肝细胞生长因子基因转染5-aza诱导后的骨髓基质干细胞及其表达、分化的研究

目的 将重组腺病毒(Ad-HGF)转染5-氮胞苷(5-aza)诱导后的骨髓基质干细胞(BMSCs),检测其心肌样细胞分化和HGF基因表达,探讨其用于缺血性心脏病治疗的可行性.方法 以5-aza诱导比格犬BMSCs向心肌样细胞分化,形态学观察、免疫组化检测心肌样细胞标志--β-肌球重链蛋白(β-MHC)和(α-横纹肌肌动蛋白的表达;以Ad-HGF转染5-aza诱导后的BMSCs,RT-PCR、ELISA检测肝细胞生长因子(HGF)的表达.结果 形态学观察与免疫组化结果表明,5-aza诱导BMSCs向心肌样细胞分化,Ad-HGF转染5-aza诱导后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达,转染后48h表达量最高,达103ng/ml.结论 Ad-HGF可高效转染5-aza诱导后的BMSCs,为其应用于缺血性心脏病的生物治疗奠定了基础.     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。     

转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达

目的 :检测逆转录病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF1 65)基因转染兔骨髓基质干细胞 (BMSC)后目的基因表达情况及促血管生成作用 ,为进一步将其用于血管化组织工程骨构建奠定基础 .方法 :构建含VEGF基因的逆转录病毒表达载体 ,通过感染兔BMSC 使其获得稳定表达 ,使用免疫组化的方法检测其蛋白表达 ,并通过新生血管计数观察其促血管生成作用 .结果 :成功构建VEGF逆转录病毒表达载体 ,免疫组化方法显示经感染的BMSC 胞质中有阳性棕色颗粒出现 ,且动物实验显示新生血管计数明显高于对照组 (P <0 .0 1 ) .结论 :采用逆转录病毒介导的基因转移技术可将VEGF基因转染至BMSC 中 ,可获得外源性蛋白的表达 ,且有明显的促血管生成作用 .     

骨髓基质干细胞治疗股骨头坏死的研究和应用

综述了近年来骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)在股骨头坏死领域的研究。对MSCs的生物学特性、分离与培养及成骨特性三方面内容进行论述,揭示MSCs的内在特性,说明其有潜力治疗骨坏死疾病;对MSCs治疗股骨头坏死临床运用的论述,说明MSCs治疗骨坏死疾病的可行性;并分析展望骨髓基质干细胞在应用上存在的问题及今后所要解决的难点。     

人骨形态发生蛋白-7腺病毒的构建及其在犬转染骨髓基质干细胞后的表达

目的探讨携带人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)腺病毒构建方法以及其在犬转染骨髓基质干细胞中的表达情况。方法采用腺病毒表达系统体外构建携带BMP-7腺病毒的载体,转染人胚肾293细胞进行同源重组,利用BMP-7重组腺病毒转染犬骨髓基质干细胞,然后采用RT-PCR法检测BMP-7基因的表达。结果经过酶切鉴定证明获得了BMP-7转移质粒穿梭载体pTrack-BMP-7和BMP17重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,病毒滴度为3.6×10~(12)VP/ml。RT-PCR证明BMP-7在重组腺病毒转染后的犬骨髓间充质干细胞中得到了表达,转染效率约98%。结论 BMP-7重组腺病毒的成功构建与成功转染犬骨髓间充质干细胞以及其高效表达,为骨缺损与骨不连的基因治疗提供了实验依据。     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的 探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性.方法 重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs.转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性.结果 转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P＜0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用.结论 重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白.为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

骨髓基质干细胞基因转染的研究进展

骨髓基质干细胞（bone marrow mesenhymal stem cells,BMSCs）的概念于1986年首先由Friedens tein等提出,它是来源于中胚层的一类具有自我更新及多向分化能力的干细胞。其具有多向分化潜能,在合适的诱导条件下可向骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉等多种组织分化。目前,随着基因工程技术蓬勃发展,基因水平的治疗方案在组织工程中得到广泛应用,而骨髓基质干细胞因其自身的优点,已成为转基因技术种子细胞的首选。现对骨髓基质干细胞基因转染的研究现状作一系统介绍。     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs。转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性。结果转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P<0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用。结论重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白。为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

