昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前不同培养方法的效果比较

目的:胚胎干细胞的获得、克隆与传代对实验条件及操作技术水平要求较高。分别将单纯胚胎干细胞培养液法与KSOM-胚胎干细胞培养液法应用于昆明小鼠胚胎干细胞囊胚孵出前阶段,对体外培养的胚胎干细胞进行鉴定,并比较其增殖与克隆形成情况。方法:实验于2006-03/10在哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室暨组织工程中心完成。①冲胚液配制:含体积分数为0.05胎牛血清的磷酸盐缓冲液,4℃冰箱保存。②KSOM胚培养液配制:将配制好的贮存液放入-20℃冰箱保存,用时加入1g/L的胎牛血清白蛋白和1mL/L的丙酮酸钠,过滤,调配至100mL。③取6～8周龄雌性昆明小鼠35只腹腔内注射孕马血清绒毛膜促性腺激素7.5IU/只,48h后注射人绒毛膜促性腺激素7.5IU/只,然后与10周龄雄性昆明小鼠15只合笼,次日晨雌鼠见栓者记为妊娠0.5d。④于妊娠3.5d冲胚,将冲出的囊胚分别应用于单纯胚胎干细胞培养系统、KSOM-胚胎干细胞培养系统。前者直接利用胚胎干细胞培养液在饲养层上培养并孵出囊胚;后者先应用KSOM液滴培养囊胚至孵出,再改用胚胎干细胞培养液于饲养层上培养孵出的囊胚。⑤将孵出的囊胚置于预先制备好的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养,酶-机械法分离囊胚内细胞团,观察可传代的囊胚内细胞团数与原代胚胎干细胞的克隆形成率。⑥对培养的胚胎干细胞进行Oct-4染色和碱性磷酸酶染色鉴定,并检测其体外分化能力。结果:①不同培养系统对孵出囊胚状态的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统:KSOM液滴中处于囊胚内细胞团状态的囊胚腔逐渐增大,待取出时胚胎扩展更加充分,一侧突出一个大泡但未突破透明带,此为正在孵出的囊胚。孵出后仍维持有腔的囊胚状态,表明胚胎的质量良好。移入饲养层后即贴壁,囊胚内细胞团开始增殖。单纯胚胎干细胞培养系统:囊胚培养24h后开始孵出并贴壁,囊胚内细胞团逐渐增大,最后将囊胚腔充满。②不同培养系统对原代胚胎干细胞克隆形成率的影响:KSOM-胚胎干细胞培养系统、单纯胚胎干细胞培养系统的囊胚总数分别为154只和131只,差异无显著性意义(P>0.05);两种培养系统的囊胚内细胞团可传代数量分别为89只和80只,增殖到能够离散的程度基本相似(57.8%,20.1%,P>0.05);原代胚胎干细胞囊胚内细胞团离散后出现集落数分别为31个和38个,克隆形成率差异无显著性意义(20.1%,29.0%,P>0.05)。③胚胎干细胞鉴定结果:第5代胚胎干细胞Oct-4染色和碱性磷酸酶染色均呈阳性。④胚胎干细胞体外分化能力检测结果:胚胎干细胞团块悬浮培养4d时,形成由上百个细胞组成的球状拟胚体。结论:①单纯胚胎干细胞培养液一步法与KSOM-胚胎干细胞培养液两步法孵出囊胚所获得的胚胎干细胞集落形态类似,均具有胚胎干细胞的形态学特征,但后者在KSOM液培养阶段有利于囊胚孵出前的早期胚胎发育同步化。②两种培养方法得到的胚胎干细胞其增殖及克隆形成能力基本相似。     

治疗性克隆的机遇与挑战

治疗性克隆（therapeutic cloning）是一种将体细胞核移植技术和最新的人胚胎干细胞技术相结合的技术，也是人类医疗历史上革命性的技术。该技术操作方法是先用患者的体细胞，如皮肤细胞、骨髓间充质干细胞等作为核供体，将其细胞核植入去核的人卵母细胞，获得克隆胚胎；然后从克隆胚胎分离建立胚胎干细胞系，并将这些胚胎干细胞在一定条件下诱导分化成所需要的各种类型的细胞用于治疗目的。目前，已有用产生多巴胺的神经元细胞治疗帕金森症、用产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病患者的报道。干细胞根据分化能力的不同，可以分为全能干细胞、多能干细胞及单能干细胞；根据来源的不同，又可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞。ESC是从着床前的早期胚胎（囊胚）内细胞团中分离获得的一种二倍体细胞，理论上具有发育成各种组织器官的潜能，是迄今研究得最广泛、最成熟的干细胞体系。上世纪80年代，ESC的分离和培养首先在小鼠中获得成功。     

昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较

背景:远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的最佳方法和最适合的采胚时间.方法:采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论:免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著(P > 0.05);全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法(P < 0.05),但原代克隆形成率显著低于免疫外科法(P < 0.05);全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚(P < 0.05);免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚(P < 0.05).结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.     

昆明小鼠3.5d和4d囊胚不同分离方法的比较

背景：远交系的昆明小鼠作为中国自然科学研究主要实验动物,其胚胎干细胞建系的成功率一直很低.目的：探讨昆明小鼠胚胎干细胞体外分离培养的最佳方法和最适合的采胚时间.方法：采集孕3.5 d和4 d的囊胚分别以免疫外科法和全胚培养法在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离和克隆昆明小鼠胚胎干细胞集落.结果与结论：免疫外科法和全胚法培养3.5 d囊胚的内细胞团贴壁率和原代克隆形成率差异均不显著（P 〉 0.05）;全胚法培养4 d囊胚的内细胞团贴壁率显著高于免疫外科法（P 〈 0.05）,但原代克隆形成率显著低于免疫外科法（P 〈 0.05）;全胚法培养4 d囊胚的原代克隆形成率显著高于3.5 d囊胚（P 〈 0.05）;免疫外科法分离4 d囊胚内细胞团的贴壁率和原代克隆形成率显著高于以同样方法分离培养的3.5 d囊胚（P 〈 0.05）.结果显示用免疫外科法分离4 d囊胚更适合于昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养.     

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

背景:人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。目的:进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。方法:人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养,采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。结果与结论:人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化,很快死亡;可以观察到人胚胎干细胞分化,然而,随着OP9细胞死亡,分化的人胚胎干细胞亦死亡,不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化,或向造血干细胞分化的能力较低。     

干细胞的可塑性及其在神经系统疾病细胞治疗中的应用

干细胞是一种未分化细胞 ,具有自我更新和多向分化的能力。根据其分化潜能 ,可分为 3类 :①全能干细胞 :即受精卵 ,在受精后的头几个小时内 ,受精卵可以分裂为功能一致的全能细胞 ,将其中的任一细胞置于女性的子宫内均可发育为胎儿 ;②胚胎干细胞 :来源于囊胚期的内细胞团或原肠胚的生殖嵴细胞 ,它具有广泛的分化潜能 ,可生成除胎盘外的所有组织细胞 ;③多能干细胞 :它局限于器官的某些特定部位 ,可分化为所在组织的各种细胞 (如造血干细胞可分化为髓系和淋巴系细胞 )。在胚胎发育中 ,它的增殖和分化是器官、系统发生的基础 ;存在于成年组织…     

神经干细胞在神经科临床的运用前景

干细胞是指具有自我更新和分化能力的细胞群。大量的研究已证实，在发育期及成年哺乳动物的各种组织和器官贮藏有干细胞。这些组织包括上皮、血液、脑、脂肪和胰腺等。在成年动物，干细胞的主要作用是参与补充因正常衰老或损伤而丧失的细胞。相对之，胚胎干细胞较成年动物干细胞贮备量大。哺乳动物的胚胎干细胞源于囊胚，之后，内细胞群的干细胞迅速分化产生原始外胚层，并最终分化为三胚层，以后再发生为各种组织、器官。     

昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞并诱导分化为胰岛素前体细胞的实验

目的:自囊胚内细胞团分离培养患者自身的胚胎干细胞并将其诱导分化为目的细胞可用于特定疾病的治疗。实验采用昆明小鼠3.5d囊胚分离培养胚胎干细胞,并将其诱导分化为胰岛素前体细胞。方法:实验于2005-09/2006-11在哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室完成。①选取妊娠3.5d昆明雌性小鼠123只,至13.5d时取11只用于胚胎成纤维细胞饲养层制备。剩余112只妊娠3.5d小鼠冲胚后,挑取扩展充分、囊胚内细胞团明显的囊胚采用胰酶 乙二胺四乙酸机械法分离培养胚胎干细胞,进行碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色鉴定。②在细菌培养皿的盖上用不含人重组白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液制备液滴,选取生长旺盛、形态典型的胚胎干细胞集落,采用胰酶 乙二胺四乙酸机械法悬浮培养4d,形成拟胚体,行巢蛋白免疫荧光染色。③将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞,首先需要L-多聚赖氨酸和纤维粘连蛋白包被培养皿,然后用ITSFn筛选液(含5mg/L胰岛素、50mg/L转铁蛋白、30nmol/L亚硒酸钠、5mg/L纤维粘连蛋白的DMEM/F12培养液)筛选巢蛋白阳性细胞6d,碱性成纤维细胞生长因子扩增及初步诱导6d,再以烟碱诱导功能成熟的胰岛素前体细胞27d。应用DTZ染色、Insulin免疫荧光染色对诱导的细胞进行鉴定。结果:①胚胎干细胞的分离培养:将扩展充分的囊胚放置在饲养层上4d后,可见囊胚内细胞团自透明带中孵出,呈柱状生长,中央颜色深于周边,并将周边的饲养层细胞推开。胚胎干细胞传代后呈典型的克隆样生长,相差显微镜下折光性强。②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色和Oct-4免疫荧光染色结果:两种染色均呈阳性表达。③拟胚体的形成及向巢蛋白阳性细胞的诱导:胚胎干细胞悬浮培养4d可形成拟胚体,经ITSFn筛选6d后可见90%巢蛋白阳性细胞。④巢蛋白阳性细胞向胰岛素前体细胞的分化:烟碱诱导6d后,上皮样细胞增多,细胞逐渐密集形成类胰岛样组织。诱导10dDTZ染色可见集落的边缘细胞被染成腥红色。诱导27dInsulin免疫荧光染色可见染色阳性细胞团簇。结论:采用昆明小鼠3.5d囊胚成功分离培养胚胎干细胞,并可以将胚胎干细胞诱导分化为胰岛素前体细胞。     

肝干细胞研究进展

198 1年英国的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡首次成功地分离了小鼠胚胎干细胞 ,从而在全球掀起了有关干细胞的研究热潮。 1998年 11月 ,美国Thomson和Gearhart分别用不同的方法获得人胚胎干细胞及胚胎生殖细胞 ,此后 ,干细胞的研究便进入了一个新的时代。所谓干细胞 (stemcell) ,是指那些处于分化过程之中 ,具有分裂增殖能力 ,可自我更新 ,有多向分化潜能即能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细胞。干细胞依其分化潜能的大小可分为 :①胚胎干细胞 (embryonicstemcell,ES细胞 ) ,即具有分化为机体任何一种组织器官潜能的细胞 ,如囊胚…     

昆明小鼠胚胎干细胞的分离培养方法

背景:目前已经建立了数百个小鼠的胚胎干细胞系,这些细胞系大多数来源于129,C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,而昆明株小鼠的胚胎干细胞建系的成功率很低.目的:探寻昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的方法,以期提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的成功率.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察性实验,于2006-04/2007-06在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚.方法:分别将昆明白小鼠3.5d和4d胚龄的囊胚培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,四五天后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,分别采用2.5g/L胰蛋白酶-0.4g/L乙二胺四乙酸与1g/L胰蛋白酶0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械离散胚胎干细胞集落.主要观察指标:观察集落的生长情况,通过碱性磷酸酶染色、OCT-4染色、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定.结果:[1]4d胚龄胚胎的贴壁率、内细胞团出现率及克隆形成率高于3.5d胚龄(P<0.05).[2]采用1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min并辅以机械作用,分离克隆胚胎干细胞效果较好.[3]胚胎干细胞呈集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性,悬浮培养胚胎干细胞能得到囊状胚体.结论:采用4d胚龄的囊胚和1g/L胰蛋白酶-0.2g/L乙二胺四乙酸室温作用2～4min,并辅以机械作用的消化方法,有助于提高昆明小鼠胚胎干细胞建株的能力.     

