河南口岸截获未知蝇种细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因分析

目的应用DNA条形码技术对河南口岸截获的1只形态不完整的未知蝇类进行鉴定。方法利用以细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为目的基因的DNA条形码技术,对该未知蝇类基因组DNA进行扩增、序列比对和分析。结果通过DNA条形码鉴定和序列比对,该未知蝇类的DNA条形码序列与BOLD中绯颜裸金蝇的序列同源性高达100%,确认该蝇种为绯颜裸金蝇。结论 DNA条形码技术弥补了传统形态学鉴定的局限性,在国境口岸医学媒介生物鉴定中有广阔的应用前景。     

基于DNA条形码鉴定口岸截获鼠类

目的 利用基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因、线粒体控制区（D-loop）基因、16S rRNA基因的DNA条形码技术对广州口岸截获的1只死鼠进行种类鉴定。方法 从鼠肌肉中提取DNA,用PCR法扩增COⅠ、D-loop、16S rRNA基因片段,将测序结果与GenBank和BOLD systems v4中鼠类的DNA条形码进行比对,用Mega 6.0构建系统发育树,计算遗传距离。结果 该鼠类样本能扩增出COⅠ、D-loop、16S rRNA基因片段,通过COⅠ、16S rRNA基因扩增片段序列比对与德氏柔毛鼠Praomys daltoni同源性均为99%,D-loop基因扩增片段序列比对与猪吻柔毛鼠Praomys rostratus同源性为100%,结合形态学特征,最终鉴定为德氏柔毛鼠Praomys daltoni。结论 COⅠ、16S rRNA基因片段能够对鼠类进行有效鉴定,弥补了形态学鉴定的不足之处。     

DNA条形码技术在河北省鼠疫疫源地鼠种鉴定中的应用

目的以河北省鼠疫疫源地常见鼠为对象,探讨DNA条形码技术在鼠类鉴定方面的可行性。方法2012年在河北省鼠疫疫源地内采集鼠肝脏标本,并保存整只鼠,制作剥制标本,提取基因组DNA,用通用引物PCR法扩增线粒体COⅠ基因,并测序。将测序结果与GenBank中其他鼠类物种的DNA条形码进行BLAST比对,并构建分子进化树。结果87份样本均能通过PCR扩增出特异性COⅠ基因条带,其中85份样本所构建的分子进化树结果与形态学鉴定结果一致,2份样本结果有差异,经反复鉴定头骨及形态标本,发现为现场鉴定错误。结论DNA条形码技术能够对鼠类进行有效的物种鉴定,同时还可以探讨啮齿动物属、种分类单元的系统发育问题。     

三峡库区沿江口岸鼠类及其分子鉴定特征研究

目的以三峡库区沿江口岸捕获的鼠类为研究对象,应用DNA条形码技术进行鼠类鉴定,分析各种鼠类的分子鉴定特征。方法在三峡库区沿江口岸采集鼠类标本,并保存整只鼠体,制作标本用于形态学鉴定,采集肝脏或肌肉组织,提取DNA,采用通用引物PCR法扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,并测序。将测序结果与Gen Bank中其他鼠类的DNA条码进行Blast比对,并构建分子进化树。结果共捕获4种61只鼠类,其中42份样本通过PCR扩增获得特异性COⅠ基因条带,所构建的分子进化树结果与形态学鉴定结果一致,但不同口岸鼠类在分子进化水平存在一定差异。结论分子鉴定技术能够应用于对三峡库区口岸鼠类进行有效的物种鉴定。     

DNA条形码技术在兰州中川机场鼠类鉴定中的应用

目的调查兰州中川机场及其附近地区鼠类的组成,并利用DNA条形码技术对鼠种进行鉴定。方法 2015年1月—2017年7月,在中川机场及其附近地区采用笼夜法采集鼠类,提取鼠肾DNA,用PCR方法扩增线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因并测序,测序结果在DNA条形码专用数据库BOLD中进行比对,确定鼠种。利用Mega 6.0构建分子进化树。对于形态学和COⅠ基因鉴定结果不一致的样本,进一步通过细胞色素b(Cytb)基因进行分子鉴定。结果 118份样品均能扩增出特异性COⅠ基因片段,115份样本的分子鉴定结果与形态学结果基本一致,3份样本形态学鉴定结果与分子鉴定有差异,经Cytb基因序列比对及形态学反复鉴定,确定初步形态学鉴定结果有误,采用分子鉴定结果。结论 DNA条形码技术可以对鼠类进行有效鉴定,是对形态学鉴定的有力补充,为口岸病媒生物的快速识别和鉴定提供了科学依据。     

