小檗碱抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞增殖及其分子机制

目的探讨小檗碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制作用及其相关信号通路改变。方法体外培养HUVEC,以ox-LDL刺激增殖并以不同浓度小檗碱干预,采用细胞计数试剂盒8与Ed U掺入实验检测小檗碱对HUVEC增殖的抑制作用,通过实时荧光定量PCR及Western blot分析相关基因和蛋白表达及信号通路变化。结果小檗碱(1~50 mg/L)呈浓度依赖性显著抑制ox-LDL诱导的HUVEC增殖,并降低增殖细胞核抗原(PCNA)、核因子кB(NF-κB)、凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)的表达;该作用与PI3K/Akt、ERK1/2及p38MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平降低相关。结论小檗碱通过下调PCNA、NF-κB与LOX-1表达从而抑制ox-LDL诱导的HUVEC增殖,PI3K/Akt、ERK1/2及p38MAPK信号通路参与其中。     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞功能及膜表面超微结构的影响

目的 观察人脐静脉内皮细胞在发生脂质过氧化过程中细胞功能及超微结构改变的规律和特点.方法 用100 mg/L氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞作为实验组,以与氧化型低密度脂蛋白等体积的PBS替代作为对照组,两组均连续培养0、4、8及16 h;用MTT比色法测定并比较各组细胞的增殖状态,用硝酸还原法测定各组细胞上清液中一氧化氮含量,用原子力显微镜对比观察各组贴壁人脐静脉内皮细胞表面的超微结构.结果 随着氧化型低密度脂蛋白诱导时间的延长,实验组人脐静脉内皮细胞的增殖和功能明显减低,细胞表面隆起逐渐增大,分布越来越不规则,并伴随有凹陷或空洞出现;对照组随着培养时间的延长细胞表面结构变化不大.实验组0、4、8及16 h粗糙度分别为13.666±2.196 nm、15.904±2.203 nm、17.688±2.076 nm及21.609±1.867 nm,亚组间两两相比均存在显著性差异(P＜0.05);而对照组0、4、8及16 h粗糙度分别为13.627±2.218 nm、13.659±2.183 nm、13.665±2.175 nm及13.974±2.478 nm,亚组间两两相比无显著性差异(P＞0.05);与对照组相比,实验组细胞培养4 h后膜表面粗糙度存在显著性差异(P＜0.05).结论 内皮细胞在发生脂质过氧化过程中功能逐渐减退,且表面超微结构在较早期就发生了改变,并随时间推移呈现动态变化.     

血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因沉默抑制人脐静脉内皮细胞表达分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1

目的探讨血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因沉默后能否抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的表达。方法分别用不同浓度的氧化型低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共孵育,及预先对人脐静脉内皮细胞转染pGenesil-1 LOX-1 shRNA后再用氧化型低密度脂蛋白刺激,半定量RT-PCR、Western blot及酶联免疫吸附法检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1、分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的mRNA和蛋白表达。结果氧化型低密度脂蛋白能呈浓度依赖性诱导血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1、分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。用RNA干扰抑制血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1的表达后,显著抑制了氧化型低密度脂蛋白诱导的分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。结论氧化型低密度脂蛋白能呈浓度依赖性诱导人脐静脉内皮细胞中分形趋化因子和单核细胞趋化蛋白1表达;这种诱导作用可以被血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因沉默抑制。     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞TET2表达及自噬的影响

目的 观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞自噬的影响及其调节机制.方法 氧化型低密度脂蛋白孵育人脐静脉内皮细胞24 h,RT-PCR检测TET2 mRNA表达,Western blot检测TET2以及自噬标记物Beclin 1、LC3的表达.TET2 siRNA转染人脐静脉内皮细胞,Western blot检测Beclin 1、LC3的表达.结果 人脐静脉内皮细胞经不同浓度氧化型低密度脂蛋白孵育24h后,浓度依赖性地下调TET2 mRNA以及蛋白的表达(P＜0.05),并且下调Beclin 1表达以及LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值.TET2 siRNA转染人脐静脉内皮细胞后,Beclin 1表达以及LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值明显降低.结论 氧化型低密度脂蛋白促进人脐静脉内皮细胞自噬,可能与下调TET2表达相关.     

