miRNA 146a对软骨细胞MMP 13表达的影响

目的研究在正常软骨细胞及中期和晚期骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞中上调或下调miRNA 146a后基质金属蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13,MMP 13)的表达变化规律。探索miRNA 146a在骨关节炎发生、发展中的作用。方法收集正常人膝关节软骨4例,骨关节炎患者膝关节软骨12例。骨关节炎组又依据Kellgren-Lawrence的放射学诊断标准分为中期和晚期骨关节炎。通过化学转染的方法转染miRNA 146a mimic或miRNA 146a inhibitor于各组软骨细胞,测定上调或下调miRNA 146a后,MMP 13蛋白水平表达的变化。结果正常人软骨细胞中上调miRNA146a后,MMP13的蛋白水平较对照组及抑制组均出现明显的上升,结果具有统计学意义;下调miRNA146a后,MMP 13蛋白水平下降,结果没有统计学意义。中期OA软骨细胞表达MMP 13水平高于晚期OA软骨细胞,差异具有统计学意义。中期OA软骨细胞上调miRNA 146a后,MMP 13的蛋白水平上升,结果具有统计学意义;抑制miRNA 146a后,MMP 13的蛋白水平下降,结果具有统计学意义。晚期OA软骨细胞上调miRNA 146a后,MMP 13的蛋白水平上升,结果具有统计学意义;晚期OA软骨细胞抑制miRNA 146a后,MMP 13的蛋白水平下降,结果具有统计学意义。结论 miRNA 146a可调控软骨细胞MMP 13表达,从而参与骨关节炎的发生、发展。     

RNA干扰基因沉默单核细胞趋化蛋白-1干预动脉粥样硬化早期形成的研究

目的 观察单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、小干扰RNA(siRNA)、转染兔颈动脉粥样硬化(AS)模型对局部MCP-1表达及AS早期形成的影响.方法 建立28只雄性兔颈动脉AS模型,将MCP-1 siRNA真核表达质粒通过局部定位转染的方法至病变血管,病理形态学观察血管壁中泡沫细胞浸润及内膜增厚,免疫组织化学、逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测局部MCP-1表达.结果 模型对照组、空质粒组、RNA干扰(RNAi)组镜下内膜/中膜厚度(I:M)分别为5.55、5.27、1.46.免疫组织化学染色显示RNAi组着色较浅.RT-PeR及Western blot结果显示:RNAi组与模型对照组、空质粒组比较,局部MCP-1表达降低.结论 MCP-1 siRNA转染抑制了局部MCP-1表达,延缓了AS的发展,减轻了病变程度.     

小分子干扰RNA转染猪血管内皮细胞优化体系的建立

目的 探索建立高效、稳定的小分子干扰RNA(SiRNA)转染方案并建立优化的猪血管内皮细胞RNA干扰(RNAi)转染体系.方法 针对猪α1,3-半乳糖苷转移酶(α1,3-GT)基因合成数对SiRNA分子,运用不同转染体系(DOSPA、RiboJuice及Lipofectamine 2000)转染永生化猪血管内皮细胞系(PED).分别应用流式细胞术、台盼蓝拒染试验及乳酸脱氢酶释放试验评价干扰α1,3-GT作用下PED的α1,3-半乳糖残基(α-Gal)表达情况以及SiRNA-脂质体转染对PED生长的影响.结果 PED能有效发生特异性RNA干扰现象,且呈明显的剂量依赖性特征.SiRNA-1与脂质体RiboJuice在12 nmol/L∶6 μl时,干扰效果最佳(67.3%～89.5%),整体量效优于DOSPA及Lipofectamine 2000转染体系.靶细胞转染SiRNA-1后48 h时的α-Gal相对表达水平为10.5%,而SiRNA-2转染组则未见明显干扰现象.脂质体转染体系在转染后6～12 h对靶细胞生长稍有影响,24 h后细胞活性逐渐恢复.结论 猪血管内皮细胞存在RNA干扰机制,RiboJuice转染体系是一种高效、低毒的SiRNA转染方式,为研究RNAi在抑制异种排斥反应中的应用奠定了基础.     