DNA条形码技术在河北省坝上地区夜行鼠鉴定中的应用

目的以河北省坝上地区捕获的夜行鼠为对象,应用DNA条形码技术进行鼠类鉴定。方法在河北省坝上地区采集鼠肝脏标本,并保存整只鼠,制作标本,提取DNA,采用通用引物PCR法扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,并测序。将测序结果与Gen Bank中其他鼠类的DNA条码进行Blast比对,并构建分子进化树。结果 36份样本均能通过PCR扩增出特异性COⅠ基因条带,所构建的分子进化树结果与形态学鉴定结果有所不同,经头骨鉴定,进化树结果正确无误,更正形态学鉴定结果。其中2只夜行鼠未能在Gen Bank中找到同源性较高的鼠类基因,且头骨受到严重损坏,暂无法确定鼠种。结论 DNA条形码技术能够对鼠类进行有效的物种鉴定。     

DNA条形码技术在福建省蝇类鉴定中的应用

目的探讨DNA条形码技术应用于福建省蝇类鉴定的可行性,并初步建立福建省蝇类的基因数据库。方法采集自福建省部分地区的4科13属19种64个蝇类新鲜标本,提取基因组DNA进行PCR扩增,序列测序,并进行同源性对比、进化距离分析,构建系统进化树。结果基因序列分析结果显示,上述蝇类mt DNA上细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列的种内进化分歧均数在0～3.32%之间;除铜绿蝇与丝光绿蝇进化分歧均数为0.69%外,其余种间进化分歧均数在5.26%～18.30%之间;系统进化树分析显示,相同种能够很好聚集在一起,Bootstrap检验可信度均达96%以上。结论DNA条形码技术可用于福建省一些常见蝇类的鉴定,作为形态学鉴定的补充手段。     

DNA条形码技术在鉴定绥芬河口岸日本血蜱和嗜群血蜱中的应用

目的建立用DNA条码技术对绥芬河口岸两种形态学特征非常相近的嗜群血蜱和日本血蜱的鉴定方法,探讨DNA条形码在蜱类鉴定中的实用性。方法在黑龙江绥芬河口岸采集游离血蜱103只,形态学鉴定完毕后,提取蜱样本基因组DNA,采用PCR方法从2种血蜱基因组中扩增线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,测序后进行同源性分析,用Mega6.0软件构建系统发生树并进行系统进化分析。结果经形态学鉴定嗜群血蜱89只,日本血蜱14只;2种血蜱COⅠ基因之间的同源性为87.5%,嗜群血蜱与GenBank中编号KR108867.1公布的嗜群血蜱CO Ⅰ序列相似性为99.8%;日本血蜱与GenBank中编号KR108879.1公布的日本血蜱CO Ⅰ序列相似性为99.8%,与形态学鉴定结果一致。结论对于形态学特征相近蜱种的鉴定,在传统形态学分类的基础上结合DNA条码技术鉴定方法能更准确地鉴定蜱的种类,也能更好地了解其进化关系,为蜱传播疾病的预防控制提供依据。     

利用DNA条形码技术鉴定陕西口岸输入性鼠类

目的利用DNA条形码技术鉴定在入境航空器中截获的1只鼠类。方法提取截获鼠类的肝脏DNA,通过PCR方法扩增细胞色素C氧化酶亚基I(cytochromecoxidase I,CO I)基因并测序。将测序结果进行比对分析,从而鉴定物种。结果成功扩增到该鼠类样本的CO I基因,通过序列对比和系统进化分析,显示该鼠序列与黄胸鼠同源性为100%,鉴定为黄胸鼠。结论 DNA条形码技术在啮齿动物鉴定中应用良好,是一种简单、快速、高效的鼠类鉴定方法 。     

国内未见分布蝇种:澳洲麻蝇的形态和DNA条形码鉴定

目的 应用DNA条形码与形态分类相结合的方法,快速、准确鉴定在中山口岸入境船舶截获的1只蝇类.方法 2014年4月30日中山出入境检验检疫局神湾办事处从澳大利亚入境载有鲜葡萄的货船上截获1只蝇类,做成针插标本,并拍照存档.进行形态学鉴定,然后取1条后足提取基因组DNA,采用动物DNA条形码的通用引物(LCO1490和HCO2198)扩增目的片段,并进行纯化、克隆测序和序列分析,与NCBI及BOLD中的序列进行比对,构建NJ树.结果 形态学鉴定截获蝇类为雌性麻蝇科种类,由于缺少关于雌性麻蝇鉴定特征描述的参考资料,无法将该蝇鉴定到种,所获得的DNA条形码序列与BOLD中的澳洲麻蝇[Sarcophaga australis (Johnston et Tiegs,1921)]的序列相似度达100％.经过科技查新,确认是中国未见分布种.结论 根据鉴定结果,判定所截获的蝇类为雌性澳洲麻蝇,是我国首次截获.应用DNA条形码与形态鉴定相结合可以准确快速鉴定雌性麻蝇种类.     

