小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012) pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力.结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体.     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

小鼠Osf2／Cbfal基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。     

血红素氧化酶1基因重组腺病毒的构建

目的利用细茵内同源重组法构建含血红素氧化酶1基因的重组腺病毒.方法用限制性内切酶XhoⅠ HindⅢ从克隆载体PRH01中切出血红素氧化酶1基因片段,亚克隆至经Sal Ⅰ HindⅢ酶切的克隆质粒Puc18中,形成转移质粒Puc18-PRHO1,将之用KpnⅠ HindⅢ双酶切,再次亚克隆至经同样酶切的质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrackPuc18-PRHO1,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒,PacⅠ酶切后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒Ad-H01.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果利用CaCl2法由pAdTrack-Puc18-PRHO1和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态菌,可获得阳性重组体细菌克隆.PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为1.4×1010pfu/ml.结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法.所制备的重组体腺病毒Ad-H01在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对血红素氧化酶1的深入研究奠定了基础.     

人p16基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建含有人p16基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定.方法用基因工程技术将人p16基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果酶切鉴定及PCR结果证明p16基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6.1×1010pfu/ml,对人成纤维细胞有较强感染能力.结论应用细菌内同源重组方法成功构建了含人p16基因的重组腺病毒载体.     

人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况.方法 采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010 pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010 pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体.     

人ICOS胞外区腺病毒载体的构建与鉴定

目的利用细菌内同源重组法构建含ICOS胞外区基因的重组腺病毒。方法用基因工程的方法将ICOS胞外区的cDNA片段插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdtrack-cmv-ICOS,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,同源重组质粒PacⅠ酶切鉴定后用脂质体转染293细胞,包装成重组体腺病毒颗粒Ad-ICOS。采用PCR方法对重组腺病毒颗粒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。通过Western Blot检测重组腺病毒感染后的293细胞上清中的ICOS胞外区蛋白。结果获得了重组人ICOS胞外区腺病毒载体颗粒。PCR检测表明重组腺病毒颗粒含有目的基因,滴度为2.1×1010pfu/ml。Western Blot检测到阳性目的条带。结论细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的重组体腺病毒Ad-ICOS在体外能有效表达相应的基因产物,为今后对ICOS胞外区的深入研究奠定了基础。     

IP-10重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的利用细菌内同源重组法构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的!-干扰素诱导蛋白10(IP-10)重组腺病毒载体并制备重组腺病毒。方法将IP-10编码序列克隆入带有EGFP示踪的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-CMV/IP-10,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd/IP-10;酶切鉴定正确后转染HEK293细胞。收集病毒上清,PCR鉴定正确后,扩增并再次感染HEK293细胞检测病毒感染能力。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在HEK293细胞中包装成有感染活性的病毒颗粒。结论成功地构建了表达IP-10蛋白的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒Ad/IP-10,为研究IP-10的蛋白功能提供了一个重要工具。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

重组人hSERCA2a基因腺病毒载体构建和包装

目的：构建携带人肌浆网钙 ATP酶2 a（SERCA2 a）基因重组腺病毒载体,获得重组腺病毒 rAd-SER-CA2a-EGFP,为进一步在细胞和动物水平研究 SERCA2a基因的功能奠定基础。方法根据细菌内同源重组的方法,使用AdEasy腺病毒包装系统将人SERCA2a基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒pshuttle-CMV中,腺病毒穿梭质粒 pshuttle-CMV-SERCA2a线性化后与腺病毒载体 pAdEasy发生同源重组,通过脂质体共转染 HEK293细胞,产生重组腺病毒rAd-SERCA2 a,DNA测序鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定。结果通过酶切鉴定和DNA测序鉴定,证实重组腺病毒载体 pAdEasy-SERCA2a-EGFP构建成功,PCR鉴定扩增出2998 bp的目的条带,rAd-SERCA2a-EGFP滴度高达1×10^12μg/mL。结论成功构建和包装携带 hSERCA2a 基因的 rAd-SERCA2a-EGFP,为 SERCA2a基因治疗心力衰竭动物实验及临床试验研究奠定基础。     

High efficient generation of replication-defective adenoviruses containing thymidine kinase by homogeneous recombination in bacteria