补肾壮筋汤对兔早期实验性膝骨关节炎软骨细胞凋亡及增殖细胞核抗原表达的影响

目的:探讨以补肝益肾为治疗手段的补肾壮筋汤对兔早期膝关节实验性OA的软骨细胞凋亡和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:40只青紫蓝兔随机分为4组,每组10只,分别为中药组、假模组、模型组、正常组,参照Hulth法造成早期骨关节炎模型。术后第4周开始,中药组、假模组口服补肾壮筋汤,模型组、正常组口服生理盐水。7周末取兔膝关节软骨,肉眼、光镜、透射电镜观察形态学变化,用原位末端标记法(TUNEL法),免疫组化法分别观察软骨细胞凋亡和PCNA的表达。结果:中药组的软骨细胞凋亡指数小于模型组(P<0.05);而中药组的PCNA表达要高于其他各组(P<0.05)。结论:补肾壮筋汤减少兔早期膝关节实验性OA软骨细胞的凋亡,促进软骨细胞的增殖,对早期OA有治疗作用。     

RNA干扰对肝癌细胞乙酰肝素酶表达的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)对肝癌细胞株Hepal-6中乙酰肝素酶(HPSE)表达的抑制作用.方法 设计针对小鼠肝癌细胞Hepal-6 HPSE mRNA的小干扰RNA(siRNA),以阳离子脂质体LipofectamineTM 2000包埋后转染该细胞株,转染48 h后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测Hepal-6细胞HPSE mRNA及蛋白质表达的变化.结果 siRNA各组与正常对照组和阴性对照组比较,HPSE mRNA和蛋白质的表达均受明显抑制(P<0.01),并且呈剂量依赖性.结论 HPSE siRNA可显著抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6中HPSE mRNA和蛋白质的表达.     

微小RNA-27b-3p与基质金属蛋白酶13在人软骨细胞的对应关系

目的探讨微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)与基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在人软骨细胞表达及其靶向对应关系。 方法运用蛋白质印迹法(WB)与实时定量PCR技术(qRT-PCR)明确miR-27b-3p与MMP13在正常和骨关节炎(OA)人软骨细胞的表达。利用不同浓度的白介素(IL)1β干预原代人软骨细胞24 h,或利用不同时间点的IL-1β(10 ng/ml)干预原代人软骨细胞。利用原位杂交、转染及双荧光素酶报告技术确定miR-27b-3p与MMP13的靶向对应关系;结合运用核转录因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制剂评估其作用机制。两组资料比较采用独立样本t检验,多组资料比较采用单因素方差分析,LSD法多重比较检验。 结果WB、qRT-PCR和原位杂交检测结果显示,与正常软骨相比,OA软骨中miR-27b-3p表达降低(t＝5.07,P<0.01),MMP13表达升高(t＝－6.31,P<0.01)。IL-1β干扰后的结果显示miR-27b-3p表达降低(F＝129.54,P<0.05),MMP-13表达升高(F＝394.50,P<0.05)。通过TargetScan数据库和荧光素酶报告基因检测结果分析,野生型-MMP13组荧光素酶活性降低(F＝55.27,P<0.001),突变型-MMP-13荧光素酶活性变化没有统计学意义(P＝0.654)。利用特异性MAPK信号抑制剂和NF-kB抑制剂干预IL-1β诱导软骨细胞模型结果提示,与对照组相比,抑制剂组的MMP13表达水平降低(F＝28.43,P<0.001),miR-27b-3p表达水平增高(F＝35.04,P<0.001)。 结论miR-27b-3p在OA软骨细胞呈现低表达,并负向调控MMP13的表达,其作用机制可能是通过NF-κB和MAPK信号通路,这结果提示这miR-27b-3p可能作为OA诊断与治疗的潜在靶点。     