三峡库区沿江口岸主要蚊类分子特征分析

目的对三峡库区沿江口岸的主要蚊类进行分子鉴定,分析各种蚊类的分子特征。方法用二氧化碳诱蚊灯在三峡库区沿江5个口岸采集成蚊,形态学鉴定之后,再提取DNA,扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因并测序。将测序结果与GenBank中其他蚊类的DNA序列比对,并构建系统进化树。结果在宜昌、万州、涪陵、寸滩和泸州捕获三带喙库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊共5个蚊种3 000余只,选取其中42只扩增COⅠ基因,获得5个蚊种的COⅠ基因序列,长度为658 bp,A+T含量为67.47%~69.71%。同源性比较表明,同一蚊种间核苷酸遗传距离小于0.0215,不同蚊种间遗传距离为0.0742~0.1594。COⅠ基因核苷酸系统进化关系显示,三带喙库蚊、致倦库蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊和白纹伊蚊均聚集成簇,与形态学鉴定结果相一致。结论应用分子鉴定技术对三峡库区口岸蚊类进行鉴定,可为国境口岸蚊类鉴定提供溯源依据。     

应用DNA条形码技术鉴定未知双翅目蛹

目的建立应用DNA条形码技术鉴定未知病媒种类的方法,尤其是非成虫态虫体或者肢体残缺个体的DNA条形码鉴定的方法和技术,以缩短鉴定周期。方法提取从英国进口废纸中截获的双翅目单只蛹基因组DNA,利用多细胞无脊椎动物线粒体细胞色素氧化酶I(COI)的通用引物进行DNA扩增。PCR产物直接从两端测序,测序引物同扩增引物,序列经拼接后得到清晰可读的709bp COI基因片段碱基序列。同时将截获的同批蛹的其他个体在实验室内孵化成成虫进行形态学鉴定,并抽提孵化的成虫的基因组DNA,扩增其COI基因片段,测序并与蛹的序列进行比较。与GenBank中的序列进行同源性比对,并用Clustal W2在线建立AD系统发育树。结果未知种类的蛹和Genbank中红头丽蝇Calliphora vicina的COI DNA序列(包括引物序列)99.4%相同。蛹化成虫形态鉴定为红头丽蝇,孵化后的成虫的DNA条形码数据与蛹的数据完全相符。结论根据结果可以判断所截获的未知种类的蛹为红头丽蝇Calliphora vicina。本文的研究证明了DNA条形码技术是一种快捷准确的种类鉴定方法,尤其是运用在非成虫态的种类鉴定上。     

广东省青毛鼠的DNA条形码鉴定

目的利用DNA条形码技术对未知鼠种样本进行种类鉴定。方法以2016年在广东省阳春市捕获的2只鼠样本为研究对象,提取其基因组DNA,采用通用引物Bat L5310和R6036R扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因片段并进行测序,将测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中进行BLAST比对,采用邻接法构建分子系统发育树,基于双参数模型计算遗传距离。结果 2只鼠样本的DNA条形码序列一致,为同一种鼠,与NCBI中青毛鼠的序列相似度高达99%,且与青毛鼠(JN105108.1)的遗传距离为0.004 6,低于种内遗传距离1%的阈值,因此确认未知鼠为青毛鼠。结论 DNA条形码技术是一种高效、快捷的鼠类鉴定方法,可弥补形态学鉴定缺陷。     

成都机场口岸常见媒介蝇类的分子鉴定

目的:建立以线粒体COI基因作为分子标记的蝇类分子鉴定方法。方法:设计COI基因引物对成都双流机场口岸常见4科10属14种卫生蝇类进行PCR扩增和序列测定,并与不同地区蝇类的COI基因片段比较,分析其碱基差异和系统发育关系。结果:部分不同地理来源的种类种内碱基差异变化较大,中国四川与马来西亚棕尾别麻蝇碱基差异为3.4%,中国四川与中国广东巴浦绿蝇碱基差异为3.3%;其他种类种内碱基差异较小(<1.0%)。系统发育分析显示所有种类的COI基因分子鉴定结果和形态学结果相一致。麻蝇科种类聚为一个分支,而丽蝇科、花蝇科和蝇科种类没有聚集形成单系。结论:可以将COI基因片段作为分子标记,建立一种适用于口岸的蝇类种类之间分子鉴定方法。     

