人骨膜细胞体外培养的实验

目的:观察体外培养的人骨膜细胞的形态学特征。方法:实验于2001-01/2003-10广东省粤北人民医院骨科和医学动物实验室完成。采用常规细胞培养法进行人骨膜细胞体外培养,并采用倒置显微镜和电子显微镜观察骨膜细胞生长情况、形态特征及超微结构。结果:①人骨膜培养活细胞光镜下形态:早期新生细胞呈梭形,饱满透明,立体感强;分裂期呈立方形或短柱状;后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形,分泌功能旺盛。②人骨膜细胞电镜下超微结构:胞体呈梭形,膜面有少量微绒毛状突起,粗面内质网丰富,有大量异噬体等次级溶酶体,线粒体体积较小、基质致密有少量嵴。具有原代细胞生物形态学特征。结论:人骨膜成骨细胞可经体外培养大量增殖,且细胞传代进化后,其形态学结构与原代细胞无明显差异,可用于细胞移植。     

人颌骨骨膜成骨细胞的体外分离与培养

目的探讨人下颌骨骨膜分离培养成骨细胞的可行性。方法切取人健康的下颌骨骨膜,用胰酶、胶原酶分步消化法分离出成骨细胞,利用差异贴附原理对分离出的细胞进行纯化,对成骨细胞进行体外培养与扩增,倒置显微镜下观察细胞的生长、增殖与黏附情况,利用碱性磷酸酶染色和免疫组织化学方法检测人成骨细胞Ⅰ型胶原表达来对成骨细胞进行鉴定。结果人下颌骨骨膜成功分离出成骨细胞并进行体外培养与扩增,免疫组化学方法检测出Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶染色阳性反应率达95％以上。结论自人下颌骨骨膜分离培养成骨细胞的方法切实可行。     

低强度脉冲超声波刺激对人骨髓基质细胞和骨膜细胞生物学效应的影响

目的研究低强度脉冲超声波（LIPUS）对体外分离培养的人骨髓基质细胞、骨膜细胞生物学效应的影响，探讨其促进骨折愈合的相关机制。方法采用辐射强度为30mW／cm^2的脉冲超声波分别作用于体外培养的人骨髓基质细胞、骨膜细胞（上述细胞根据LIPUS每天作用时间再分为5min／d组，10min／d组及20min／d组），并于不同时问点检测其对细胞生长、分化等主要相关指标的影响。结果各LIPUS实验组骨髓基质细胞、骨膜细胞DNA合成量与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）；骨膜细胞经LIPUS作用后，其ALP活性、骨钙素分泌水平及钙结节形成均显著增强（P〈0．05），而骨髓基质细胞经LIPUS作用后．其细胞分化标志物均无明显改变（P〉0．05）。结论LIPUS能够促进人骨膜细胞向成骨细胞分化，这可能是其促进骨折愈合的相关生物学机制之一。     

人骨髓基质细胞体外培养修复骨缺损

目的建立一种新型、简易的人骨髓成骨细胞体外培养方法.方法以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质细胞培养,并在不同培养液中进行培养,用倒置显微镜、扫描电镜、组织化学染色等方法进行观测.结果人骨髓基质细胞16d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞4～5d即可传代.在条件培养液中2周形成多层结构,并出现细胞结节,碱性磷酸酶(ALP)染色阳性,钙染色阳性.结论本实验所获人骨髓基质细胞具有成骨细胞的形态特征和生物学特征.     

人绒毛膜滋养层细胞的体外培养

目的 培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织，进行原代培养，胰蛋白酶消化法传代培养，光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果 原代培养滋养层细胞3h后开始贴壁，18h后全部贴壁，3天可传代，角蛋白、波形蛋白染色细胞纯度达95％以上。结论 胰蛋白酶、胶原酶消化法简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞，建立了稳定的人类绒毛膜滋养层细胞体外培养体系。     