Background Suicide gene therapy is a widely used molecular treatment for head and neck cancer. In this study, we try to use the method of homogenous recombination in bacteria to clone thymidine kinase gene (tk)–a kind of suicide gene to adenovirus backbone vectors for the construction of replication-defective adenoviruses. Methods pAdTrack-CMV/tk was constructed through subclone of a restriction endonuclease fragment including thymidine kinase gene from plasmid pCMV-tk to another plasmid pAdTrack-CMV, and then co-transfected with supercoiled pAdEasy-1, which was an adenoviral backbone vector except for deletions of E1 and E3, to competent E. coli BJ5183 for homogenous recombination using electroporation procedure. With the same method, pAdTrack-CMV was also co-transformed with pAdEasy-1 for homogenous recombination in BJ5183. Identified with restriction endonuclease PacI and polymerase chain reaction (PCR), plasmids pAd-GFP/tk and pAd-GFP were successfully constructed. Each of them was digested with PacI and sequently transfected into human embryo kidney 293 cells (HEK293) using Lipofectamine 2000.Results Comet-like adenovirus-producing foci of Ad-GFP/tk and Ad-GFP were observed after 5 to 7 days of cell culture. After twelve days of packaging, the replication-defective adenoviruses were collected. Identified with PCR, thymidine kinase gene was successfully constructed into Ad-GFP/tk.Conclusion The replication-defective adenoviruses containing thymidine kinase can be constructed more easily by homogenous recombination in bacteria than conventional techniques.     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达

目的：运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体，为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础。方法：采用基因技术，将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中，利用PAdEasy系统进行重组，然后在293细胞中进行扩增。并进行病毒滴度测定。体外感染人肾小管上皮细胞。结果：酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正确。结论：应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体。     

人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

PSD-95及其突变体的重组腺病毒对皮质神经元的感染

目的构建PSD-95（postsynaptic density-95）及其突变体PSD-95Y523F和PSD-95Y533F（523和533位酪氨酸分别突变成苯丙氨酸）的复制缺陷型重组腺病毒载体,并检测腺病毒颗粒对体外原代培养皮质神经元的感染能力。方法双酶切将PSD-95及其突变体的基因分别从载体peDNA3．1（＋）亚克隆至穿梭载体pAdTrack—CMV中;电穿孔法将穿梭重组体转化到电转感受态细胞BJ5183中,使其与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组;同源重组体经PacI酶切线性化,脂质体法转入HEK293H细胞中进行病毒包装;病毒颗粒分别感染HEK293T细胞和原代皮质神经元,荧光检测或免疫印迹方法检测目的蛋白的表达水平。结果经酶切电泳鉴定和序列测定证明同源重组体中含序列正确的目的基因;重组腺病毒颗粒感染HEK293T细胞后,免疫印迹显示有较高水平的目的蛋白表达;重组腺病毒具有感染原代皮质神经元的能力,在未成熟神经元（体外培养5—9天）中感染率低,而在成熟神经元（体外培养13天）中感染率较高。结论成功构建了PSD-95、PSD-95Y523F、PSD-95Y533F的重组腺病毒载体;获得具有感染能力的重组腺病毒颗粒,易于感染成熟的神经元。     

Ad.mda-7/IL-24的构建及在卵巢癌耐药癌细胞株中的感染表达

目的 利用Adeasy 1系统,构建并鉴定人mda-7/IL-24重组腺病毒(Ad.mda-7/IL-24).方法 从质粒pREP4-mda-7中扩增目的基因mda-7/IL-24,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒中,与pAdEasy 1质粒在E.coli BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体质粒,线形化后转染293细胞进行包装扩增得到Ad.mda-7/IL-24.感染人卵巢癌泰素耐药株OVCAR-8/TR,Western-blot检测感染后MDA-7/IL-24蛋白表达.结果 重组腺病毒载体经测序、酶切电泳及感染后蛋白表达检测均表明成功构建Ad.mda-7/IL-24;病毒感染量为10 μL时,感染OVCAR-8/TR细胞可达100%感染率.细胞感染后可表达MDA-7/IL-24目的蛋白.结论 成功构建了人Ad.mda-7/IL-24,并能有效感染卵巢癌耐药细胞株,为进一步研究mda-7/IL-24基因在卵巢癌耐药中的作用奠定了基础.     

携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。方法以带有人脂联素基因的质粒pINCY—APM1为模板,聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1,并将其定向克隆于真核表达载体pDC315-EGFP,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,经位点特异重组包装得到重组腺病毒Ad—APM1。通过Real—timePCR和Westernblot分别检测重组腺病毒Ad—APM1感染HEK293细胞后的表达。结果重组腺病毒Ad-APM1包装成功,病毒滴度〉6．3×10^12pfu／mL。Real—timePCR和Westernblot检测证实APM1在HEK293中表达。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。