新疆边境地区伊宁县图兰扇头蜱形态学及分子生物学鉴定

目的 对新疆边境地区伊宁县图兰扇头蜱进行形态学和分子生物学鉴定.方法 在新疆边境地区的伊宁县随机采集畜牧体表寄生蜱324只,进行形态学初步筛选,从中选取6只形态差异较大的图兰扇头蜱,进行线粒体16S rRNA和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (CO Ⅰ)基因序列扩增、测序,并与GenBank登录的图兰扇头蜱参考序列进行遗传进化分析.结果 形态学鉴定采集的伊宁县蜱类皆为图兰扇头蜱,两段序列的碱基组成均显示较高的A+T比例(16SrRNA基因为73.8％,CO Ⅰ基因为70.34％),在变异程度上16S rRNA基因较CO Ⅰ基因明显保守.结论 首次应用形态学、16S rRNA和CO Ⅰ基因测序分析表明新疆伊宁县采集蜱皆为图兰扇头蜱,并证明图兰扇头蜱具有生物多样性.     

应用DNA条形码技术鉴定舟山群岛地区蝙蝠种类

目的探索DNA条形码技术在蝙蝠种类鉴定中的应用。方法本研究以舟山群岛地区3种常见蝙蝠标本为研究对象,提取基因组DNA,扩增CytB基因片段并测序,将测序结果进行BLAST比对分析;基于Kimura双参数模型计算22只蝙蝠CytB序列的种内种间遗传距离。结果遗传进化分析显示种间遗传距离显著大于种内遗传距离,通过NJ法构建系统发育树聚类分析,不同种类的蝙蝠位于不同的分支,同属的蝙蝠分支较不同属的蝙蝠分支较短,种内分支则更短,上述结果都与形态学鉴定结果一致。结论该研究建立的DNA条形码技术对于本研究中所涉及的蝙蝠种类具有较好的区分效果,可以作为一种有效的工具在蝙蝠鉴定中进行应用。     

DNA条形码技术应用于口岸吸血蠓类快速分子鉴定的研究

目的建立口岸吸血蠓类快速分子鉴定方法,提高鉴定效率和准确率。方法选择口岸区域采集点,采集吸血蠓类。经形态学鉴定后,单只蠓提取基因组DNA,采用自行设计的COI基因扩增引物进行扩增。PCR产物经电泳鉴定后,进行双向测序。序列经分析后,去除引物序列和不稳定序列,进行拼接。提交至NCBI和BOLD数据库进行比对,并建立系统进化树进行验证。结果得到12个新序列,已登录至GenBank,登录号为KF528689~KF528700。其中台湾蠛蠓的COI序列(683 bp)填补了NCBI数据库的空白。所得序列经分析后可以将多种蠛蠓、库蠓很好地区分开。结论本项目所建立的基于吸血蠓类COI基因的DNA条形码快速分子鉴定方法可以很好地鉴定各吸血蠓种,值得进一步推广应用。     

DNA条形码技术在贵州茂兰鼠类鉴定中的应用

目的探讨基于线粒体COI基因的DNA条形码技术对鼠类进行准确的鉴定。方法以贵州茂兰地区的3个常见鼠种21个鼠类标本为研究对象,提取基因组DNA,扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因片段并测序,将测序结果进行BLAST比对,基于双参数模型计算鼠种种间和种内遗传距离,构建分子发育系统。结果 DNA条形码检测技术可用于该地区鼠种的鉴定,并能纠正现场形态学鉴定的失误。结论研究结果表明DNA条形码技术是一种有效可靠、易于操作的鼠类鉴定方法,能纠正形态学鉴定中的错误。     

DNA条形码技术用于原木携带蚊种的鉴定

目的对临沂口岸进境原木上截获的蚊种进行DNA条形码研究确定蚊种。方法使用双翅目COI基因国际通用引物对原木携带蚊种COI基因进行PCR扩增和序列测定,序列在NCBI网站上进行Blast,确定蚊种。结果待测蚊种COI序列与GenBank中编号为HQ398903.1的骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)序列相似性为99%。结论基于COI基因的DNA条形码技术可成功地对媒介蚊类进行分类鉴定,该技术可弥补蚊虫形态缺失和形态学鉴定知识不足对蚊类鉴定的影响。     

上海浦东机场口岸媒介新病原菌的分离鉴定

目的对上海浦东机场蝇类携带新病原菌进行分离鉴定。方法将上海浦东机场口岸捕获的蝇体细菌分离培养至单克隆,使用Vitek2 Compact进行初步鉴定,扩增16S rRNA基因,进行序列比对。使用Mega5,Neighbour-joining方法,构建分子系统发育树。结果从大头金蝇体表分离出一株菌,疑似造成暴发性脓毒症的污蝇解壳杆菌（Wohlfahrtiimonas chitiniclastica）。进化树分析表明为同种菌,16S rRNA相似性为98.66%。结论从大头金蝇体表成功分离到W.chitiniclastica菌的新记录。