调节破骨细胞分化的RANK特异性cDNA片段的研究

【目的】在生理条件下寻找调节破骨细胞（OC）分化的核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）的特异性cDNA功能片段,为研究OC分化机制提供理论基础。【方法】先将RANK膜内部分的1.2kb大小的cDNA分成20个片段,用缺失突变的方法构建出20个由肿瘤坏死因子受体1和RANK跨膜和膜内部分组成的TNFR1/RANK嵌合体的突变体,每一个突变体在RANK膜内部分含60bp缺失。再将RANK-cDNA第1561～1680bp之间的120bp片段分为10个片段,构建10个新的TNFR1/RANK突变体,每一个突变体在其RANK膜内部分含12bp缺失。用包装细胞PlatE分别将各突变体包装成逆转录病毒,通过感染分别将这些逆转录病毒转染到肿瘤坏死因子受体1和2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞（BMM）中。用TNFɑ刺激后、观察哪一个突变体不能诱导OC形成。【结果】首先发现表达TNFR1/RANK^1561-1620或TNFR1/RANK^1621-1680的逆转录病毒感染的BMM不能分化成OC,然后在RANK-cDNA第1561～1680bp这个大的片段中又发现表达TNFR1/RANK^1597-1608、TNFR1/RANK^1609-1620、TNFR1/RANK1621-1632或TNFR1/RANK^1633-1644的逆转录病毒感染的BMM也不能分化成OC。【结论】RANK-cDNA第1597～1644bp之间的48bp片段（5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3′）对OC形成起决定性作用。     

TNFR1／RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义

 【目的】构建肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）膜外部分和核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）跨膜及膜内部分相结合的嵌合体，探讨其在破骨细胞（OC）分化中的意义。【方法】克隆TNFR1／RANK嵌合体的cDNA，用plat E将其包装成逆转录病毒。通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFRl／R2基因的小鼠（TNFR1-／R2-）骨髓巨噬细胞（BMM）中；用TNFQ刺激，分别观察OC的分化及骨的重吸收能力；用Western Blot方法证实TNFR1／RANK是通过NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】在TNFa刺激下，BMM能分化成OC，而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFQ刺激BMM5min后磷酸化的NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】TNFR1／RANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能，可作为研究RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。     

TNFR1／RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义

【目的】构建肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）膜外部分和核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）跨膜及膜内部分相结合的嵌合体，探讨其在破骨细胞（OC）分化中的意义。【方法】克隆TNFR1／RANK嵌合体的cDNA，用plat E将其包装成逆转录病毒。通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFRl／R2基因的小鼠（TNFR1-／R2-）骨髓巨噬细胞（BMM）中；用TNFQ刺激，分别观察OC的分化及骨的重吸收能力；用Western Blot方法证实TNFR1／RANK是通过NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】在TNFa刺激下，BMM能分化成OC，而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFQ刺激BMM5min后磷酸化的NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】TNFR1／RANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能，可作为研究RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。     

基于MUC1细胞内段抗炎多肽的体外构建

【目的】 在前期证实粘蛋白1(MUC1)通过封闭TLRs信号通路抑制呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的呼吸道炎症的基础上,以TLRs细胞内段TIR结构域相互作用的结构特点为基础,通过生物信息学分析确定MUC1胞内段(MUC1 CT)抗炎多肽的候选区域,并构建各种候选区域的缺失突变体真核、原核表达载体,进而找出发挥抗炎作用的多肽片段,并在体外验证其抗炎效果。 【方法】 根据生物信息学技术预测分析MUC1 CT潜在的抗炎片段;构建MUC1 CT各种缺失突变体的真、原核表达载体,即pEGFP-C2-MUC1 CT mutants、pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants以及pET14b-MCS-SBP-EGFP-MUC1 CT mutants-TAT;转染pEGFP-C2-MUC1 CT mutants入A549细胞(来源于II型肺泡上皮细胞),利用荧光显微技术明确各绿色荧光蛋白标记的突变体蛋白的细胞内定位;转染pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants(无异常定位的突变体)入A549细胞,待MUC1 CT mutants高表达后,用RSV感染各组细胞一定时间后,使用ELISA方法测定细胞培养上清中TNF-α的水平,筛选发挥抗炎作用的多肽片段;在明确MUC1 CT的核心抗炎片段的基础上,转化pET14b-SBP-EGFP-MUC1 CT mutant入大肠杆菌(DE₃),体外表达并纯化含有穿透肽(TAT)的MUC1 CT突变多肽,预先与A549细胞孵育,再给予RSV感染,通过测定上清中的TNF-α的水平,进一步明确具有抗炎活性的片段。 【结果】 (1)通过生物信息学分析MUC1 CT,确定四处具有潜在抗炎活性的候选区域,分别是氨基酸位点7-14位,19-26位,36-40位,44-53位;(2)成功构建基于pEGFP-C2和pcDNA3-HA真核表达载体的四种缺失突变体的真核表达载体;(3)通过pEGFP-C2-MUC1 CT mutants明确各种突变体的细胞内定位情况;(4)利用pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants明确MUC1 CT的抗炎片段;(5)通过带有TAT的MUC1 CT突变多肽进一步证实该段的抗炎活性。 【结论】 MUC1 CT抗炎片段在体外实验中具有抗炎性。     

