型和去卵巢肾虚模型复合法建立肾虚型颈椎病模型。手术3个月后，益气化瘀补肾方组大鼠予益气化瘀补肾方灌胃治疗1个月。放射免疫法检测血清雌二醇（estradiol，E2和血浆环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）含量；锥板法检测血液流变学；流式细胞仪检测血小板表面α-颗粒膜糖蛋白（alpha—granular membrane protein，CD62p）表达；HE染色观察颈椎间盘组织病理学改变，免疫组织化学检测颈椎间盘Ⅱ型胶原蛋白表达情况，并通过实时荧光定量聚合酶链式反应法检测聚集蛋白聚糖（aggrecan-1，Agcl）、Ⅱ型前胶原基因（type Ⅱ procollagen gene，Col2al）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）mRNA表达。结果：与模型组比较，益气化瘀补肾方组大鼠血清E2含量升高（P〈0．05）；血浆cAMP、cGMP含量有所升高，但差异无统计学意义；全血低切黏度、低切还原黏度和CD62p表达百分率下降（Pd0．05或P〈0．01）；颈椎间盘退变有所改善，Miyamoto评分下降（P〈0．05），11型胶原表达增加；Agcl、Col2al和TIMP-1 mRNA表达增加（P〈0．05，P〈0．01），MMP-13 mRNA表达下降（Pd0．01）。结论：益气化瘀补肾方可通过调节免疫系统、代谢系统、凝血系统和内分泌系统等指标，改善肾虚型颈椎病证候指标，并延缓椎间盘退变。     

益气化瘀补肾方对大鼠血瘀型颈椎病作用机制研究

目的：探讨益气化瘀补肾方对血瘀型颈椎病大鼠的作用机制。方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只,随机分为正常组、血瘀型颈椎病模型组（模型组）和益气化瘀补肾方组（治疗组）,每组10只。正常组不施加任何手术,其余两组采用动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型复合肾上腺皮质激素和肾上腺素法建立血瘀型颈椎病模型。手术3个月后,治疗组大鼠予益气化瘀补。肾方灌胃治疗1个月。通过放射免疫学、颈椎间盘组织病理学、免疫组织化学、分子生物学等技术研究益气化瘀补肾方作用机制。结果：与正常组相比,模型组动物出现舌质瘀紫、尾色瘀青,血黏度、CD62p增高,cAMP增高,颈椎间盘退变,Ⅱ型胶原表达减少;治疗组与模型组比较,血浆黏度、CD62p、三酰甘油、cAMP降低（P〈0．05或P〈0．01）;颈椎间盘退变有所改善,Miyamoto评分下降（P〈0．05）,Ⅱ型胶原表达增加（P〈0．01）,Agcl、Col2al、TIMP-1表达增高（P〈0．05）。结论：益气化瘀补肾方可通过免疫系统、代谢系统、凝血系统、内分泌系统等改善血瘀型颈椎病大鼠的证候指标,延缓椎间盘退变。     

益气化瘀补肾方治疗气虚血瘀肾虚型颈椎病大鼠的机制研究

目的：研究益气化瘀补肾方治疗气虚血瘀肾虚型颈椎病大鼠的作用机制。方法：选择3月龄雌性SPF级SD大鼠30只,随机分为正常组、模型组和益气化瘀补肾方组,每组10只。气虚血瘀肾虚型颈椎病模型通过病、证模型复合而成。益气化瘀补肾方组采用益气化瘀补肾方治疗1个月。通过放射免疫学、组织病理学、免疫组织化学和分子生物学等技术研究益气化瘀补肾方的作用机制。结果：与正常组比较,模型组动物出现精神萎靡、少动,舌质、尾色瘀紫,体质量减轻,子宫及附件质量降低,环磷酸腺苷与环磷酸乌苷及其比值无明显差异,血黏度、血小板表面α-颗粒膜糖蛋白（alpha-granular membraneprotein,CD62p）增高,血清雌二醇（estradiol,E2）降低。益气化瘀补肾方组与模型组比较,除子宫及附件质量外,上述指标均有不同程度改善。HE染色显示模型组颈椎间盘高度降低,纤维环出现裂隙,胶原纤维排列紊乱,髓核减少,软骨终板变薄;益气化瘀补肾方组椎间盘高度正常,纤维环排列稍紊乱,髓核结构良好,软骨终板变化不明显。与正常组比较,模型组Ⅱ型胶原表达减少;益气化瘀补肾方组Ⅱ型胶原在纤维环的表达比模型组有所增加。模型组与正常组比较Ⅱ型前胶原基因和基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissuein—hibitorofmetallopr。teinase1,TIMP1））基因表达降低（P〈0．01）,益气化瘀补肾方组与模型组比较,Ⅱ型前胶原基因和TIMP-1基因表达增高,基质金属蛋白酶-13基因表达降低（P〈0．05,P〈0．01）。结论：益气化瘀补肾方通过调节免疫、凝血和内分泌系统等改善模型动物气虚血瘀肾虚状态,通过调节椎间盘细胞外基质以及相关金属蛋白酶延缓椎间盘退变。     

益气化瘀方对膝骨关节炎大鼠关节软骨退变的防治作用

目的：研究益气化瘀方对膝骨关节炎大鼠模型关节软骨退变的防治作用及其机制。 方法：1月龄SD大鼠90只,随机分为正常对照组、模型组和益气化瘀方组,每组各30只。模型组,益气化瘀方组大鼠通过肩关节离断术＋直立位诱导法建立大鼠膝骨关节炎模型。益气化瘀方组大鼠分别于5、7、9月龄（即造模术后4、6、8月）开始用药,连续用药1个月。3组大鼠分别于6、8、10月龄（即造模术后5、7、9月）处死,每次10只。处死后取大鼠膝关节,行番红O／固绿染色观察关节形态学变化,实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测各组关节软骨内Ⅱ型胶原基因（type Ⅱ collagen gene,Col2A1）、聚集蛋白聚糖（aggrecan-1,Agc1）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP-13）以及金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1）mRNA表达的情况。 结果：模型组关节软骨结构破坏严重,而益气化瘀方组大鼠关节软骨退变较模型组明显减轻。实时荧光定量PCR结果显示,益气化瘀方组6和10月龄大鼠膝关节软骨Col2A1、Agc1以及TIMP-1 mRNA表达量高于模型组（P〈0．01,P〈0．05）,MMP-13 mRNA表达与模型组比较差异无统计学意义;益气化瘀方组8月龄大鼠Agcl mRNA表达明显高于模型组（P〈0。01）,MMP-13 mRNA表达明显低于模型组（P〈0．01）。 结论：益气化瘀方可通过促进软骨合成聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原,延缓膝骨关节炎大鼠关节软骨的退变。     

益气化瘀补肾方对退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响

目的：观察益气化瘀补肾方血清对脊髓型颈椎病患者退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响。方法：取6例确诊为脊髓型颈椎病的住院患者行颈椎减压融合手术摘除的退变椎间盘组织块,采用组织块法培养原代细胞;SD大鼠10只,灌胃制备大鼠益气化瘀补肾方含药血清。取传代第1代的退变椎间盘细胞,分为益气化瘀补肾方含药血清高浓度组（20%）、中浓度组（10%）、低浓度组（5%）及相应体积比浓度氯化钠溶液血清对照组。MTT法检测不同浓度的益气化瘀补肾方血清对椎间盘细胞增殖的影响,实时荧光定量聚合酶链反应检测不同给药时间点各组椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA的表达。结果：第1代退变椎间盘细胞传代第6天时细胞增殖达到顶峰,8d后开始下降,故选择细胞传代第6天为给药干预时间点。与对照血清比较,不同浓度的益气化瘀补肾方血清可促进退变椎间盘细胞的增殖（P〈0.01）,提高退变椎间盘细胞蛋白聚糖mRNA的表达（P〈0.01）,并下调Ⅹ型胶原mRNA的表达（P〈0.01）,且以中浓度的作用最为明显（P〈0.05）。结论：益气化瘀补肾方通过调节退变椎间盘的胶原及蛋白多糖的表达而产生有效防治脊髓型颈椎病椎间盘退变的作用。     