人正常神经组织许旺细胞的体外培养

背景:周围神经组织工程所需要的许旺细胞数量巨大.在以往的研究中,由于正常入神经组织的缺乏,常选用大鼠、兔等动物神经组织分离许旺细胞进行培养,而作为异种细胞在临床的应用相对受限.目的:体外培养人正常周围神经的许旺细胞,寻找一种最佳的获取、培养、纯化的方法.方法:切取脑瘫患者周围神经缩窄术中的正常周围神经,以消化培养法为主,结合差速贴壁法纯化培养许旺细胞.将神经组织剪成碎块,接种于含胎牛血清、胶原酶、Dispase酶的培养液中消化培养,离心,将组织块加入培养基中,吹打成单细胞悬液,再移入有多聚赖氨酸的DMEM培养皿中,加入碱性成纤维细胞生长因子培养,当贴壁细胞覆盖培养皿达B5%～90%即可开始传代培养.锥虫蓝染色对培养后的第2,3,4,5,6,7,8,9,10天不同时间许旺细胞进行计数,并经S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定计算细胞纯度.结果与结论:4 d后镜下可见基本为纯净的许旺细胞,密度在0.5×10~8 L~(-1)以上.传3代后,许旺细胞计数可达到9×10~8 L~(-1)以上;许旺细胞纯度达85%以上.结果表明,以消化培养法结合差速贴壁方法培养许旺细胞所需时间短,可获得较高纯度的人许旺细胞,能够为进一步的神经组织工程提供细胞来源.     

SD大鼠角朊细胞体外培养的实验

目的:观察SD大鼠角朊细胞在体外培养的生长特性。方法:采用dispase酶消化法从SD大鼠仔鼠皮肤获得角朊细胞,在体外进行培养并传代,采用倒置显微镜和MTT法观察细胞的形态学变化和生长曲线。结果:通过酶消化法可以获得较纯的角朊细胞,原代培养10d细胞即可以达到融合,传代后细胞部分发生变性,呈成纤维细胞样,传代次数高,成纤维样细胞比例也相应增高。结论:SD大鼠角朊细胞可以在体外培养分裂增殖,但传代后即发生变     

改良酶消化联合植块法培养兔骨膜成骨细胞

背景:骨膜成骨细胞具有很强的增殖能力和分化成骨潜能,而且取材方便,但以往常规培养方法时间较长,如伺能够缩短培养时间,是骨膜源性成骨细胞成为理想种子细胞的关键之一.目的:应用改良酶消化法培养兔骨膜原代成骨细胞,观察其在喷砂钛片上的黏附及增殖情况.方法:切取雄性日本大耳白兔胫骨近端前内侧面骨膜0.5～1.0 cm~2:①常规方法:以0.25%胰蛋白酶在37℃消化30 min后,用0.1%Ⅰ型胶原酶在37℃消化30 min,不断振荡,弃掉胰蛋白酶后植入培养瓶,干涸培养2 h,加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基培养.②改良方法:将Ⅰ型胶原酶消化时间由30 min改为1 h.碱性磷酸酶染色、钙结节染色鉴定成骨细胞.将原代培养成骨细胞与喷砂钛片联合培养,采用扫描电镜、MTT法检测不同时间点成骨细胞在喷砂处理钛片上的黏附及增殖情况.结果与结论:培养第5天,改良法培养的骨膜成骨细胞从组织块周围爬出,第25天细胞汇聚成单层,细胞呈三角形或多角形;传代培养1个月后,可见细胞成复层生长,并有黑色钙结节生成,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、钙结节染色呈阳性.常规法培养的细胞爬满单层时间推迟12 d左右.在喷砂处理的钛片表面上成骨细胞立体感强,有伪足伸出,伪足嵌入小的孔洞内,细胞表面有基质分泌.两种方法培养的成骨细胞在钛片表面的黏附及增殖差异无显著性意义.提示改良消化法可明显缩短成骨细胞培养时间,对成骨细胞的黏附及增殖能力无影响.     

血小板衍生生长因子对体外培养人椎间盘细胞功能的影响

目的：观察血小板衍生生长因子对体外培养人椎间盘细胞凋亡、分裂增殖及基质合成的影响。 方法：实验于2003-05／2004-02在卫生部小儿先天畸形重点实验室完成。2003-05／12中国医科大学附属第一临床医院骨科施行脊柱侧凸前路松解术的患者8例，术前检查无代谢性软骨疾病。将术中取出椎间盘组织（患者知情同意）立即置人装有HAMF-12培养液的无菌瓶内带至实验室。体外单层培养人椎间盘细胞，取生长良好的第2代细胞实验，加入不同浓度（1，10，100，1000μg/L）的血小板衍生生长因子，利用dUTP缺口末端标记法检测椎间盘细胞凋亡；用噻唑蓝法观察椎间盘细胞分裂增殖情况，利用氯胺T法和Alcian法检测细胞培养液中羟脯氨酸及硫酸软骨素的含量。 结果：①血小板衍生生长因子对人椎间盘细胞凋亡的影响：不同浓度血小板衍生生长因子10，100，1000μg/L椎间盘细胞凋亡率与对照组比较差异均有非常显著性意义（0．91&;#177;0．32，0．52&;#177;0．24，0．11&;#177;0．04，P〈0．01），低浓度（1μg／L）血小板衍生生长因子对椎间盘细胞凋亡无影响。②不同浓度血小板衍生生长因子的培养液中硫酸软骨素和羟脯氨酸的含量：随着血小板衍生生长因子浓度的增加（10，100，1000μg/L），硫酸软骨素含量、羟脯氨酸含量明显增加[硫酸软骨素：（33．34&;#177;4．32），（48．67&;#177;6．71），（69．79&;#177;6．62）μg/L；羟脯氨酸：（5．79&;#177;0．91），（8.27&;#177;1．23），（10.34&;#177;1．51）μg/L，P〈0．01]，血小板衍生生长因子的浓度与两者呈正相关（ra=0．875，p〈0.01；rb=0．912，P〈0．01）。③血小板衍生生长因子对椎间盘细胞生长和增殖的影响：10μg／L组和100μg／L组血小板衍生生长因子对人椎间盘细胞有促进增殖的作用，1μg/L组血小板衍生生长因子对人椎间盘细胞的增殖无影响，而1000μg／L组血小板衍生生长因子可抑制人椎间盘细胞增殖。 结论：血小板衍生生长因子对体外培养的椎问盘细胞凋亡具有拮抗作用，并对椎间盘细胞的分裂增殖、基质中胶原及蛋白多糖的合成具有促进作用。主     

急性淋巴细胞白血病细胞体外培养

急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞体外培养比较困难,这主要是因为ALL克隆形成细胞在各种生长因子中的半固体培养基中形成集落的能力有限,目前尚未发现ALL细胞理想培养条件。有鉴于此,我们开展了ALL细胞体外培养方法的研究,建立了ALL细胞培养体系,对12例ALL细胞进行了体外半固体培养观察,同时对ALL细胞集落形成的因素进行了探讨,现报告如下。材料和方法1 病例来源 12例ALL患者均经临床血象、骨髓确诊,其中L_1 7例,L_2 3例,L_3 2例。2例曾用VP(长春新     

人胚嗅球成鞘细胞的体外培养

目的:评估人胚嗅球成鞘细胞的分离与培养方法。方法:试验于2005-03/2005-08在昆明总医院中心实验室完成。选取自愿捐献自然流产3～5个月的胚胎,分离原代嗅球成鞘细胞,利用延迟差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制法对细胞进行纯化,采用免疫组织化学方法鉴定细胞并计算其P75阳性率。结果:①人胚嗅球成鞘细胞的形态学观察:原代培养5d的人胚嗅球成鞘细胞胞体呈长梭形,多极状,立体感强,折光性好。8d后,胞体变大,突起变长,并逐渐相互交织成网。14d后细胞主要表现为双极、三极形态。②人胚嗅球成鞘细胞免疫细胞化学染色及纯度鉴定:贴壁第2天,第7天的细胞染色,P75阳性达到95%以上。第14天细胞染色阳性率降至90%。25d则仅为50%。结论:应用延迟差速贴壁法与阿糖胞苷化人胚嗅鞘细胞的方法,分离培养人胚嗅球成鞘细胞是一种较为稳定可靠的方法。     

人胚嗅球成鞘细胞的体外培养

目的：评估人胚嗅球成鞘细胞的分离与培养方法。方法：试验于2005-03／2005-08在昆明总医院中心实验室完成。选取自愿捐献自然流产3～5个月的胚胎，分离原代嗅球成鞘细胞，利用延迟差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制法对细胞进行纯化，采用免疫组织化学方法鉴定细胞并计算其P75阳性率。结果：①人胚嗅球成鞘细胞的形态学观察：原代培养5d的人胚嗅球成鞘细胞胞体呈长梭形，多极状，立体感强，折光性好。8d后，胞体变大，突起变长，并逐渐相互交织成网。14d后细胞主要表现为双极、三极形态。②人胚嗅球成鞘细胞免疫细胞化学染色及纯度鉴定：贴壁第2天，第7天的细胞染色。P75阳性达到95％以上。第14天细胞染色阳性率降至90％。25d则仅为50％。结论：应用延迟差速贴壁法与阿糖胞苷化人胚嗅鞘细胞的方法，分离培养人胚嗅球成鞘细胞是一种较为稳定可靠的方法。     