2型登革病毒诱导ECV304细胞凋亡及死亡受体的表达变化

【目的】探讨登革病毒诱导ECV304(人脐静脉内皮细胞)细胞凋亡与胞膜死亡受体TRAILR、TNFR、Fas的表达水平的相关关系及其意义。【方法】用2型登革病毒(Dengue Virus Type2,DV2)感染ECV304细胞,流式细胞技术检测ECV304感染前、后细胞凋亡变化及死亡受体TRAILR1-4、TNFR1-2、Fas的表达水平。【结果】登革病毒感染后ECV304细胞凋亡数增加,感染前细胞凋亡数约5%(9.46%±5.07%),而感染后约28%(24.31%±3.70%),感染前、后两组细胞凋亡数经t检验,P<0.05;病毒感染后细胞表达Fas百分比增加,感染前为41%(38.95%±8.50%),而感染后为79%(67.47%±10.05%),感染前、后Fas表达经t检验,P<0.05;而TRAILR1-4,TNFR1-2表达水平甚低,感染前后无明显改变。【结论】DV2感染可诱导血管内皮细胞凋亡,其凋亡与Fas/FasL的表达改变有关,但细胞凋亡的信号转导通路有待进一步研究。     

鉴定AP-4是在非激素依赖型前列腺癌中上调L-plastin表达的转录因子

【目的】鉴定AP-4是在非激素依赖型前列腺癌中调控L-plastin表达的转录因子，进一步阐明非激素依赖型前列腺癌的发病机制。【方法】在鉴定L-plastin启动子近3’端-216到1序列片段存在明显的转录活性的基础上，利用TFSEARCH软件分析该片段的序列，寻找可能调控L-plastin表达的非甾体激素类转录因子，并用凝胶滞后实验和超滞后实验证实结合于该片段的转录因子，利用PCR定点突变法构建删除该转录因子结合位点的重组子，并检测切除该片段序列后荧光素酶活性，研究该转录因子在非激素依赖型前列腺癌中调控L-plastin表达的作用。【结果】TFSEARCH软件分析表明在距转录起始点-199-194bp处含有AP-4转录因子结合位点CAGCTG，凝胶滞后实验和超滞后实验表明AP-4是结合于L-plastin启动子3’端序列CAGCTG的转录因子，删除AP-4结合位点后荧光素酶活性下降。【结论】AP-4是促进L-plastin在非激素依赖型前列腺癌中表达的重要调控因子。     

中国6个群体线粒体DNA Region V的缺失多态性

【目的】研究中国广东地区汉族、华东地区汉族、内蒙古汉族、云南白族、内蒙古蒙古族、新疆维吾尔族等6个群体在线粒体DNA Region V的多态性。【方法】PCR扩增后采用变性高效液相色谱技术分离片段，检测线粒体DNA Region V9 bp缺失的频率。【结果】在中国6个群体中发现标准型、缺失型和3型3种多态类型，9bp缺失频率在6个群体分别为21．4，18．0，14．0，16．9，7．0，10．4。【结论】中国6个群体在线粒体DNA Region V均存在9bp缺失的多态性，6个群体间的缺失频率存在差异。     

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c-myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT-PCR方法,获取目的基因,通过TA克隆方法克隆入pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c-myb基因片段已定向克隆入pDOR。细胞转染表明,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR-myb,产病毒滴度达5.2×104～9.5×104CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c-myb的重组逆转录病毒质粒,并建立其包装细胞株。     

肿瘤坏死因子受体基因转移增强TNF杀伤肿瘤细胞作用的研究

目的 :探讨肿瘤坏死因子受体 (TNFR)基因转移对肿瘤细胞表面 TNFR表达量的影响 ,进而观察其对TNF杀伤肿瘤细胞作用的影响。　方法 :建立 TNFR的逆转录病毒表达载体 ,通过转染包装细胞 PA 317产生完整病毒颗粒 ;人前列腺癌细胞株 PC- 3m和小鼠 Renca肾腺癌细胞株经病毒感染后 ,检测其细胞表面 TNFR数量及TNF在体内外对其杀伤作用的变化。　结果 :TNFR基因转移前后 PC- 3m细胞表面与 TNF结合的位点数量分别为 2 912个 /细胞和 8872个 /细胞 (P<0 .0 5 ) ,Renca细胞表面与 TNF结合的位点数分别为 783个 /细胞和 36 78个 /细胞 (P<0 .0 5 )。 TNFR基因转染后 ,TNF在裸鼠体内对 PC- 3m和 Renca的肿瘤抑制率分别增强 1.8和 2 .1倍。　结论 :以逆转录病毒为载体的基因转移方法 ,可以提高肿瘤细胞表面 TNFR的表达量 ,从而增强 TNF对肿瘤细胞的体外杀伤作用和体内抑制作用     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …