人骨膜细胞体外培养的实验

目的:观察体外培养的人骨膜细胞的形态学特征。方法:实验于2001-01/2003-10广东省粤北人民医院骨科和医学动物实验室完成。采用常规细胞培养法进行人骨膜细胞体外培养,并采用倒置显微镜和电子显微镜观察骨膜细胞生长情况、形态特征及超微结构。结果:①人骨膜培养活细胞光镜下形态:早期新生细胞呈梭形,饱满透明,立体感强;分裂期呈立方形或短柱状;后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形,分泌功能旺盛。②人骨膜细胞电镜下超微结构:胞体呈梭形,膜面有少量微绒毛状突起,粗面内质网丰富,有大量异噬体等次级溶酶体,线粒体体积较小、基质致密有少量嵴。具有原代细胞生物形态学特征。结论:人骨膜成骨细胞可经体外培养大量增殖,且细胞传代进化后,其形态学结构与原代细胞无明显差异,可用于细胞移植。     

骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞体外构骨的超微结构

背景：骨形态发生蛋白被证实有成骨诱导作用,然而关于骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞成骨的超微结构研究尚未见报道。目的：观察骨膜细胞经成骨因子骨形态发生蛋白7诱导后的生物活性及超微结构。方法：实验取材于成人胫骨。分离出原代骨膜细胞后行常规体外培养,实验分为实验组和对照组。实验组加入骨形态发生蛋白7和细胞培养辅助剂,对照组仅仅加入了成骨细胞培养辅助剂。每组分别在第5,10,15天设3个时间点,每个时间点设3个样本,分别行钙结节的染色及采用相差显微镜观察大体形态结构,在透射电镜下观察超微形态结构。结果与结论：实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好,形态一致。细胞早期呈梭形,立体感强,饱满透明,分裂期呈短柱状或立方形,电镜下见成骨细胞内有大量的粗面内质网和高尔基复合体;后期细胞由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形,后期射透电镜下可见细胞内有大量基质小泡,有膜包被,胞质内上有碱性磷酸酶及钙结合蛋白,泡内有钙盐结晶,成骨细胞的基底部和侧面出现突起与邻近的骨细胞突起相连。由骨形态发生蛋白7诱导的成骨细胞在体外增殖更快,细胞分裂及成骨速度更快。结果提示骨形态发生蛋白7在体外培养中具有明显增强成骨细胞增殖的能力。     

家兔骨髓基质细胞培养后与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的相容性

目的：建立一套体外分离培养骨髓基质干细胞的方法，观察骨髓基质细胞的形态和生长规律，检测与载体聚乳酸-聚乙醇酸复合的细胞相容性。 方法：实验于2004-10／2005-04在解放军第四军医大学唐都医院骨实验室完成。选取健康30d龄家兔40只，取幼兔长骨骨髓进行培养，观察其传代细胞生长特性和生长曲线。应用组织培养技术，对兔骨髓基质干细胞和聚乳酸-聚乙醇酸体外联合培养，相差显微镜观察和扫描电镜观察细胞生长情况。 结果：实验纳入家兔40只，全部进入结果分析。①骨髓基质细胞不同接种时间的形态学观察：接种24h后可见大量密集的造血系细胞，有少量散在分布的贴壁细胞，呈多角形、短梭形；第3天可见形态各异、大小不一的贴壁细胞；第7天数量加速生长，己形成成纤维细胞集落，大部分细胞呈梭形，少部分呈多角形；第12天细胞融合成单层，从整体看大多数细胞沿胞体长轴呈有序排列。②骨髓基质细胞接种72h后扫描电镜观察结果：早期可见培养板内细胞增多，并向聚乳酸-聚乙醇酸材料移行贴附于材料周边，部分细胞直接贴附于材料表面，随复合培养时间的延长而增多，细胞形态多为梭形及三角形，无细胞衰老及异常分裂现象。 结论：兔骨髓基质细胞在体外培养条件下，早期生长性状稳定，增殖速度快，适应性强，可作为骨组织工程学的种子细胞。聚乳酸-聚乙醇酸具有良好的细胞相容性，可作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的实验。     

骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞碱性磷酸酶的表达

背景：关于骨形态发生蛋白 7 作为刺激因子诱导细胞成骨的报道目前较少见。目的：观察骨膜细胞经骨形态发生蛋白 7 诱导后碱性磷酸酶的表达。方法：取材于成人胫骨骨膜,常规细胞培养法行骨膜细胞体外培养,分为实验组和对照组,分别加入骨形态发生蛋白 7 加成骨细胞培养辅助剂和单纯成骨细胞培养辅助剂,相差显微镜观察骨膜细胞形态特征及超微结构。每组分别在第 7,14,21 天设 3 个时间点,每个时间点设 3 个样本,采用碱性磷酸酶试剂盒法检测成骨细胞特异性标志物碱性磷酸酶表达情况。结果与结论：骨膜细胞经分组培养后,第 7 天时,实验组和对照组骨膜细胞均有明显增殖,碱性磷酸酶的可被检测出,但量不多,细胞外形为梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量稍多;第 14 天时,实验组及对照组骨膜细胞均显著增殖,细胞外形由梭形变为宽梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量明显增多。第 21 天时,实验组及对照组骨膜细胞均增殖,其中实验组细胞增殖明显,细胞外形为宽梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量显著增多。经过统计学分析由骨形态发生蛋白 7 诱导的骨膜细胞的成骨标志物碱性磷酸酶阳性率明显高于对照组（P 〈 0.01）。提示骨膜细胞具有良好的成骨和再生能力, 骨形态发生蛋白 7 能诱导骨膜细胞加强碱性磷酸酶的表达,能诱导骨膜细胞向成骨细胞转化。     

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

目的：改良成骨细胞分离培养方法，为骨形成、骨代谢以及骨组织工程等基础研究提供种子细胞。 方法：实验于2002—09／2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。①无菌条件下取五六个月龄流产胎儿颅盖骨（家属知情同意），去除骨膜及周围结缔组织，然后用2．5g/L胰蛋白酶消化20min，终止消化后，去除骨缝组织，剪碎，将碎骨块接种于培养瓶中分离培养成骨细胞。②细胞纯化采用差速贴壁法。通过相差显微镜观察人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征。③用碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色等方法对所获得的成骨细胞进行鉴定。 结果：①人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征：原代培养至第5天，骨块边缘出现零散的细胞，这些细胞的形态主要为梭形、三角形或多边形。原代培养第14天后，形成融合层，细胞呈圆形、卵圆形或方形紧密排列，叠层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞，细胞排列无方向性，出现集落样生长趋势。②人胚成骨细胞的鉴定结果：90％以上分离获得细胞碱性磷酸酶染色和钙结节染色均呈阳性。 结论：采用酶消化后植块的改良植块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞，这些细胞具有典型的成骨细胞形态和功能，是一种较好的分离培养人胚成骨细胞的方法。     

人脐带血间充质干细胞分离培养的技术初探

目的：探讨人脐带血中的间充质干细胞(umibihcal cord blood mesenchymal stem cells，UBCMSCs)的分离培养方法。方法采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离UBCMSCs,MDEM(低糖）培养基加20%新生小牛血清培养并传代，进行观察并应用FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况。结果：将密度梯度离心收获的单个核细胞接种培养后，24h后即可见有少量细胞贴壁，呈圆形；48h后贴壁细胞增多，少量贴壁细施形态呈单极梭形突出；反复换液后梭形细胞明显增多，最后获得均一的贴壁细胞。培养6天后细胞开始呈对数生长。在单个核细胞中，CD44^ 细胞的比例占16．8％，CD34^ 为29．6％；经培养14天后，CD44^ 细胞显著增多，占54．4％，而CD34^ 细胞的比例降至6．0％。结论：密度梯度离心结合直接贴壁法可在体外分离培养UBCMSCs，可望用于大量制备人源性MSCs。     

缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：观察缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞形态学特征。方法：将缺血性脑血管病患者自体骨髓中的阃充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM—MSCs）经密度梯度离心法分离、纯化和培养，观察原代和传代细胞的形态。结果：原代培养的BM—MSCs最佳贴壁时间为3d，生长性状不一，呈散在圆形细胞群、散在梭形细胞群、克隆圆形细胞群、花带状细胞群、漩涡状细胞群，而传代培养的细胞，增殖速度较快，性状一致，排列规则，呈饱满的梭行。结论：通过体外非诱导培养获得的自体BM—MSCs，有较强的增殖能力和多向分化潜能，为缺血性脑血管病的临床治疗提供了实验依据。     