骨髓基质干细胞复合同种骨移植治疗创伤性股骨头坏死实验研究

目的探讨骨艇基质干细胞复合同种骨移植在治疗创伤性股骨头坏死中的成骨作用。方法6月龄SD大鼠36只,随机分为模型组、髓芯减压组及复合骨组。每组12只。取4周龄SD大鼠骨髓基质干细胞体外分离培养,取生长状态良好的第三代细胞复合同种骨粉;采用圆韧带离断方法制备大鼠创伤性股骨头坏死动物模型;于术后1、2、4、6周分别处死动物;光镜下观察三组间病理形态学改变;骨形态计量学参数测量及计算新骨生成量,得出骨小梁相对体积（BV／TV）、骨小梁厚度（Tb．Th）、骨小梁数量（Tb．N）、骨小梁分离度（Tb．Sp）。结果成功的复制出大鼠股骨头坏死模型,呈现出典型股骨头坏死不同时期病理改变;术后6周,骨形态计量学参数检测结果：复合骨组新骨生成量均多于模型组及髓芯减压组,其参数BV／TV、Tb．N、Tb．Th、Tb．Sp与其他二组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论BMSCs复合同种骨支架可作为“活骨”用于ONFH模型治疗并在其修复中可提高诱导成骨能力及股骨头坏死的骨修复能力,其作用优于单纯髓芯减压。     

人肝细胞生长因子基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒载体pNL-HGF-增强绿色荧光蛋白(EGFP)并转染骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测HGF基因在BMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术,利用限制性内切酶酶切获取HGF基因序列并克隆到慢病毒载体pNL-EGFP上,构建重组慢病毒质粒pNL-HGF-EGFP;将慢病毒...     

含hIGF-1基因腺病毒的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达.方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pme Ⅰ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达.结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达.结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统.腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞.     

Construction of hepatocyte growth factor gene recombinant adenovirus vector and its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells

ObjectiveTo construct the adenoviral expression vector system containing human hepatocyte growth factor (hHGF) cDNA, and to further study the transduction efficiency and the expression of HGF in mesenchymal stem cells (MSCs). MethodsThe HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMV-HGF, and was subcloned into the adenovirus shuttle plasmid pDC316-IRES-EGFP vector containing a green fluorescence protein (GFP) reporter gene. Virus Ad-HGF was produced by homologous recombination in HEK293 package cells. Bone marrow derived MSCs were harvested and cultured, and then were transduced with Ad-HGF. The efficiency of Ad-HGF transduction was assessed by FACS analysis using GFP gene expression. And HGF/MSCs were generated. The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA using anti-human HGF monoclonal antibody. Results The recombinant, named pDC316-HGF-IRES-eGFP, was digested with restriction enzyme, and the DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genebank and did not reveal any mutation. GFP expression could be observed on the second day after packing of the linearized pAd-HGF in HEK293 cells and 7.15×1010pfu/ml titer of Ad-HGF was obtained. Forty-eight hours after transduction, 96.89% of HGF/MSCs were GFP positive. Peak concentration levels of hHGF(103ng/mL) in the cultured supernatants were detected on day 2 post-transduction, and the adenovirus-mediated expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo. ConclusionOur data demonstrated that the adenovirus expression'vector system pDC316-HGF-IRES-EGFP has been constructed successfully, and their effective expressions also have been obtained in MSCs. This will provide material basis for the next study on liver regeneration after small-for-size liver transplantation.     

逆转录病毒介导的人抗肌萎缩蛋白小基因在mdx鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建含有人抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转移的假肥大型肌营养不良模型小鼠(mdx)骨髓间充质干细胞(MSCs)中目的基因的表达。方法构建含有抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PA317,制备含有目的基因的重组逆转录病毒并感染mdx鼠的MSCs,利用免疫荧光、RT-PCR法检测目的基因的表达。结果成功构建了抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体。含抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒感染mdx鼠MSCs后48h,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现319bp DNA片断;免疫荧光检测显示感染组mdx鼠MSCs中可见红色颗粒,深浅不一。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将抗肌萎缩蛋白小基因转移至mdx鼠MSCs并表达。     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能。方法采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定。在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化。采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力。结果形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力。结论VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性。rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能。     

犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化的平滑肌细胞的组织培养及鉴定

目的：应用条件培养基体外诱导成年犬骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨其作为构建组织工程血管种子细胞的可行性。方法：应用DMEM添加PDGF-BB和维生素C(VIT-C)体外培养通过密度梯度离心法得到的骨髓单核细胞,通过形态学观察鉴定培养的细胞,采用免疫荧光法检测4～6代细胞中平滑肌细胞特异性标记α-肌动蛋白（α-SMA）和肌球蛋白重链SMMHC,应用流式细胞术检测第5、6代细胞中平滑肌细胞的阳性率。结果：犬骨髓间充质干细胞在条件培养基的诱导下稳定传代至第6代后达到种子细胞的种植数量10⁷～10⁸,单独DMEM培养需要42　d,添加PDGF-BB/VIT-C后时间减少为33　d。细胞免疫荧光结果提示,大部分细胞α-SMA阳性、SMMHC阴性;流式细胞术结果显示,第5、6代细胞的α-SMA阳性率分别为57.8%和66.8%。结论：体外条件培养基能诱导犬骨髓间充质干细胞增殖分化为平滑肌细胞,并可作为组织工程血管构建的种子细胞。     