独活挥发油灌胃对兔膝骨关节炎的保护作用及其机制

目的探讨独活挥发油(VOOA)灌胃对兔膝骨关节炎(OA)的保护作用及其机制。方法 6月龄日本大耳白兔24只,采用右膝关节前交叉韧带切断术(ACLT)建立兔膝OA模型,随机分为4组:模型组(OA组)、假手术组(Sham组)、盐水组(ACLT+NS组)和VOOA组(ACLT+VOOA组),每组6只。ACLT+VOOA组术后予以VOOA 0.2 ml/(kg.d)灌胃,ACLT+NS组给予等量的生理盐水。8周后处死动物,采用肉眼观察各组软骨及滑膜组织,病理切片行HE染色并进行软骨Mankin评分;检测血清及关节液内白细胞介素1(IL-1)、生长转化因子β(TGF-β)的含量;免疫组织化学法测定软骨中IL-1、TGF-β的含量。结果 ACLT+VOOA组可见软骨破坏减轻,滑膜纤维增生减少,Mankin评分低于ACLT+NS组及OA组,差异有统计学意义(P<0.05);血清、膝关节滑液IL-1含量低于ACLT+NS组及OA组,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β表达量高于ACLT+NS组、OA组及Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 VOOA灌胃能够部分阻止兔OA关节软骨的退变,其机制可能为减少滑液中炎性介质IL-1的分泌、促进TGF-β的分泌,从而减轻滑膜炎症、缓解对软骨细胞的破坏。     

RNAi基因沉默MCP-1在颈动脉粥样硬化形成中的影响

目的 探讨MCP-1小干扰RNA(siRNA)转染兔颈动脉粥样硬化模型对局部MCP-1及动脉粥样硬化的影响.方法 用大白兔建立颈动脉粥样硬化模型,模型分为3组:RNAi组12只,AS模型组8只,空质粒组8只.观察3组血管壁中泡沫细胞浸润及内膜/中膜厚度(I:M)比值及局部MCP-1表达情况.结果 MCP-1 siRNA转染后,发现RNAi组的I:M(1.46±0.23)较AS模型组(5.55±0.30)和空质粒组(5.27±0.31)显著降低(P<0.01);MCP-1 si RNA表达载体转染使局部MCP-1表达降低;RNAi组的m RNA表达水平较AS模型组和空质粒组下降.结论 MCP-1 siRNA转染抑制了局部MCP-1表达,延缓了动脉粥样硬化的发展,减轻了病变程度.     

微小RNA-214-3p介导神经营养酪氨酸激酶受体2型通路调节血管内皮生长因子旁分泌在骨关节炎发展中的作用

目的:探讨微小RNA(miR)-214-3p在骨关节炎(OA)软骨细胞中的表达及其调节内皮细胞迁移和血管生成的机制。方法:选取2020年6月至2020年12月在郑州大学第一附属医院接受全膝关节置换的16例OA患者及12例无膝关节疾病但因创伤导致下肢截肢的患者分别作为OA组和健康组,获取软骨标本,提取软骨细胞。采用蛋白印...     

RNA干扰对兔血管平滑肌细胞bcl-2基因表达的影响

目的研究RNA干扰(RNAi)对兔血管平滑肌细胞(VSMCs)bcl-2基因表达的干扰效应。方法用脂质体法将构建的装载靶向bcl-2基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体(pshRNA-bcl-2质粒)转染VSMCs(基因组),以转染空载体的细胞和加DMEM的空白细胞作为对照,采用半定量RT-PCR和Westernblot法检测bcl-2基因的表达,用MTT法检测VSMCs生长情况。结果转染siRNA的表达载体可以抑制内源性bcl-2基因在转录和转译水平上的表达,基因组bcl-2的mRNA和蛋白表达较空载体组和空白对照组明显减少(P<0.01);基因组的VSMCs生长也较空载体组和空白对照组明显受到抑制(P<0.01)。结论载体介导的RNAi技术可明显抑制内源性bcl-2基因的表达和VSMCs生长。     

siRNA对肝癌HepG2细胞β-catenin表达和细胞增殖的抑制作用

目的 研究siRNA对肝癌HepG2细胞β-catenin基因表达,β-catenin蛋白翻译及细胞增殖的抑制作用.方法 利用RT-PCR检测β-catenin基因表达,WesternBlotting方法检测肝癌HepG2细胞株β-catenin表达和HepG2细胞增殖曲线的变化.结果 shRNA转染后1dA和B组β-catenin表达弱于C和D组,2dA和B组β-catenin表达更弱,3d几乎未见表达.A和B组问比较无显著差异(P>0.05),A,B与C、D组比较相差非常显著(P<0.01).A,B两处理组细胞转染后每天所检测抑制率均显著高于对照组(P<0.01),表明细胞经A、B处理后生长受到明显抑制;两处理组细胞生长抑制率5d内逐渐增高.A与B和C与D组间差异无统计学意义(P>0.05).加入siRNA的两实验组(A,B组)β-catenin蛋白表达明显较少,对照C,D组β-catenin蛋白表达较多,提示siRNA抑制了HepG2细胞的β-catenin蛋白表达.结论 针对β-catenin的sbRNA能够抑制β-cateninmRNA表达,使胞浆中的β-cateninmRNA下降,细胞β-catenin蛋白表达明显减少,HepG2细胞增殖受到明显的抑制,这种作用对临床肿瘤有潜在的治疗价值.     

血管内皮生长因子对关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)对体外培养的关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法 体外培养SD乳鼠关节软骨细胞,用白细胞介素(IL)-1β诱导的方法建立骨关节炎(OA)体外模型,实验分为4组,每组加入不同处理因素进行干预,A组:(正常对照组)不加任何处理因素;B组:10 μg/L VEGF;C组:10 μg/L IL-1β;D组:10 μg/L VEGF+ 10 μg/LIL-1β。采用实时荧光定量PCR( Real Time PCR)检测iNOS mRNA的表达,采用蛋白免疫印迹法( Western blot)检测iNOS蛋白的表达。结果 iNOS mRNA的表达:A组iNOS mRNA无表达,B组(9.64±1.64)、C组(17.27±2.01)及D组(28.93±6.63),3组的iNOS mRNA表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平明显高于B组(P＜0.01)及C组(P＜0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P＜0.05)。iNOS蛋白的表达:A组iNOS蛋白无表达,B组(0.44±0.12)、C组(0.74±0.07)及D组(1.38±0.38),3组的iNOS蛋白表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的蛋白表达水平明显高于B组(P＜0.01)及C组(P＜0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P＜0.01)。结论 在OA的发病过程中,VEGF可能通过上调软骨细胞iNOS的表达发挥重要作用。     

雾化吸人利多卡因对哮喘大鼠肺组织热休克蛋白70、核因子κB表达的影响

目的 观察利多卡因对大鼠支气管哮喘模型肺组织中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)、核因子κB(nuclear factor-kappe B,NF-κB)表达的影响.方法 Wistar大鼠32只,随机分为4组(n=8):对照组(A组)、哮喘组(B组)、地塞米松组(C组)、利多卡因组(D组).B组大鼠用鸡卵清蛋白辅以氢氧化铝为佐剂注射致敏,2周后雾化吸入鸡卵清蛋白诱发哮喘;C组、D组大鼠用同样方法致敏,但在激发前分别雾化吸入0.02%地寒米松和0.04%利多卡因20 ml;A组用生理盐水代替鸡卵清蛋白进行注射和吸入.末次雾化吸人后24 h内取肺组织,计算湿十重比(W/D)、观察肺组织病理学改变、免疫组化检测HSP70、NF-κB的表达.结果 ①B、C、D组W/D值分别为4.08±0.16、3.54±0.10和3.66±0.12,和A组3.30±0.12相比增加(P<0.05);②B、C、D组肺组织HSP70表达分别为0.210±0.018、0.138±0.010和0.154±0.012,和A组0.049±0.015相比表达上调(P<0.05);③B、C、D组肺组织NF-κB表达分别为0.199±0.029、0.132±0.010和0.150±0.017,和A组0.056±0.022相比表达上调(P<0.05);④和B组相比,C、D组W/D值、肺组织HSP70、NF-κB的表达下调(P<0.05).B组肺组织呈支气管壁增厚、炎性细胞浸润表现.C组、D组病理损伤程度减轻. 结论利多卡因雾化吸入可以减轻致敏原所激发的哮喘大鼠气道炎症和肺组织损伤.     