益气化瘀补肾方对脊髓型颈椎病患者退变椎间盘细胞ColⅠ与ColⅡ mRNA表达的影响

目的:观察益气化瘀补肾方含药血清对脊髓型颈椎病患者退变椎间盘细胞ColⅠ、ColⅡmRNA表达的影响。方法:选择脊髓型颈椎病患者经手术摘除的椎间盘组织,采用组织块法培养原代细胞;以SPF级雄性SD大鼠制备药物血清。将传代第1代的退变椎间盘细胞接种于96孔酶标板中,分为6组,分别予低(5%)、中(10%)、高(20%)浓度的益气化瘀补肾方含药血清及相应浓度生理盐水血清DMEM培养液培养。通过实时荧光定量PCR检测ColⅠ、ColⅡmRNA的表达。结果:不同浓度的益气化瘀补肾方血清对椎间盘细胞增殖有明显的促进作用;与生理盐水组比较,益气化瘀补肾方不同浓度含药血清干预后椎间盘细胞ColⅡmRNA表达水平上调、ColⅠmRNA表达水平下调,尤以中浓度更为明显(P<0.01)。结论:益气化瘀补肾方可能通过影响椎间盘组织胶原的变化而发挥防治脊髓型颈椎病椎间盘退变的作用。     

电针天柱、大杼穴对大鼠颈椎间盘退变组织IL-1α、IL-6表达的影响

目的：观察电针天柱、大杼穴对大鼠颈椎间盘退变组织IL-1α、IL-6表达的影响。方法：采用动静力失衡性颈椎间盘退变模型，运用免疫酶标技术观察电针天柱穴、大杼穴对大鼠椎间盘组织IL-1α、IL-6表达的影响，并设假手术组、芬必得组、模型组。结果：IL-1α、IL-6在模型组中有大量表达，与假手术组、电针组、芬必得比较有非常显著性差异（P〈0．01，P〈0．05）；电针和芬必得均能降低IL-1α、IL-6表达，且电针降低IL-1α表达的疗效较芬必得显著（P〈0．01）。结论：电针可以通过降低大鼠退变椎间盘组织炎性细胞因子IL-1α、IL-6的表达达到其治疗作用。     

腺病毒介导的Sox9基因对椎间盘退变动物模型的疗效

目的:探讨腺病毒介导的Sox9基因对兔腰椎间盘退变模型的疗效。方法:采用新西兰大白兔的纤维环损伤法制作腰椎间盘退变模型,24周后,用注射法将腺病毒介导的Sox9基因注射到退变的椎间盘组织观察退变椎间盘组织的变化,行磁共振扫描拍片观察椎间盘变化情况,同时,取椎间盘用精确定量RT-PCR观察Ⅱ型胶原(Col2 al)mRNA的变化。结果:核磁共振扫描拍片证实椎间盘退变有所恢复,精确定量RT-PCR法证实Sox9基因在转录水平上调了Col2 al。结论:腺病毒介导的Sox9基因对兔椎间盘退变模型有明显治疗作用。     

补肝健腰方对腰椎间盘退变大鼠椎间盘MMP-3、TIMP-1表达的影响

目的观察补肝健腰方对腰椎间盘退变大鼠椎间盘基质金属蛋白酶3(MMP-3)、基质金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP-1)表达的影响。方法 SD大鼠75只,随机分为假手术组、模型组、腰痹通组、强力霉素组、补肝健腰组,每组各15只,成功制备大鼠腰椎间盘退变模型,分别给予腰痹通胶囊、强力霉素、补肝健腰方药物灌胃,检测各组干预前和干预后20、40 d时椎间盘MMP-3、TIMP-1表达。结果干预后20、40 d,腰痹通组、强力霉素组、补肝健腰组椎间盘MMP-3、TIMP-1表达较模型组下降,差异有统计学意义(P0.05),腰痹通组、强力霉素组、补肝健腰组在干预后20、40 d时椎间盘MMP-3、TIMP-1表达水平,分别与本组干预前比较,差异有统计学意义(P0.05),补肝健腰组在以上各时间点与腰痹通组、强力霉素组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论补肝健腰方能降低腰椎间盘退变模型大鼠椎间盘MMP-3、TIMP-1表达,这可能是其防治椎间盘退变疾病的作用机理之一。     