人表皮干细胞的体外分离和培养

背景：如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性，是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题。目的：建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。设计、时间及地点：细胞观察，于2005-03／2006-05在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。材料：所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者，患者无泌尿系统感染等疾病。方法：取包皮皮片，采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞，Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液，过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合，并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液，用以人表皮干细胞的体外扩增培养，以角朊细胞作对照。主要观察指标：传至第2代，通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间，采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达。结果：①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比，人表皮干细胞的克隆形成率明显升高，克隆维持时间延长（P〈0．01）。②表皮干细胞β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论：应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基，对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养。     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养**

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清 DMEM 培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液进行诱导分化。结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物 nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU 掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化特性

背景：视网膜干细胞已在多种脊椎动物眼内发现，但目前对人类视网膜干细胞或前体细胞的生物学特性尚知之甚少。目的：探讨人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化潜能。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-03／2006-02在中山大学中山眼科中心完成。材料：人胚胎神经视网膜来源于4例流产胎儿。方法：分离胚胎眼球神经视网膜，经胰酶消化法制备单细胞悬液，加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、左旋谷氨酰胺的无血清高糖DMEM／F12培养基进行原代及传代培养。收集培养第1～3代的细胞克隆球体，接种到右旋多聚赖氨酸及层粘连蛋白预包被的6孔细胞培养板内，培养7d后行免疫细胞化学染色。主要观察指标：倒置显微镜下观察视网膜前体细胞分化前后的形态变化，免疫细胞化学法鉴定分化细胞特性。结果：部分人胚胎神经视网膜细胞呈神经球体样悬浮生长，细胞球体边界清楚，折光性强，表达视网膜前体细胞标签巢蛋白；将其接种到分化条件下培养7d后，细胞体积增大，变扁平，呈梭形、多角形，伸出大小不等的细胞突起，大部分细胞表达视网膜神经元细胞分子标签βⅢtubulin和胶质细胞标签胶质纤维酸性蛋白，少量细胞表达光感受器标签视紫红质。结论：人胚胎视网膜前体细胞可在体外扩增培养，在胎牛血清联合右旋多聚赖氨酸、层粘连蛋白特定诱导条件下，可以向视网膜神经元、胶质细胞及光感受器细胞分化。     

人牙髓干细胞的体外培养及神经样诱导分化

背景：牙髓组织来源干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。目的：了解人牙髓干细胞向神经元样细胞诱导分化能力和诱导分化条件。方法：取健康青年人的第三磨牙的牙髓组织后,制成单细胞悬液,加入含有体积分数为15%胎牛血清α-MEM培养基在6孔板培养,传代培养后加入丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子诱导剂进行培养。结果与结论：免疫荧光和反转录-聚合酶链反应检测显示,诱导2周后人牙髓细胞除了stro-1,Col-Ⅰ,牙本质涎蛋白表达阳性外,还有巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶的表达也是阳性,而牙龈纤维细胞表达均为阴性。说明人牙髓组织中存在成体干细胞,在一定的诱导培养条件下,牙髓干细胞有向神经元样细胞分化的潜能。     

成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养

背景:外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力.目的:探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性.方法:采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12 d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化.采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Western blot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况.此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线.结果与结论:成人外周血单个核细胞诱导培养4 d时开始出现细胞集落,12 d时细胞呈明显梭形.流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的(71.8±7.2)%.分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28 d呈旋涡状生长.间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性.Western blot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14,21 d开始表达,并逐渐增加.生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期.提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞.它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞.     

成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养

背景：外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力。目的：探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性。方法：采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化。采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Westernblot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况。此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线。结果与结论：成人外周血单个核细胞诱导培养4d时开始出现细胞集落,12d时细胞呈明显梭形。流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的（71.8±7.2）%。分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28d呈旋涡状生长。间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性。Westernblot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14,21d开始表达,并逐渐增加。生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期。提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞。它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞。     

人牙髓细胞体外培养及向成牙本质细胞的诱导分化

目的:观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达和矿化结节形成能力,建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系。方法:实验于2004-07/2005-07在中山大学光华口腔医学院完成。利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,取第3代牙髓细胞,胰酶消化后进行细胞计数,连续观察7d,绘制生长曲线。第3代牙髓细胞,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化,观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化,用Von kossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力。结果:①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞。②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列。4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性。③与未诱导的细胞相比,矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐渐升高,但到第4周后活性有所降低。结论:实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,是研究成牙本质细胞的较好模型。