近交系小鼠体细胞核移植胚胎的构建和鉴定

背景：体细胞核移植技术己成功用于多种动物的克隆，但其过程中核移植技术的成功率较低。 目的：通过对卵母细胞不同去核方法的对比分析，观察其对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响，并利用微卫星DNA技术进行核移植囊胚鉴定，幸刀步建立小鼠体细胞核移植技术平台。 设计、时间及地点：以卵母细胞为观察对象的对比实验，于2005—09/2007-10在广西医科大学医学科学实验中心及动物实验中心完成。材料：选用C57BL／6小鼠卵母细胞为受体、BALB／c小鼠卵丘细胞为供体。取600枚受体卵母细胞，根据去核方法不同分为3组。每组200枚。 方法：①盲吸法：吸出卵母细胞第1极体及其附近的适量胞质。②蔗糖辅助去核法：以含蔗糖显微操作液预处理卵母细胞，吸出可见的细胞核等遗传物质。③荧光染色去核法：Hoechest33342预处理卵母细胞，在紫外光下用去除遗传物质。乙醇联合二甲氨基嘌呤进行重构胚激活，激活后卵裂培养基液滴中培养。根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物，提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB／c小鼠、受体C57BL／6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA，使用巢式聚合酶链反应扩增选定的序列。最终扩增出4个微卫星位点DNA片段，即D3Mit28，D11Mit258，D12Mit136及D14Mit50。主要观察指标：比较3种去核方法的去核率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数差异。对巢式聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。 结果：①盲吸去孩法的去核率、处理重构胚的体外发育能力均低于荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法（P〈0.05）。②荧光染包去核法的去核率高于蔗糖辅助去核法（P〈0.05），两组的囊胚率及囊胚细胞数差异均无显著性意义（P〉0.05）。③巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA。通过微卫星DNA序列的扩增，证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同，而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。 结论：荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法适用于小鼠核移植，可支持小鼠体细胞核移植胚胎的早期发育。微卫星分析证实体细胞核移植囊胚为供体BALB/c小鼠的克隆，微卫星DNA分析可用于小鼠体细胞核移植囊胚的鉴定。     

体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞最佳胚龄的筛选:孕2.5d与3.5d及4.5d比较

背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道.目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的最佳胚龄.方法:分别从孕2.5 d,3.5 d和4.5 d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色.结果与结论:孕2.5 d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚.孕2.5 d胚胎和孕3.5 d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P＞0.05);孕4.5 d胚胎上述指标均显著高丁二前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料.     

不同分化状态的供体细胞对小鼠克隆胚胎发育的影响

目的:探讨不同分化程度的供体细胞对克隆胚胎发育潜能的影响.方法:采用"一步法"核移植技术将供体细胞核直接注入小鼠卵母细胞,成功构建克隆胚胎.颗粒细胞克隆胚胎经含有10 mmol/L的SrCl2和5 ug/mLCB的培养液中激活处理5～6 h,R1胚胎干细胞克隆胚胎经含有10 mmol/L的SrCl2的培养液中激活处理3h,然后移入CZB培养液中继续培养.结果:颗粒细胞克隆胚胎体外的激活率、卵裂率和囊胚率与胚胎干细胞克隆胚相比具有显著差异,克隆胚胎体内移植后胚胎干细胞克隆胎儿出生率稍高(2.3%vs.1.2%),但没有显著差异.结论:供体细胞分化程度越低,克隆胚胎体内外发育潜能越高.     

重组人G-CSF对健康供者外周造血干／祖细胞动员和采集效果的影响因素分析

应用重组人粒系集落刺激因子（rhG—CSF）对健康供者进行动员并采集造血干细胞用于异基因外周血造血干细胞移植已在临床广泛应用，本研究通过对影响外周干细胞动员和采集效果的多因素分析，进一步探讨最佳动员方案及采集时机。采取回顾性方法分析了431例健康供者外周血干细胞动员采集效果，并进一步分析了供者一般特征、rhG—CSF动员天数、每日皮下注射次数、剂量与采集效果的关系。结果表明：rhG—CSF在动员中平均应用剂量为5．7μg／（kg·d），平均采集1．7次，收获单个核细胞数平均为9．57×10^8／kg，CD34^＋细胞平均为4．91×10^6／kg。绝大多数供者不良反应轻微。多因素分析结果显示，采集效率主要与供者体重指数，采集天数相关。rhG—CSF动员第5天采集的供者，其MNC数、CD34^＋细胞数及第一次单采成功率均优于其他时间采集的供者。同时，本组供者应用rhG—CSF剂量较小且剂量范围较窄，rhG—CSF剂量不如采集时间对采集物质量的影响明显。结论：小剂量应用rhG—CSF动员并于第5天开始采集是健康供者造血干细胞动员的较理想方案。     