腰椎间盘组织中MMP-7的表达及意义

目的 检测突出间盘组及对照组腰椎间盘中基质金属蛋白酶-7(MMP-7)的表达情况，探讨MMP-7在腰椎间盘退变突出中的作用。方法 应用免疫组化链霉素亲生物素-过氧化物酶法(S-P)对实验组32例腰椎间盘突出标本及对照组11例非突出间盘标本分别进行抗MMP-7蛋白单克隆抗体染色。实验组按术中病理分型分为突出、脱出、游离型。显微图象分析系统采集灰度值，数据进行统计学分析。结果 实验组MMP-7蛋白表达高于对照组，实验组中游离型及脱出型的MMP-7蛋白表达均比突出型高，游离型和脱出型之间MMP-7蛋白表达无差异。结论 腰间盘组织中MMP-7蛋白表达情况与腰椎间盘退变突出有关，MMP-7蛋白表达增加可能是导致腰间盘退变突出的原因之-。     

椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变的相关性研究

目的 探讨椎体软骨终板内软骨细胞凋亡和椎间盘退变之间的关系.方法 40只成年新西兰白兔,随机平均分为实验组和对照组.实验组采用阻断椎体软骨终板营养途径的方法制作椎间盘退变模型,对照组不做任何处理.术后4周和8周,每组各处死10只动物,切取软骨终板和相应的椎间盘组织.TUNEL法检测终板软骨细胞的凋亡数,免疫组织化学方法检测椎间盘内Ⅱ型胶原阳性细胞数,并对两组数据进行相关性分析.结果 实验组软骨终板内凋亡的软骨细胞在4周、8周时分别为9.9±O.88个/视野和12.4±0.71个/视野,较对照组明显增加,4周、8周组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).相关分析显示,术后4周和8周终板软骨细胞凋亡与Ⅱ型胶原表达之间有高度的相关性,相关系数分别为0.86和0.82(均P＜0.05),表明椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变之间存在有高度的相关性.结论 阻断椎体软骨终板营养途径可导致椎间盘退变的发生,椎体终板软骨细胞凋亡增加可导致椎问盘内Ⅱ型胶原表达进一步减少.     

颈椎间盘髓核组织中TRAIL及DR5的表达与髓核细胞凋亡的相关性研究

目的检测颈椎间盘内髓核组织细胞密度、细胞凋亡率以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及死亡受体5（DR5）的表达。方法实验组30个标本来自脊髓型颈椎病患者前路手术所切取的椎间盘组织（C3-C7）,对照组30个标本为颈椎创伤患者前路手术所取得的椎间盘组织。采用HE染色观察髓核组织中凋亡小体和细胞密度,原位DNA片段末端标记法（TUNEL）检测凋亡细胞率,用免疫组织化学法检测TRAIL、DR5的表达。结果实验组髓核组织中的细胞密度均低于对照组,TUNEL阳性细胞率均高于对照组（P〈0.01）;实验组TRAIL、DR5染色阳性细胞率均高于对照组（P〈0.05）。将两组全部60例颈椎间盘标本合并后进行Pearson相关分析,颈椎间盘TUNEL阳性细胞率与细胞密度之间呈负相关（r=-0.969,P〈0.01）;两组髓核内TRAIL、DR5染色阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关r=0.921和0.755,P〈0.01）。结论细胞密度下降参与了颈椎间盘的退变过程,细胞凋亡是椎间盘髓核细胞减少的原因之一,颈椎间盘组织中存在DR5/TRAIL诱导的凋亡途径。