小鼠牙本质涎磷蛋白成熟蛋白编码区cDNA克隆与部分序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白（ｄｅｎｔｉｎ ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰＰ）成熟蛋白编码区基因。方法 用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰＰ成熟区的基因片段（约３ｋｂｐ）,将所５得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ     

小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白（ＤＳＰ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰ成熟区的基因片段（约１．４ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ＤＳＰ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠ＤＳＰ成熟肽编码区基因,正在进行该基因的表达和活性鉴定。     

人牙本质磷蛋白基因全序列的亚克隆及其5''''端序列的克隆和分析

目的:本研究旨在鉴定质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列;建立带有人DPP基因的稳定克隆株;构建人DPP基因5'端序列重组质粒,为表达纯化人DPP蛋白及其5'端序列提供可参考的数据.方法:用限制性内切酶分析并进行DNA序列测定质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列;以质粒pBlueBacHis2-DPP为模板,构建人DPP基因5'端序列重组质粒,并用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.5分析预测人DPP蛋白N端序列.结果和结论:质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列与基因文库上的人DPP基因序列相符合,建立带有人DPP基因的稳定克隆株pBV222-DPP;蛋白序列分析软件包分析预测人DPP蛋白N端序列氨基酸组成特点与人DPP全序列一致,体外即将表达的蛋白可能具有人DPP生物学功能的重组蛋白.     

小鼠牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的克隆和序列测定

目的　克隆并测定小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因上游启动子的序列。方法　提取成年Balb/c鼠基因 组DNA,设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)得到小鼠牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的序列。再将目的片段定向 连入T载体,酶切鉴定并测序。结果　将小鼠牙本质涎磷蛋白基因上游启动子序列分3段克隆,分别得到997 bp、 1 004 bp及674 bp大小的目的片段。连入载体后,酶切结果测定重组质粒成功。其测序结果与小鼠基因组染色体 位置5q21处的相应序列99%一致。结论　成功克隆到牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的序列,为进一步研究 DSPP基因的转录调控机制奠定了基础。     

小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)特异性启动子的克隆和序列分析

目的 :获得小鼠牙本质涎磷蛋白 (DSPP)编码序列上游约 1.6kb的特异性启动子。方法 :按Mac Dougall报道设计一对引物 ,提取小鼠胚胎干细胞基因组DNA作为模板 ,PCR获得大小约为 1.6kb的DNA片段 ,将该片段克隆并进行序列分析。结果 :所得到的片段是DSPP的特异性启动子 ,其序列与文献报道有一定差异 ,但转录因子的结合位点均未发生突变。结论 :成功获得小鼠DSPP的特异性启动子 ,为进一步的研究打下基础。     

小鼠牙胚、软骨组织中牙本质涎磷蛋白基因的克隆

目的：从小鼠牙胚、软骨组织中克隆牙本质涎磷蛋白基因（dentin sialophosphoprotein,DSPP)。方法：采用RT-PCR方法,从小鼠牙胚及软骨组织中克隆DSPP基因片段,将所得片段装入载体pGEM-TEasyVector进行序列测定。结果：从两种组织中均获得719bp的特异性片段,序列分析表明,与已发表的DSPP序列99.7%同源。结论：成功地从小鼠牙胚。软骨中克隆到DSPP基因部分序列。结果提示：除牙齿组织外,DSPP还可在软骨中表达,它可能并非是检测成牙本质细胞的特异性指标。     

牙本质磷蛋白基因突变和序列多态性分析

目的：检测牙本质磷蛋白基因在牙本质发育不全Ⅱ型患者中是否存在突变，并对其序列多态性进行分析。方法：采用PCR方法扩增牙本质磷蛋白基因编码区，通过DNA直接测序方法对其核苷酸序列进行分析。结果：在牙本质磷蛋白基因序列中未发现与疾病相关的特异性改变，但检测到该基因的核苷酸序列在不同个体间具有多态性，存在部分核苷酸的缺失以及广泛的单核苷酸多态现象。结论：牙本质磷蛋白基因在牙本质发育不全Ⅱ型患者中不存在突变，但牙本质磷蛋白基因序列具有多态性。     

小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子的克隆与序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)基因启动子片段。方法 培养MDPC一23细胞，从培养的细胞中提取基因组DNA，利用设计的上下游引物，进行PCR反应。将扩增得到的DSPP基因启动子片段克隆到pMD18-T栽体，酶切鉴定后，进一步进行DNA序列测定。结果 酶切结果表明成功构建重组质粒，序列分析结果与国外报道一致。结论 成功克隆获得小鼠DSPP基因的启动子片段。     