ATP对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用及其可能机制

目的 观察胞外核苷酸ATP对人脐静脉内皮细胞增殖活性及其生物学功能的影响,并初步探讨其可能机制.方法 通过CCK-8细胞增殖试验检测不同浓度的ATP(0、 1、5、10、50和100 μmol/L)持续干预脐静脉内皮细胞 3天及ATP(50 μmol/L)不同时间段干预(1～6天)对脐静脉内皮细胞细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测不同浓度的三磷酸腺苷诱导脐静脉内皮细胞凋亡情况及对其细胞生长周期的影响;通过RT-PCR对脐静脉内皮细胞表达的P2受体亚型进行检测,检测不同浓度的ATP(0、5、10、50和100 μmol/L)对脐静脉内皮细胞表达P2Y2、P2Y11,细胞周期素cyclinB1、cyclinD1及细胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子1和内皮型一氧化氮合酶的影响.结果 与对照组比较,三磷酸腺苷在高浓度(50和100 μmol/L)持续作用于脐静脉内皮细胞 3天后显著抑制生长(P<0.01),终浓度50 μmol/L的ATP呈时间依赖性抑制脐静脉内皮细胞生长.不同浓度的ATP对脐静脉内皮细胞凋亡均无明显影响,但在高浓度时可显著增加S期的细胞比例和减少G2/M期的细胞比例从而将细胞周期阻滞在S期;静止状态下,脐静脉内皮细胞表达P2X-4,5和P2Y-2,4,11,13,14;三磷酸腺苷各浓度组均能明显上调脐静脉内皮细胞细胞间粘附分子1和血管细胞粘附分子1的表达,仅在高浓度时上调P2Y2,11、eNOS的表达和下调cyclinB1表达,而对表达cyclinD1的影响不明显.结论 胞外核苷酸三磷酸腺苷在高浓度(50和100 μmol/L)时可能通过受体P2Y2和P2Y11下调cyclinB1表达,使细胞周期从S期向G2/M期的转变受阻,从而抑制脐静脉内皮细胞生长,并且促进脐静脉内皮细胞表达动脉粥样硬化相关因子.     

生长素对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响及机制

目的观察生长素对血管紧张素Ⅱ所致的脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响。方法采取不同浓度的血管紧张素Ⅱ(10-9~10-6mol/L)刺激脐静脉内皮细胞24 h,获取最佳浓度(10-6mol/L)后用此浓度的血管紧张素Ⅱ分别刺激脐静脉内皮细胞0、6、12和24 h,观察脐静脉内皮细胞的增殖和迁移;并观察生长素(10-9~10-6mol/L)预处理2 h后与10-6mol/L血管紧张素Ⅱ共同孵育24 h和10-6mol/L生长素预处理0、0.5、1和2 h后与10-6mol/L血管紧张素Ⅱ共同孵育24 h对脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响。加入丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路阻滞剂PD98059(25μmol/L)、生长激素促分泌素受体1 a阻断剂([Dys3]GHRP-6 25μmol/L)预处理人脐静脉内皮细胞,观察其对生长素影响血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞增殖和迁移的作用。水溶性四氮唑8法测细胞增殖,Transwell小室测细胞迁移,免疫印迹法测细胞中细胞外信号调节激酶1/2、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达。结果血管紧张素Ⅱ呈浓度和时间依赖性促进内皮细胞迁移和增殖。生长素抑制血管紧张素Ⅱ引起的内皮细胞迁移和增殖呈浓度和时间依赖性。PD98059(25μmol/L)预处理可以抑制血管紧张素Ⅱ促内皮细胞增殖作用,[Dys3]GHRP-6(25μmol/L)预处理阻断生长素对内皮细胞迁移和增殖的抑制作用。生长素可减少磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的表达。结论生长素可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞增殖和迁移,其机制涉及细胞外信号调节激酶1/2途径。     

氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞Connexin40表达的影响

目的:研究氧化低密度脂蛋白(OxidizedLDL,Ox-LDL)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白(Gap junction protein)Connexin40基因表达的影响。方法:不同浓度Ox-LDL的干预:体外培养的内皮细胞分为4组:对照组,50mg/L,100mg/L,200mg/LOx-LDL干预组,干预24小时后通过RT-PCR方法检测各组Connexin40基因mRNA的表达有无差异;不同时间Ox-LDL干预的内皮细胞分为对照组,50mg/L的Ox-LDL干预6小时、12小时、24小时、48小时和72小时组共6组,通过RT-PCR方法检测各组Connexin40 mRNA的表达有无差异;蛋白表达水平的检测:通过免疫细胞化学方法检测对照组和100mg/LOx-LDL干预组之间Connexin40蛋白的表达水平有无差异。结果:不同浓度(50mg/L,100mg/L,200mg/L)的Ox-LDL干预24小时能引起内皮细胞Connexin40mRNA的表达增加(P<0.01);50mg/L的Ox-LDL干预不同时间后Connexin40mRNA表达增加,以6小时和12小时最明显(P<0.01);100mg/L的Ox-LDL干预24小时内皮细胞Connexin40蛋白表达增加(P<0.01)。结论:Ox-LDL短期干预可引起人脐静脉内皮细胞Connexin40基因的mRNA和蛋白表达水平增加。     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞细胞黏附分子-1及一氧化氮表达的影响

一氧化氮 (NO)作为一种作用广泛的信息分子 ,具有抑制血小板和单核巨噬细胞的黏附 ,内皮细胞和平滑肌细胞增殖的作用 ,与动脉粥样硬化 (AS)关系密切。已有众多实验表明白细胞和T淋巴细胞黏附到内皮细胞表面 ,接着迁移到内皮下层是AS最早的细胞事件之一 ,在这个过程中细胞间黏附分子 1(ICAM 1)起了很重要的作用。我们于2 0 0 1年 11月至 2 0 0 2年 6月采用脐静脉内皮细胞为实验 ,用氧化修饰低密度脂蛋白 (ox LDL)作用于该细胞 ,了解其对NO、一氧化氮合酶 (NOS)及ICAM 1表达的影响及ox LDL致AS的可能机制。　　一、材料与方法　…     

过表达Syndecan-4促进人脐静脉内皮细胞增殖

目的 内皮细胞增殖在血管新生中起着非常重要的作用.本研究拟观察过表达Syndecan-4对人脐静脉内皮细胞的促增殖作用并对其相关机制进行探讨.方法 分离和培养人脐静脉内皮细胞,分别将过表达Syndecan-4的腺病毒、空病毒转染至人脐静脉内皮细胞,用免疫染色法观察人脐静脉内皮细胞的Syndecan-4的表达水平和自聚现象,用Western blotting方法检测人脐静脉内皮细胞内Akt、内皮细胞氮氧化物合酶蛋白磷酸化的水平;用磷酸化组蛋白3、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷法观察人脐静脉内皮细胞的增殖情况.结果 与对照组相比,转染Syndecan-4组的人脐静脉内皮细胞增殖明显活跃,Syndecan-4表达明显增加,且存在自聚现象;Western blotting检测发现,Akt、内皮细胞氮氧化物合酶磷酸化水平较对照组明显升高.结论 过表达人脐静脉内皮细胞Syndecan-4可诱导Syndecan-4自聚,并可能通过活化下游Akt、内皮细胞氮氧化物合酶,促进人脐静脉内皮细胞的增殖.     

VEGF对体外培养的脐静脉内皮细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外培养的脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和迁移能力的影响。方法以VEGF基因转染HUVECs和在培养液中加入VEGF蛋白后培养HUVEC,用RT-PCR法检测VEGF mRNA的表达鉴定转染的效果,用3H-TdR掺入法检测VEGF对HUVECs增殖的影响,用划痕实验观察VEGF对HUVECs迁移能力的影响。结果转染VEGF基因的HUVECs中VEGFmRNA的表达高于对照组,表明转染成功。3H-TdR掺入法和划痕实验显示,转染VEGF基因和在培养液中加入VEGF蛋白,都可促进体外培养的HUVECs增殖和迁移。结论VEGF能够促进体外培养的HUVECs增殖和迁移;将VEGF基因导入细胞与直接在培养基中加入VEGF蛋白具有相同的效果。     

辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体的表达

目的观察辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体表达的作用。方法培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,随机分组:对照组、低密度脂蛋白(25 mg/L)组、氧化型低密度脂蛋白(255、0和100 mg/L)组和氧化型低密度脂蛋白(50 mg/L) 辛伐他汀(1和10μmol/L)组,通过逆转录聚合酶链反应和Western blot蛋白印迹分析检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体mRNA和蛋白的表达,并在相差显微镜下观察细胞形态变化。结果氧化型低密度脂蛋白上调血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体表达(P<0.01),并呈浓度依赖性(P<0.05)。辛伐他汀明显抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体表达(P<0.05),且高浓度组较低浓度组的抑制作用更强(P<0.05)。结论氧化型低密度脂蛋白可能通过血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体导致内皮功能障碍,辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白诱导血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体的表达是其非调脂抗动脉粥样硬化机制之一。     

氧化型低密度脂蛋白及阿托伐他汀对培养的人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶2表达的影响

目的探讨氧化型低密度脂蛋白对人血管内皮细胞血管紧张素转化酶2表达的影响及阿托伐他汀的干预作用。方法用正常人新鲜血浆制备氧化型低密度脂蛋白,人脐静脉内皮细胞株复苏、传代后取生长良好3~6代用于实验。分为空白对照组、不同浓度氧化型低密度脂蛋白组(终浓度分别为20、40及80 mg/L)、不同浓度阿托伐他汀组(1、5和10μmol/L)、不同时间组(40 mg/L氧化型低密度脂蛋白和5μmol/L阿托伐他汀分别刺激6、12和24 h及混合刺激组(5μmol/L阿托伐他汀 40 mg/L氧化型低密度脂蛋白刺激24 h)。提取细胞总RNA及蛋白,逆转录聚合酶链反应检测血管紧张素转化酶2 mRNA的表达,免疫印迹法检测血管紧张素转化酶2蛋白的表达。结果氧化型低密度脂蛋白呈剂量和时间依赖性下调血管紧张素转化酶2 mRNA及蛋白的表达。与空白对照组比较,不同浓度氧化型低密度脂蛋白组血管紧张素转化酶2 mRNA的表达分别降低为73%、51%和33%,蛋白的表达降低为81%、50%及32%,不同浓度组间比较差异亦有显著性(P>0.01);氧化型低密度脂蛋白培养6、12和24 h时间组血管紧张素转化酶2 mRNA与对照组比较分别减少为66%、55%和50%,蛋白的表达与对照组比较降低为63%、53%及49%(P>0.01)。不同浓度阿托伐他汀及其培养不同时间组血管紧张素转化酶2 mRNA和蛋白的表达与对照组比较差异无统计学意义。阿托伐他汀能抑制氧化型低密度脂蛋白对血管紧张素转化酶2 mRNA和蛋白表达的下调,mRNA表达增加为1.63倍,蛋白表达增加为1.60倍(P>0.01)。结论氧化型低密度脂蛋白呈剂量和时间依赖性下调血管紧张素转化酶2 mRNA和蛋白的表达,阿托伐他汀能抑制这种作用。     

5脂氧合酶激活蛋白介导人脐静脉内皮细胞氧化损伤

目的探讨5脂氧合酶激活蛋白在人脐静脉内皮细胞氧化损伤中的机制。方法体外分离、培养人脐静脉内皮细胞,分别用10、50、100和200mg/L氧化型低密度脂蛋白处理细胞24h,采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液白三烯C4水平,MTT法检测细胞活力,以及实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞5脂氧合酶激活蛋白mRNA及蛋白表达的变化。结果100mg/L和200mg/L氧化型低密度脂蛋白作用人脐静脉内皮细胞24h细胞活力显著下降(P<0.01),白三烯C4分泌显著增加(P<0.01),回归分析显示白三烯C4释放量与氧化型低密度脂蛋白浓度显著相关(r=0.953,P<0.01)。PCR和Western blot分析发现,5脂氧合酶激活蛋白mRNA表达和蛋白表达均显著增强(P<0.01和P<0.05)。结论氧化型低密度脂蛋白促进人脐静脉内皮细胞分泌白三烯C4,导致人脐静脉内皮细胞氧化损伤可能与5脂氧合酶激活蛋白异常表达有关。     

