中国仓鼠卵巢上皮细胞PKCμ亚型的克隆与表达

【目的】研究中国仓鼠卵巢上皮细胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO cell)是否表达蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)μ亚型。【方法】参照GeneBank数据库PKCμ亚型的cDNA序列;通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW,选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCμ亚型的特异引物;RT-PCR扩增CHO细胞PKCμ亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCμ连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKCμ亚型。【结果】运用RT-PCR和Western blot-ting技术证实CHO细胞表达PKCμ亚型,并经测序证实。【结论】CHO细胞中发现PKCμ亚型的存在,为深入研究PKCμ亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础。     

人突变CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

①目的构建人突变CD59的真核表达系统，并筛选高表达细胞。②方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染人中国仓鼠卵巢（CHO）细胞；G418筛选出阳性克隆，流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、Western-blot筛选高表达CD59细胞。③结果成功构建人突变CD59的真核细胞表达系统；运用各种免疫学技术检测获得CD59高表达细胞。④结论人突变CD59在CHO细胞中高表达，为进一步研究CD59分子的功能奠定基础。     

Genistein抑制兔晶体上皮细胞膜酪氨酸蛋白激酶及蛋白激酶C磷酸化的研究

目的：研究gemistein对兔晶体上皮细胞增殖及胞膜酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)活性的影响，探索使用genitein防治后发性白内障。方法：兔晶体上皮细胞培养，应用Casnctllie改良法检测不同浓度genistein及bFGF作用后,兔晶体上皮细胞膜TPK活性的变化；同位素掺入法检测gemistein及bFGF作用后，兔晶体上皮细胞胞膜及胞浆PKC活性的变化。结果：不同浓度genistein作用后兔晶体上皮细胞TPK活性均较对照组明显下降，genistein可抑制bFGF诱导的TPK活性升高，genistein对PKC活性无明显抑制作用，但可抑制bF(求诱导的PKC活性升高。结论：gerristein在体外可通过抑制生长因子激活的蛋白激酶活性升高而抑制兔晶体上皮细胞增殖。     

蛋白激酶C亚型在癌肿中的研究进展

蛋白激酶C（PKC）家族至少包括12种丝氨酸-苏氨酸激酶,其被分为三个主要的类型：经典型（α,β和γ）、新型（δ,ε,η,和θ）、非典型（μ,ξ和ι）。PKC的作用很广泛,但同时也有很多还未被了解。一般而言,PKCs和多种细胞生理活动相关。短暂激活的PKC常常伴随一些就像分泌和离子交换等短期过程。相反,持续的激活通常诱导一些持续的作用,例如增殖分化细胞凋亡或肿瘤的产生。     

人源靶向补体抑制物CR2-CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

目的构建人源靶向补体抑制物CR2-CD59,并筛选中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)高效表达细胞株。方法运用FuGENE6转染试剂,将含有人CR2-CD59的重组PEE14.1质粒转入CHO细胞,蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)筛选出阳性克隆,并利用无血清培养基对CHO细胞表达株进行培养获得重组蛋白,以ELISA、SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定。结果成功构建PEE14.1-CR2-CD59重组质粒,获得CHO细胞稳定表达株。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白CR2-CD59的相对分子质量同预期结果一致。ELISA和Western blot鉴定重组蛋白CR2-CD59可与CR2、CD59多克隆抗体特异性结合。且与含血清培养基相比,无血清培养基能明显提高CHO细胞的蛋白表达量(P0.05)。结论在CHO细胞中成功表达人源靶向补体抑制物CR2-CD59。     

蛋白激酶C及其亚型在胃癌中的研究进展

蛋白激酶C（PKC）是蛋白激酶家族中的一个成员，系日本学Nishizuka等1977年在鼠脑的胞质成分中首次发现的，PKC是一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶，广泛分布与真核细胞中，由多种具有不同生物学特性的同工酶组成，是细胞内信号传导的重要递质。PKC通常处于失活状态．被激活后可由细胞质转位到细胞膜。能够使众多蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化而发挥作用。因此，PKC的活化不仅与正常细胞和异常细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学效应有关，更在肿瘤的发生、发展、转移和多药耐药等方面发挥重要作用。迄今为止，已经分离纯化出至少12种亚型。近年来。PKC及其亚型在胃癌中的表达及作用越来越受到人们重视。本就PKC及其亚型在胃癌中的研究进展作一综述。[第一段]     