Effect of growth and differentiation factor 6 on the tenogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Recent studies showed that bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) had risk of ectopic bone formation.In this study,we aimed to investigate the effect of growth and differentiation factor 6 (GDF-6) on the tenogenic differentiation of BMSCs in vitro,and then combined with small intestine submucous (SIS) to promote tendon regeneration in vivo.Methods The BMSCs were isolated from the green fluorescent protein (GFP) rats,and were characterized by multi-differentiation assays following our previous study protocol.BMSCs cultured with different concentrations of GDF-6,without growth factors served as control.After 2 weeks,mRNA expression and protein expression of tendon specific markers were examined by qRT-PCR and Western blotting to define an optimal concentration of GDF-6.Mann-Whitney U-test was used to compare the difference in relative mRNA expression among all groups; P ≤0.05 was regarded as statistically significant.The GDF-6 treated BMSCs combined with SIS were implanted in nude mice and SD rat acute patellar tendon injury model,the BMSCs combined with SIS served as control.After 12 and 4 weeks in nude mice and tendon injury model,the samples were collected for histology.Results After the BMSCs were treated with different concentration of GDF-6 for 2 weeks,the fold changes of the specific markers (Tenomodulin and Scleraxis) mRNA expression were significantly higher in GDF-6 (20 ng/ml) group (P ≤0.05),which was also confirmed by Western blotting result.The BMSCs became parallel in orientation after GDF-6 (20 ng/ml) treatment,but the BMSCs in control group were randomly oriented.The GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs were combined with SIS,and were implanted in nude mice for 12 weeks,the histology showed neo-tendon formation.In the SD rat patellar tendon window injury model,the histology also indicated the GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs combined with SIS could promote tendon regeneration.Conclusions GDF-6 has tenogenic effect on the tenogenic differentiation of BMSCs,and GDF-6 (20 ng/ml) has better tenogenic effect compared to other concentrations.The GDF-6 (20 ng/ml) treated BMSCs combined with SIS can form neo-tendons and promote tendon regeneration.     

3H-TdR标记人骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞移植mdx鼠能否修复骨骼肌肌膜病变及干细胞在其体内的分布特点.方法 用氚-脱氧胸腺嘧啶(3H-TdR)标记人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs),以每只鼠干细胞1×10⁷/0.3 ml经尾静脉注入18只免疫抑制的mdx鼠(8～10周龄).于移植后24 h、48 h、2周、1月、2月、4月处死鼠,分别测定各组织器官的放射活性;用免疫荧光法检测骨骼肌肌膜营养障碍基因(dystrophin,Dys)表达情况.结果 移植后1月,多数组织、器官放射活性显著高于对照组,其中以骨髓、肝、脾放射活性增高更为明显.大多数组织器官放射活性随时间推移逐渐下降,而骨骼肌放射活性的从2周时开始逐渐升高,于1月时达到高峰(27.6±3.3 Bq/mg湿重).1月之后,骨髓、骨骼肌放射活性仍保持较高水平.免疫荧光显示移植后24 h、48 h、2周骨骼肌Dys免疫荧光呈阴性,1月后呈阳性,1月、2月、4月阳性率分别为:6.6%、8.4%、8.9%.结论 hBM-MSCs能植入mdx鼠体内,并融合、分化为骨骼肌,部分修复骨骼肌肌膜病变;hBM-MSCs移植入mdx鼠后早期主要分布在骨髓、肝、脾,后期主要分布在骨髓、骨骼肌.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化

目的研究人骨髓间充质干细胞(BDMSC)向血管内皮细胞的诱导分化,为复杂器官组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源.方法以血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对种植于纤维蛋白凝胶及基底膜基质中的BDMSC进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间分别进行形态观察、组织切片和CD34、CD31、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1,Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)、vWF的免疫组织化学荧光染色.结果诱导后的人BDMSC阳性表达血管内皮细胞特有表面标志CD34、CD31、Flt-1、Flk-1、vWF,并生成内皮样细胞,形成血管样结构.结论血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及诱导后表达的Flt-1、Flk-1等表面分子可能在BDMSC向血管内皮细胞分化、并形成血管样结构的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在组织工程血管化及细胞移植修复损伤中的应用提供了理论与技术上的支持.