氧化型低密度脂蛋白下调Rab4表达诱导人脐静脉内皮细胞自噬

目的 探讨Rab4对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞自噬的影响及其作用机制.方法 不同浓度氧化型低密度脂蛋白孵育人脐静脉内皮细胞24h,Western blot检测Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达,逆转录-聚合酶链反应及Western blot检测Rab4 mRNA及蛋白表达.75 mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育Rab4基因转染人脐静脉内皮细胞(siRNA或Rab4质粒转染)24 h,Western blot检测Rab4、Beclin-1、LC3蛋白的表达.结果 氧化型低密度脂蛋白孵育人脐静脉内皮细胞24h后,Beclin-1蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明显增加,而Rab4 mRNA以及蛋白的表达明显降低(P＜0.05),并呈浓度依赖性.Rab4 siRNA进一步增加氧化型低密度脂蛋白诱导的Beclin-1蛋白表达量以及LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值(P＜0.05),而Rab4质粒转染则下调氧化型低密度脂蛋白诱导的Beclin-1蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值增加(P＜0.05).结论 氧化型低密度脂蛋白通过下调Rab4表达诱导血管内皮细胞自噬.     

高表达整合素连接激酶促进脐静脉内皮细胞增殖

目的探讨高表达整合素连接激酶对体外培养人脐静脉内皮细胞增殖的影响。方法利用高表达整合素连接激酶的腺病毒转染脐静脉内皮细胞,诱导其在脐静脉内皮细胞中高表达。采用噻唑蓝法、流式细胞术、EDU法检测脐静脉内皮细胞增殖能力;Western blot检测脐静脉内皮细胞蛋白激酶B(Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及其蛋白磷酸化水平。结果整合素连接激酶在脐静脉内皮细胞高表达后,噻唑蓝法、流式细胞术、EDU法检测结果均表明:整合素连接激酶病毒转染组细胞增殖能力明显高于空病毒转染对照组(P<0.05或P<0.01)。Western blot检测发现整合素连接激酶病毒转染组蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.05),而蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶的表达水平两组间无差异。结论整合素连接激酶能促进脐静脉内皮细胞增殖,其机制可能通过激活下游Akt/eNOS通路。     

泽泻汤对氧化型低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察泽泻汤对血管平滑肌细胞(VSMC)周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E、增殖细胞核抗原(PCNA)和p27表达的影响,探讨泽泻汤在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的VSMC增殖中的作用和机制。方法通过体外50 mg/L ox-LDL诱导VSMC,建立VSMC增殖的动脉粥样硬化细胞模型;应用空白血清及20%泽泻汤含药血清干预。MTS法检测泽泻汤含药血清对VSMC增殖的影响;Western blot检测增殖相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E、PCNA和p27表达水平。结果 50 mg/L ox-LDL可明显诱导VSMC增殖。与ox-LDL组比较,泽泻汤含药血清可显著抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖,下调细胞Cyclin D1、Cyclin E和PCNA的表达,同时促进p27蛋白表达。结论泽泻汤具有抗VSMC增殖的作用,机制可能与上调p27蛋白和抑制Cyclin D1、Cyclin E、PCNA表达有关。     

血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1介导氧化型低密度脂蛋白促进血管平滑肌细胞表达白细胞介素6

观察氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞白细胞介素 6表达的影响及血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1在其中的作用。人脐带动脉平滑肌细胞体外原代培养 ,传至 4～ 5代。氧化型低密度脂蛋白干预 ,观察不同时间点白细胞介素 6mRNA表达 ,及不同浓度氧化型低密度脂蛋白对白细胞介素 6和血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1mRNA表达的影响。并观察血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1抑制剂多聚肌酐酸对白细胞介素 6mRNA表达的影响。结果发现 ,(1)氧化型低密度脂蛋白作用后 ,白细胞介素 6mRNA表达显著升高 ,作用 6h出现峰值。随着氧化型低密度脂蛋白浓度升高 ,白细胞介素 6mRNA和血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1mRNA表达均明显升高 ,后两者呈正相关 (r=0 .94 3,P <0 .0 1)。 (2 )多聚肌酐酸抑制血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1后 ,白细胞介素 6mRNA表达明显下降。以上表明氧化型低密度脂蛋白明显促进血管平滑肌细胞白细胞介素 6的表达 ,血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体 1在此过程中起重要介导作用。