密度梯度离心与贴壁法分离培养免骨髓间充质干细胞及其生物学特性观察

背景：获取更大量、更高纯度、有活性的骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究发展的基础。目的：拟建立一套体外分离培养及大量扩增兔骨髓间充质干细胞的方法，并对细胞生物学特性进行观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—12／2007—07在山东省烟台市莱阳中心医院骨科试验室完成。材料：清洁级1月龄雌性新西兰大白兔1只。方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方式，分离兔骨髓间充质干细胞，应用细胞刮收集呈长梭形的细胞，形成克隆后用胰蛋白酶＋EDTA消化，按1：3传代进行体外扩增培养。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态特征，免疫细胞化学SABC法鉴定CD34、CD44抗原的表达，观察细胞生长特性，测定细胞活力。结果：原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形，漩涡状排列，约14d达90％以上融合；传代后增殖迅速，细胞为单一的梭形，排列更加有序。所培养的细胞CD44呈阳性表达，而CD34呈阴性。第1～5代细胞培养3—5d为对数生长期，第7代以后对数增长期延长。第1～5代细胞成活率均〉94％，其中第3，4代成活率高达97％；至第7代细胞活力呈明显下降趋势，细胞成活率仅为78％。结论：应用密度梯度离心结合贴壁法，可成功分离并扩增兔骨髓间充质干细胞，且细胞生长稳定，增殖力强．可作为细胞移植的种子细胞。     

密度梯度离心与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞及其生物学特性观察

背景：获取更大量、更高纯度、有活性的骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究发展的基础。目的：拟建立一套体外分离培养及大量扩增兔骨髓间充质干细胞的方法，并对细胞生物学特性进行观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—12／2007—07在山东省烟台市莱阳中心医院骨科试验室完成。材料：清洁级1月龄雌性新西兰大白兔1只。方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方式，分离兔骨髓间充质干细胞，应用细胞刮收集呈长梭形的细胞，形成克隆后用胰蛋白酶＋EDTA消化，按1：3传代进行体外扩增培养。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态特征，免疫细胞化学SABC法鉴定CD34、CD44抗原的表达，观察细胞生长特性，测定细胞活力。结果：原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形，漩涡状排列，约14d达90％以上融合；传代后增殖迅速，细胞为单一的梭形，排列更加有序。所培养的细胞CD44呈阳性表达，而CD34呈阴性。第1～5代细胞培养3—5d为对数生长期，第7代以后对数增长期延长。第1～5代细胞成活率均〉94％，其中第3，4代成活率高达97％；至第7代细胞活力呈明显下降趋势，细胞成活率仅为78％。结论：应用密度梯度离心结合贴壁法，可成功分离并扩增兔骨髓间充质干细胞，且细胞生长稳定，增殖力强．可作为细胞移植的种子细胞。     

脑损伤患者骨髓间充质干细胞形态学特征

目的：骨髓间充质干细胞(hone marrow mesenchvmal stem cells,BM-MSCs)具有自我复制能力，可以经过不可逆的终末分化过程产生子代细胞，神经元细胞，极有可能成为组织工程较为理想的种子细胞。观察脑损伤患者骨髓间充质干细胞形态学变化，以寻求另一种治疗方式。方法：实验于2003-09／11在河南省人民医院生物治疗研究中心完成。将脑损伤患者的BM-MSCs。自体骨髓经密度梯度离心分离、纯化和培养，观察原代和传代细胞的细胞形态。结果：原代培养的BM-MSCs最佳的贴壁时间为3d，生长性状不一，呈散在圆形细胞群、克隆圆形细胞群、散在梭形细胞群、花带状细胞群、旋涡状细胞群，而传代培养的细胞，增殖速度较快，性状一致，排列规则，呈饱满的梭行。结论：体外非诱导培养的BM-MSCs方法可能为临床治疗脑损伤患者提供种子细胞。