Comparison of differential biomarkers of osteoarthritis with and without posttraumatic injury in the Hartley guinea pig model

The objective was to compare biomarkers of articular cartilage metabolism in synovial fluid from Hartley guinea pig knees, with and without anterior cruciate ligament transection (ACLT), to establish whether detectable differences in biomarker levels exist between primary and secondary osteoarthritis (OA). Synovial fluid lavages and knees were obtained from 3‐month (control group) and 12‐month (primary OA group) animals. Another group of animals (posttraumatic OA group) underwent unilateral ACLT at 3 months, and samples were obtained 9 months postsurgery. Synovial fluid concentrations of stromal cell‐derived‐factor (SDF‐1), collagen fragments (C2C), proteoglycan (GAG), lubricin, matrix metalloproteinase‐13 (MMP‐13), and Interleukin‐1 (IL‐1β) were evaluated. Cartilage damage was assessed via histology. The highest concentrations of C2C and SDF‐1 in synovial fluid were found in the posttraumatic OA group, moderate concentrations were found in the primary OA group, and low concentrations in the control group. GAG release in synovial fluid was similar to C2C and SDF‐1. The lubricin concentrations were significantly lower in ACLT joints than either the control or 12‐month primary OA groups, but not between the control and primary OA groups. Higher levels of MMP‐13 and IL‐1β were detected in the joints of the posttraumatic OA group as compared to the control or primary OA groups. Histology revealed greatest OA damage in the posttraumatic OA group, followed by moderate and minimal damage in primary OA and control groups, respectively. This study indicates that the biomarkers and progression of OA may differ in the Hartley guinea pig models with and without posttraumatic OA. © 2010 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 28:900–906, 2010     

靶向MMP-2的RNAi抑制胰腺癌PANC-1细胞侵袭性的研究

目的 观察RNAi体外沉默胰腺癌PANC-1细胞MMP-2基因对胰腺癌细胞MMP-2表达及细胞侵袭能力的抑制作用.方法 设计靶向MMP-2的siRNA并构建到pGCsi-U6质粒,重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000转染PANC-1细胞,流式细胞仪检测质粒的转染率,RQ-PCR检测细胞MMP-2的mRNA表达水平;ELISA检测细胞MMP-2蛋白的分泌量;Transwell小室侵袭观察各组细胞侵袭能力;MTT比色法检测各组细胞增殖活性.结果 测序鉴定证实,干扰质粒构建成功,重组质粒转染率最高达82.1%.转染干扰质粒PANC-1细胞的MMP-2基因mRNA表达抑制了71.74%(P＜0.05);MMP-2蛋白分泌下降了49.82%(P＜0.05);细胞侵袭能力抑制率达33.0%(P＜0.05);细胞的增殖活性无明显变化(P＞0.05).结论 靶向MMP-2的RNAi能抑制胰腺癌PANC-1细胞的体外侵袭能力,提示MMP-2可以作为胰腺癌基因治疗的靶点,亟待RNAi能为肿瘤治疗开创崭新局面.     