人牙本质基质蛋白1 cDNA序列的克隆

目的：克隆人牙本质基质蛋白１（ＤＭＰ１）成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙乳头ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出人ＤＭＰ１成熟区的基因片段（约１．８ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人ＤＭＰ１成熟肽编码区基因片段。     

牙本质涎磷蛋白在小鼠体外培养软骨细胞中的表达

目的:探讨牙本质涎磷蛋白(DentinSialophosphoprotein ,DSPP)在体外培养的软骨细胞中的表达。方法:采用免疫组化方法,检测培养的第3代小鼠鼻软骨细胞中DSPP的表达。结果:培养细胞胞浆呈阳性着色。结论:DSPP可在体外培养的软骨细胞中表达。     

人牙本质磷蛋白功能片段的真核表达

目的本研究旨在利用分子生物学技术真核表达包含功能区的人DPP片段。方法构建了人DPP蛋白5’端基因片段的杆状病毒表达质粒pFastBacHb—hDPP—N，经BH10BAC转座反应后感染昆虫细胞sf9，进行重组蛋白的表达。结果经2～3代后，重组病毒产生明显的CPE，人DSPP蛋白特异性多克隆抗体Western blot鉴定，结果显示重组病毒感染3代毒sf9细胞的裂解物中在约17KD位置上出现了特异性的反应条带。结论表明杆状病毒系统可表达人DPP基因片段。为进一步通过对人DPP功能片段的研究揭示DPP在牙齿发育和牙髓修复中的作用及其机制奠定基础。     

人牙本质磷蛋白功能片段的原核表达

目的本研究旨在利用分子生物学技术原核表达包含功能区的人DPP片段.方法首先构建带有人DPP基因5'端序列的GST融合蛋白表达质粒.经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳.结果人牙本质磷蛋白基因5'端序列可在原核表达系统中进行不溶性表达,表达的融合蛋白分子量约为43KDa,进行初步纯化后,经SDS-PAGE证实,在预期位置出现了纯化蛋白条带.结论利用GST融合蛋白表达系统表达了人DPP功能片段.为进一步通过对人DPP功能片段的研究揭示DPP在牙齿发育和牙髓修复中的作用及其机制奠定基础.     

牙本质磷蛋白mRNA原位杂交方法的建立

目的:建立检测牙本质磷蛋白(DPP)mRNA表达的原位杂交方法。方法:选用发育各阶段的牙胚、牙齿和体外培养的MDPC-23成牙本质细胞为对象,采用地高辛标记的寡核苷酸探针的原位杂交方法。结果:DPP mRNA在牙胚与牙齿中的成牙本质细胞、前成釉细胞和体外培养的成牙本质细胞存在阳性表达。结论:设计的探针敏感性高,特异性高,所建立的原位杂交方法是研究牙本质发育和损伤修复的良好方法。     

小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA序列的克隆

目的：克隆小鼠成釉蛋白（ＡＭＢＮ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠成釉蛋白成熟区的基因片段（约１．１ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＴＺ１８质粒载体,转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＴＺ－ＡＭＢＮ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠成釉蛋白成熟肽编码区基因     

小鼠核心结合因子1成熟肽编码区的cDNA克隆和序列测定

目的：研究核心结合因子1（cbfal)在小鼠牙胚组织中的表达，扩增cbfal成熟肽编码区的特异性片段，构建重组质粒，为进一步的蛋白表达、抗体制备、基因转染等研究奠定基础。方法：提取新生小鼠的颅骨、牙胚、肝脏组织总RNA，反转录为cDNA后进行PCR反应，构建pGEM-cbfal重组质粒并测序。结果：从小鼠颅骨和牙胚组织中均获得了约1791bp的目的片段，牙胚来源的PCR产物的测序结果证实成功地克隆到了cbfal成熟肽编码区，酶切结果显示重组质粒构建成功。结论：新生小鼠的牙胚组织中有cbfal基因的表达。     

牙胚中上游刺激因子部分序列的cDNA克隆

目的：克隆牙胚中上游刺激因子（upstream stimulatory factor,USF)基因编码区特异片段。方法：从生后5d balb/c鼠牙胚中抽提总RNA，用随机引物逆转录合成cDNA，然后 用PCR方法借助特异性引物以cDNA中扩增小鼠USF1基因片段（289bp），电泳检测、回收目的片段，将所得的基因片段连接至Teasy质粒载体，并转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆，扩大培养，提取重组质粒DNA，酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱显示质粒重组，克隆成功，序列分析结果与国外报道一致。结论：在牙胚中克隆到USF1基因片段。