中国仓鼠卵巢上皮细胞PKCμ亚型的克隆与表达

【目的】研究中国仓鼠卵巢上皮细胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO cell)是否表达蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)μ亚型。【方法】参照GeneBank数据库PKCμ亚型的cDNA序列;通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW,选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCμ亚型的特异引物;RT-PCR扩增CHO细胞PKCμ亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCμ连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKCμ亚型。【结果】运用RT-PCR和Western blot-ting技术证实CHO细胞表达PKCμ亚型,并经测序证实。【结论】CHO细胞中发现PKCμ亚型的存在,为深入研究PKCμ亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础。     

VEGF-C真核表达载体的构建及蛋白表达

目的构建人血管内皮生长因子(VEGF-C)编码序列基因真核表达载体,为探讨VEGF-C的生物学功能奠定基础.方法根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从肿瘤细胞株cDNA中扩增出人VEGF-C编码序列基因片段,测序正确后用限制性内切酶将目的片段插入PcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中.采用酶切和PCR鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达.结论经RT-PCR扩增转染细胞cDNA和Western blotting检测证实重组质粒pcDNA3.1-VEGF-C能在宿主细胞中高效表达.     

凋亡抑制蛋白Livin两种异构体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-Livin α和pcDNA3.1-Livin β.方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将Livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livin).电穿孔法获得稳定表达Livin α和β的A549细胞克隆,Western blot验证Livin蛋白在转染细胞中的表达情况.结果成功获得Livinα和Livin β全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达Livinα和β.结论Livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究Livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达.方法 从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24 000处有一显色条带.结果 FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础.     

PKCα反义核酸对肺癌A549 细胞增殖的影响

目的 探讨聚乙烯亚胺(PEI)介导的人蛋白激酶Cα(PKCα)基因反义寡核苷酸(ASODN)对人肺癌A549细胞生长增殖及PKCα基因表达的影响.方法 以PEI介导PKCα ASODN,随机寡核苷酸(RODN)分别转染A549细胞,采用WST法和克隆形成抑制实验分析细胞生长增殖抑制效果;RT-PCR检测PKcd mRNA的表达水平;Western blotting检测PKCα蛋白的表达水平.结果 PEI介导的PKCaASODN转染A549细胞后,细胞牛长增殖和克隆形成均受到抑制(P<0.05),并呈浓度依赖关系,其抑制率明显高于PEI或PEI介导的RODN组;RT-PCR和Westernblotting结果均表明:PEI 介导的PKCαASODN转染A549细胞能明显抑制PKCα的表达,与空白对照组、PEI或PEI介导的RODN转染组相比,有统计学差异(P<0.05).结论 PEI介导的PKCα反义核酸能下调PKCα基因的表达,显著抑制A549细胞生长和增殖.     

RegIα cDNA过表达质粒的构建及对胃癌细胞增殖凋亡的影响

目的:构建再生蛋白Iα(regeneration gene Iα,RegIα)的cDNA过表达质粒表达载体,在体外评价其对胃癌细胞株增殖及其凋亡的影响.方法:根据RegIα cDNA的全序列设计引物,用RT-PCR的方法从胃黏膜组织的总RNA中获取RegIα的cDNA编码区域的全序列,经测序其与目的基因序列一致.将获取的RegIα序列经TA克隆和亚克隆至pIRES2-EGFP真核表达质粒载体中;将构建的RegIα过表达质粒载体pIRES2-RegIα-EGFP转染胃癌细胞株MKN28,并用空载体pIRES2-EGFP作为对照,利用G418筛选稳定表达pIRES2-RegIα-EGFP的MKN28细胞株.通过RT-PCR及Western blot检测转染后细胞RegIα在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法和流式细胞仪分别检测RegIα过表达后MKN28细胞增殖及拮抗H2O2诱导凋亡的变化.结果:成功构建RegIα cDNA的全序列表达质粒.RT-PCR及Western blot检测显示:转染pIRES2-EGFP质粒的MKN28细胞RegIα mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05);MTT试验显示:转染后细胞增殖能力明显升高(P<0.05),而且拮抗H2O2凋亡的能力增强(P<0.05).结论:RegIα的过表达能明显增强胃癌细胞MKN28的增殖和拮抗H2O2诱导凋亡的能力.     

人脑组织中STUB1基因的克隆构建及表达

目的 构建人STUB1基因全长cDNA的真核表达载体DNA3.1-STUB1.观察STUB1基因在人脑胶质瘤细胞(U251细胞)中的表达.方法 RT-PCR技术扩增获得人脑组织STUB1基因全长cDNA,将扩增的产物进行TA克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将STUB1基因酶切后构成pcDNA3.1-STUB1的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入U251胶质瘤细胞系,48h以后通过Western blotting实验观察重组质粒的表达情况.结果 RT-PCR扩增获得人脑组织中STUB1 cDNA全长912bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-STUB1,经DNA测序与GenBank中的人STUB1 cDNA序列一致.经neomycin(neo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株后,经过Western blotting显示转染重组质粒的细胞中有高水平的STUB1基因表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-STUB1真核表达质粒,并发现其在U251细胞中过量表达,为进一步研究STUB1基因在胶质瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

KBV2000细胞多药耐药蛋白激酶C亚型表达的关系

目的 探讨蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC）亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的关系。方法 （1）用Western blotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布；（2）流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果 （1）PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高，而PKCβ、ε无显著变化，PKCγ、ζ则未测出表达；（2）流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高，PKCβ、ε则无显著差别。结论 PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中，PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