结肠腺癌中蛋白激酶C亚型的表达及意义

目的探讨蛋白激酶C(PKC)α、βⅡ、ε、ζ在结肠腺癌中的表达及与结肠腺癌发生、发展及转移的关系。方法选择2010年4月至2012年8月大庆油田总医院收治的82例原发性结肠腺癌患者的手术切除标本,其中管状腺癌52例,黏液腺癌30例;淋巴结转移39例,无淋巴结转移43例。采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测癌组织标本中PKCα、βⅡ、ε、ζ蛋白的表达。结果 52例结肠管状腺癌中,PKCα、βⅡ、ζ3个亚型的阳性表达率在高、中、低各分化组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05);而PKCε亚型的阳性表达率在高、中分化组之间以及中、低分化组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05),但高分化组的阳性表达率显著低于低分化组(χ2=31.523,P<0.05)。黏液腺癌组织中PKCα、βⅡ的阳性表达率显著低于管状腺癌组织(P<0.05),而PKCε的阳性表达率则显著高于管状腺癌组织(P<0.05);黏液腺癌组织与管状腺癌癌组织中PKCζ的阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。原发性结肠腺癌患者中无淋巴结转移者癌组织中PKCα的阳性表达率显著高于有淋巴结转移者(P<0.05);无淋巴结转移者癌组织中PKCβⅡ、ε、ζ的阳性表达率与有淋巴结转移者比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PKC各亚型在结肠腺癌发生、发展和转移中的作用不同,PKCε在结肠管状腺癌中的表达与分化有关,PKCε可能参与了黏液腺癌的黏液分泌,PKCα、βⅡ可能与结肠管状腺癌的细胞增殖有关;PKCα与结肠腺癌淋巴结转移有关。     

anoctamin 1在中国仓鼠卵巢细胞中的表达及其离子通道特性

目的： 探讨anoctamin 1在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达情况,分析其离子通道特性,为研究钙激活氯离子通道的生理功能提供实验依据。方法： PCR方法获得anoctamin 1编码区基因,构建pcDNA3.1-anoctamin 1真核表达载体。脂质体转染anoctamin 1至CHO中,抗生素筛选获取稳定表达anoctamin 1的CHO株。应用RT-PCR技术和倒置荧光显微镜检测anoctamin 1于CHO中的表达和分布情况。应用卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L检测anoctamin 1离子通道的功能。以加入calcimycin和高浓度碘离子的PBS缓冲液的为实验组,未加入calcimycin和高浓度碘离子的PBS缓冲液的为对照组。结果： 限制性内切酶酶切后的琼脂糖凝胶电泳和测序,目的基因anoctamin 1克隆至真核表达载体pcDNA3.1;RT-PCR和倒置荧光显微镜观察,CHO在mRNA和蛋白水平表达anoctamin 1,且anoctamin 1蛋白主要表达于CHO膜上;荧光淬灭动力学实验,CHO表达的anoctamin 1具有转运碘离子的作用,且实验组碘离子转运速度显著高于对照组(P<0.05)。结论： anoctamin 1可高效表达于CHO膜;CHO表达的anoctamin 1具有经典钙激活氯离子通道特性。     

蛋白激酶C及其亚型在胃癌中的研究进展

蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶家族中的一个成员,系日本学者Nishizuka等1977年在鼠脑的胞质成分中首次发现的,PKC是一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶,广泛分布与真核细胞中,由多种具有不同生物学特性的同工酶组成,是细胞内信号传导的重要递质.     

蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

[目的]研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKC_α、PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB/c的表达情况。[方法]ES-BALB/c细胞株用普通ES细胞培养液培养,分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。[结果]免疫组化发现PKC_α在ES-BALB/c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达,以细胞浆和细胞核最甚,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型无明显表达;Western印迹发现PKC_α出现一条蛋白印迹条带,分子质量约为84ku,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型无蛋白印迹条带。[结论]PKC_α在ES细胞阶段即有表达,在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。     

人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的高效稳定表达

目的　在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中表达人白细胞介素１５（ＩＬ１５）,为ＩＬ１５ 的功能研究提供有利条件。方法　采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ１５ 编码区ｃＤＮＡ片段,构建重组真核表达载体,再以脂质体法转染至ＣＨＯ 细胞进行表达,鉴定表达产物的生物学活性。结果　共获得８ 株高效表达ＩＬ１５ 的阳性克隆,其平均活性为（３１８５４±３２７２）Ｕ／（１０６ ｃｅｌｌｓ·ｄ）,稳定传代６ 个月后仍保持其表达活性。结论　人ＩＬ１５ ｃＤＮＡ在ＣＨＯ细胞中获得高效稳定表达     