治疗性克隆在组织工程方面的研究现状

临床上许多疾病由于细胞老化或受到病损，而引起正常的生理功能发生障碍或丧失，严重威胁着人类的生命和健康，如帕金森综合征、糖尿病、皮肤烧伤等。目前治疗这些疾病的方法主要采用细胞、组织和器官移植，然而，供体来源不足和免疫排斥反应一直成为器官移植方面的有待解决的两个根本性问题。治疗性克隆是生物学界在20世纪90年代末取得的两个重大突破一体细胞克隆技术及干细胞培养技术结合后产生的医学奇迹。它的目的就是产生个性化的，在基因组成上与患者相同的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)，然后诱导ES分化为特定类型的可供移植的细胞或组织，来修复患者已丧失功能的组织或器官，达到完全治愈。常用的方法是：①利用体细胞核移植技术获得重构胚。②分离培养胚胎干细胞。③定向诱导分化胚胎干细胞，获得特定类型细胞。④目的细胞的分离纯化。⑤利用组织工程学的方法，把目的细胞构建成组织和器官。着重介绍治疗性克隆研究现状及最新使用方法，并对面临的问题作了概括性讨论。     

胚胎干细胞治疗神经系统疾病的研究现状

胚胎干细胞是来源于胚胎囊胚阶段的内层细胞团，能分化成所有组织和细胞类型的全能细胞。胚胎干细胞经诱导后，可以分化成神经细胞前体，置换中枢神经系统疾病病损和功能障碍的细胞，以发挥其治疗作用。同时，胚胎干细胞也可以作为基因治疗的载体，使外源基因能在植入的胚胎干细胞表达，从而达到治疗的目的。胚胎干细胞在治疗中枢神经系统疾病中有巨大的应用前景。     

HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导

本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点，构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞，用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性，通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞，构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL，应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明：经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型，能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后，Western blot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论：次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。     

CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定

目的:构建CDHR2基因条件性敲除小鼠模型,为研究CDHR2基因的生物学功能提供条件。方法:构建CDHR2基因条件打靶载体,电转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用G418和GANC筛选阳性细胞克隆。胚胎注射阳性ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与Cre小鼠交配获得条件性敲除小鼠。分别通过PCR方法和免疫组织化学方法对CDHR2的敲除结果进行验证。结果:成功构建打靶载体,并获得6个正确同源重组的ES细胞阳性克隆。阳性ES细胞克隆注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得5只嵌合鼠。嵌合鼠再与Flp小鼠交配,获得6只阳性F1代去Neo小鼠。去Neo小鼠与Cre小鼠杂交,获得CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠。免疫组织化学检测表明,阳性小鼠肠道组织中的CDHR2基因被特异性敲除,而肾脏组织CDHR2基因的表达没有受到影响。结论:成功构建CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠,为进一步研究CDHR2基因的作用奠定了基础。     

人、鼠神经干细胞的生物特性比较

目的：比较分析体外人及小鼠神经干细胞原代培养的生长特性。方法：用无血清培养与单细胞克隆技术对人及鼠胚胎脑组织进行分离、培养。借用光镜、免疫组织化学对其鉴定，应用透射电镜对不同生长时期神经干细胞生物学特性进行观察。结果：人和鼠胚胎分离的细胞具有连续分化及克隆能力，克隆球与早期的原始细胞神经上皮干细胞蛋白(nestin)抗原呈阳性。诱导后成熟分化的细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经丝-200(NF-200)抗原呈阳性。小鼠神经干细胞电镜结果：1周时，细胞发育较为原始，核大胞质少，细胞器不发达，未观察到细胞突起及神经元与星形胶质细胞具备的特征。培养2周后，其电镜结果与1周结果无明显区别。继续培养到4周，见大部分细胞内出现空泡样变性，部分细胞表现出神经元及星形胶质细胞的一些特征。另外在克隆求内观察到类似细胞连接样结构。而人神经干细胞特性与小鼠神经干细胞相似，空泡样变性比小鼠神经干细胞更为明显。人与鼠神经干细胞经诱导分化10d后，见到典型的神经元及星形胶质细胞特征。结论：人及鼠神经干细胞具有很强的增殖能力，生物特性相似。