人白细胞介素16的基因克隆及其表达载体的构建

目的通过从人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆编码人IL-16的cDNA基因,构建人IL-16的原核高效表达系统。方法从组胺刺激的正常人外周血单个核细胞中分离总RNA,利用半巢式RT-PCR、T-A克隆等技术得到特异的cDNA片段;将含有IL-16 cDNA的质粒IL-16-PUC18和原核表达载体PMAL-C2经酶切、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作,获得重组质粒PMAI-C2-IL-16,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达工程菌,Westem blotting检测表达产物。结果经序列测定证实,所得片段为IL-16cDNA;Western blotting检测重组体中确有抗IL-16抗体的融合蛋白表达。结论成功克隆了中国人IL-16 cDNA,并表达了IL-16融合蛋白。     

小鼠烟酰胺N-甲基转移酶基因的克隆及其表达

目的 克隆和表达小鼠烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)基因.方法 设计特异引物,利用逆转录PCR克隆小鼠NNMT编码cDNA序列,并进行序列测定;然后通过PCR扩增,双酶切回收cDNA片段定向重组到载体pEGFP-N3中,采用PCR和酶切鉴定重组表达质粒;最后将其转染到真核细胞中,通过Western杂交检测其表达,用激光共聚焦显微镜检测其细胞分布.结果经RT-PCR获得了小鼠NNMT的编码cDNA序列,经测序证实克隆序列完全正确;PCR和酶切鉴定表明绿色荧光蛋白(GFP)标记的NNMT表达质粒pNNMT-GFP成功构建;转染至HEK293T细胞中,Western杂交检测到绿色荧光蛋白融合的NNMT特异表达,显微观察表明NNMT分布在细胞质中.结论成功构建了NNMT的表达质粒,并在小鼠中实现其表达.     

VEGF—C真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达栽体，检测其在真核细胞CHO中的表达。方法：根据人VEGF—C cDNA的序列，设计合成一对特异性引物，用RT—PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF—C基因的cDNA，回收PCR产物连接于克隆载体。扩增，质粒提取，酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF—C cDNA全长的基因片段，与真核表达栽体pcDNA3．1(-)连接重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3．1(-)，VEGF-C转染至CHO细胞中，G418加压筛选培养。最后用Westerm—blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白。结果：基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长。重组peDNA3．1(-)中含 有VEGF—C cDNA全长序列，Westem—blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。     

骨形态发生蛋白基因真核表达质粒的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

【目的】克隆人骨形态发生蛋白(BMP4)基因,构建真核表达质粒,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达,为进一步研究以BMP4进行骨修复的基因治疗奠定基础。【方法】采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,从人的松质骨中扩增BMP4的环形脱氧核糖核酸(cDNA),插入pGEM-Teasy载体,测序证实后,将其亚克隆至质粒PCDNA3.1B(-)中构建BMP4真核表达载体;采用脂质体将重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,以RT-PCR和免疫组织化学方法鉴定转染细胞中BMP4基因的表达。【结果】经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,RT-PCR和免疫组化方法证明转基因CHO细胞克隆中存在人BMP4基因。【结论】成功获得了人BMP4的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的表达分析

目的 研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)基因随盐藻的生长表达变化情况及真核表达.方法 利用实时荧光定量PCR检测盐藻中MBP基因的表达变化,构建MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列的含有组氨酸标签的真核表达载体,转染CHO细胞,筛选稳定转染株,Western blotting检测融合蛋白表达情况.结果 盐藻的MBP基因表达随生长周期变化,MBP及其N端和C端的融合蛋白成功在CHO细胞表达.结论 MBP可能参与盐藻增殖过程中RNA的加工,并为下一步分离真核表达的MBP,研究其功能提供了实验基础.     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

Hsp90α基因RNAi的载体构建研究

目的:构建Hsp90α(Heat shock protein 90 alpha)siRNA(Small interfencing RNA)表达载体,为后续的功能研究提供平台.方法:根据Hsp90α基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列到空载体Psuper EGFPI中,转化TOP10菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析.将三条序列和对照序列的质粒分别转染HUK293细胞,提取总RNA,用RT-PCR检测Hsp90 α mRNA的量.结果:经酶切鉴定、电泳证明,含作用序列的重组质粒pSuper-Hsp90 α1,pSuper-Hsp90 α2,及pSuper-Hsp90α3构建是成功的,重组质粒pSuper-Hsp90α 1,pSuper-Hsp90α2测序分析完全正确.用RT-PCR初步证明三条均有干扰效果,pSuper-Hsp90α1最明显.结论:用于Hsp90α RNAi的重组质粒可于体外成功构建,初步确定pSuper-Hsp90α1为最佳作用靶点.     

小鼠HuR真核表达载体构建及对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建小鼠同源的人抗原R (HuR)基因真核表达载体,观察HuR过表达对Lewis肺癌(LLC)细胞增殖和侵袭的影响.方法 从LLC细胞中抽提总RNA,RT-PCR扩增HuR cDNA,基因工程方法将PCR片断克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点.重组质粒经EcoRI和SmaI双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamineTM2000转染LLC细胞.Western blotting检测HuR在细胞中的表达.MTT和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力.结果 经酶切、测序鉴定,小鼠HuR基因正确插入到pEGFP-N1的多克隆位点,获得pEGFP-HuR;Western blotting显示转染组与未转染组比较,HuR蛋白表达、LLC细胞增殖能力和侵袭能力均显著增强.结论 HuR过表达可提高肿瘤细胞的增殖和侵袭能力.     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

【目的】研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKCα、PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB／c的表达情况。【方法】ES-BALB／c细胞株用普通ES细胞培养液培养，分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿，培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。【结果】免疫组化发现PKCα。在ES-BALB／c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达，以细胞浆和细胞核最甚，而PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε4种亚型无明显表达；Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带，分子质量约为84ku，而PKCβ、PKCγ，PKCδ和PKCε 4种亚型无蛋白印迹条带。【结论】PKCα在ES细胞阶段即有表达，在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用，而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。