人LDL受体cDNA在中国仓鼠卵细胞中的表达

将去除大部分3’端非编码区的LDL受体cDNA片断插入pSVL质粒,获得重组质粒pLDL RN,并在LDL受体阴性的中国仓鼠卵巢细胞CHO 7a-1细胞中获得表达。表明3’端非编码区对LDL受体基因表达并非必不可少。     

中国仓鼠卵巢细胞高效表达系统研究进展

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最重要的重组蛋白表达系统之一,在生物制药中被广泛应用,但因生产成本高、细胞株构建时间长等因素限制了其应用。近几年随着对启动子、PolyA尾作用模式的深入了解,对构建高效稳定的质粒指明了方向;核基质结合区的应用突破了位置效应引起的基因沉默;荧光激活细胞分类术等细胞筛选技术为快速、高通量筛选高表达细胞株奠定了基础;RNA干扰技术及抗凋亡因子的应用,可改变CHO细胞的生物特性,使其更适应于发酵生产,提高了表达量。本文就质粒构建、筛选策略、CHO细胞改造等研究成果作一综述。     

蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

【目的】研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKCα、PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB／c的表达情况。【方法】ES-BALB／c细胞株用普通ES细胞培养液培养，分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿，培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。【结果】免疫组化发现PKCα。在ES-BALB／c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达，以细胞浆和细胞核最甚，而PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε4种亚型无明显表达；Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带，分子质量约为84ku，而PKCβ、PKCγ，PKCδ和PKCε 4种亚型无蛋白印迹条带。【结论】PKCα在ES细胞阶段即有表达，在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用，而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：将具有全长血小板生成素（TPO）活性的N端截短血小板生成素cDNA(T184)作为目的基因,在中华仓鼠卵巢细胞（CHO）中成功表达,方法：将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶（DHFR）为筛选扩增基因的pDC-B真核表达载体,通过不断提高MTX浓度,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果：构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒,并能在CHO细胞中高效表达,结论：N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达,其产物具有全长TPO的活性。     

蛋白激酶亚型在肾小球肾炎中的表达及意义

目的：检测蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC)的α、β2、ε3种亚型在肾小班干球肾炎中的表达，并探讨其在发病机制中的意义。方法：应用免疫组织化学技术检测16例系膜增生性肾炎（MsPGN）、12例非增生性肾炎（nonPGN)病人肾穿刺标本及6例正常肾组织中PKCα、β2、ε的表达。结果：MsPGN组肾小球部位PKCβ2表达明显高于nonPGN组（P＜0.01)。结论：PKCβ2与MsPGN的发病密切相关，PKCβ2可能参与了增生性肾小球肾炎的发病机制。     

蛋白激酶C及其亚型在肺恶性肿瘤中变化的研究

对肺恶性肿瘤及正常肺组织中蛋白激酶Ｃ的活性进行了对照研究。发现肺恶性肿瘤组织胞浆中的ＰＫＣ活性明显升高，Ｐ＜０．０５；胞膜中仅肉瘤组织ＰＫＣ活性显著升高，而肺鳞癌、腺癌组织胞膜中ＰＫＣ活性与正常肺组织无明显差异。另外，利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法对ＰＫＣ亚型的分析表明：肺恶性肿瘤及正常肺组织中至少含有ＰＫＣ－α及ＰＫＣｐ－β而不含ＰＫＣ－ε，且ＰＫＣ－α及ＰＫｃ－β在肺恶性肿瘤中的含量较正常有不同程度的增加，其中ＰＫＣ－α出现膜转移。说明ＰＫＣ在肺恶性肿瘤发生机制中可能起重要的调控作用。     

蛋白激酶C亚型与癌肿

1序言 蛋白激酶c（PKC）家族至少包括12种丝氨酸-苏氨酸激酶，其还被分为3个主要的类型：经典型（α，β和γ）、新型（δ，ε，η和θ）、非典型（μ，ξι和ι）。     

重组中国仓鼠卵巢细胞表达系统高效表达载体研究进展

生物制药是21世纪高科技产业,治疗性重组蛋白的生产是生物制药的重要部分。宿主细胞以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用途最为广泛,近70%宿主细胞是用CHO细胞表达系统生产的。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多,其中表达载体是重要因素之一。构建重组CHO细胞表达系统高效表达载体可以利用核基质附着区、泛在染色质开放元件,构建特定位点重组载体系统,以及选择合适的内部核糖体进入位点及弱化筛选标记等实现。CHO细胞表达高效载体构建涉及多个因素,需要进行不同元件的优化,才可达到高效表达。