RNA干扰下调NF-κB p65基因表达诱导胰腺癌细胞株PANC-1的凋亡

目的运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术下调胰腺癌细胞株PANC-1中NF-κB p65基因表达,并评价其对肿瘤细胞凋亡的影响。方法利用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）转染入胰腺癌细胞株PANC-1中。采用RT-PCR法测定细胞内NF-κB p65mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变,运用Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测p65基因表达下调对PANC-1细胞凋亡的影响。结果化学合成的人NF-κB p65 siRNA能有效地抑制PANC-1细胞中NF-κB p65mRNA的表达（P〈0．01）,同时ELISA结果显示,RelA siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组（P〈0．05）。Hoechst33258核染色、流式细胞仪和透射电子显微镜检测发现下调p65基因表达能够诱导PANC-1细胞的凋亡。结论体外实验初步证明了NF-κB p65基因在胰腺癌细胞凋亡调控方面扮演重要角色．通过沉默其表达可诱导胰腺癌细胞的凋亡．     

臭氧关节腔内注射治疗犬早期膝骨关节炎的最适低浓度

目的：通过建立家犬膝骨关节炎（osteoarthritis,OA）模型,比较3种低浓度医用臭氧关节腔内注射对0A治疗的最适浓度。方法健康雄性犬40只,随机分为A组（空气组）、B组（10 ug／ml医用臭氧组）、C组（20 ug／ml医用臭氧组）、D组（30 ug／ml医用臭氧组）,每组10只,左膝关节10只为N组（正常对照组）。采用Hulth制模,分别于造模前、造模成功时和处死前测定膝关节活动度,用硝酸还原酶法检测关节液中TNF－α含量。结果8周后A组膝关节活动度显著降低,B、C、D组治疗结束后较造模成功时增加,但C组较B、D组活动度明显增加（ P＜0．05）;4组右侧膝关节均出现关节软骨病理损害, A组最严重,C组软骨病变最轻;关节液中TNF－α含量C组比A、B、D组明显降低,有统计学意义（P＜0．05）。结论20μg／ml臭氧组能够减轻炎症反应,增强机体清除自由基的能力,抑制TNF－α细胞因子表达,从而减轻退行性关节炎软骨退变。     

溴隐亭联合肿瘤坏死因子-α对人肝癌耐药细胞株化疗敏感性的影响

目的 研究溴隐亭联合肿瘤坏死因子-α（TNF—α）基因处理人肝癌耐药细胞株HepG2／ADM后对其化疗敏感性的影响。方法 脂质体转染TNF-α基因至肝癌耐药细胞HepG2／ADM;实验分4组：空白对照组HepG2（A组）、耐药组HepG2／ADM（B组）、转染TNF—α基因组（C组）及联合溴隐亭和TNF—α组（D组）;流式细胞仪检测各组罗丹明123细胞内潴留率变化、四唑盐比色法（MTT）检测C、D两组细胞耐药指数及用免疫组织化学染色、Western blot和RT—PCR方法测定各组PKC-α、P-gP蛋白、MDR1 mRNA表达的变化,流式细胞仪检测Bcl-2蛋白的表达,AnnexinV-FITC,PI双标检测各组肿瘤细胞化疗后凋亡的变化。结果 MTT测定C、D两组之间耐药逆转率有显著差异（P〈0.01）,罗丹明123潴留率实验发现C、D两组均能明显增强其潴留作用且两组差异有统计学意义（P〈0．01）;P-gP蛋白和MDR1基因表达显示C、D两组之间MDR1基因和P—gp蛋白的表达无统计学意义（P〉0．05）,但C、B两组之间比较差异有统计学意义（P〈0．01）;PKC—α蛋白表达在D组明显下调（P〈0．01）;B组细胞Bcl-2蛋白表达明显增强,C、D两组细胞Bcl-2蛋白表达明显下调,与A组比较均有统计学意义（P〈0．01）,但C、D两组细胞Bcl-2蛋白表达无统计学意义（P〉0．05）。细胞凋亡率C、D两组比较有统计学意义（P〈0．01）,D、A两组比较无统计学意义（P〉0．05）。结论 溴隐亭和TNF—α通过不同的机制逆转肿瘤的多药耐药性,两者联合明显加强抗肿瘤药物对细胞的毒力。