人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定

目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblottin...     

人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。 方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定。 结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性。 结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

人源抗Rh(D)单链抗体基因的克隆和表达

目的:构建人源抗红细胞Rh(D)抗原单链噬菌体抗体库。方法:应用噬菌体展示技术,从分泌抗Rh(D)抗体的细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,多次PCR扩增和克隆抗体可变区基因(VH/VLcDNA),经重叠延伸拼接(SOE)用编码连接肽(Gly4Ser)3的互补序列组成scFv基因,经酶切克隆入载体pCANTAB5E,使之呈现于噬菌体表面。使用完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,ELISA对所获抗体进行初步鉴定。结果:构建的噬菌体抗体库库容为1.2×107,噬菌体DNA中全长scFv基因的插入率为0.80,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为3×108pfu/ml的初级噬菌体抗体库。以完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,出现特异性富集。经DotELISA实验鉴定,得到1株与Rh+型红细胞特异结合的scFv噬菌体抗体。结论:运用噬菌体抗体库技术构建了人源抗红细胞Rh(D)抗原的噬菌体抗体库,为进一步对所获克隆株进行序列分析、可溶性抗体表达和纯化奠定了基础。     

人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab噬菌体抗体库的筛选与鉴定

目的从已构建的人源性抗血小板膜糖蛋白（glycoprotein,GP）Ⅱb/ⅢaFab噬菌体抗体库中筛选人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab抗体,并对特异性阳性克隆进行鉴定。方法以表达GPⅡb/Ⅲa的CHO123细胞包板,对人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab噬菌体抗体库进行富集筛选,采用细胞ELISA法筛选特异性阳性克隆,用Western blot法鉴定表达蛋白与GPⅡb/Ⅲa结合的特异性,将阳性克隆进行扩增、测序。结果以CHO123细胞富集淘筛3轮,并用ELISA法检测到2个高亲合力的特异性识别血小板膜GPⅡb/Ⅲa的克隆,Westernblot鉴定结果显示在阳性克隆的培养上清和细菌冻融上清均有特异性条带出现。对核苷酸序列进行同源性分析,证实这两个克隆轻链基因与人免疫球蛋白κ轻链的同源性分别高达97%和98%,重链基因与人免疫球蛋白Fd段的同源性分别高达94%和93%。结论利用噬菌体抗体库技术,成功地从人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab抗体库中筛选出抗血小板膜GPⅡb/Ⅲa的特异性阳性克隆,该克隆具有较高的特异性,其克隆基因符合抗体可变区结构特点。     

抗日本血吸虫噬菌体抗体库的筛选和阳性克隆的测序

目的：探索制备抗日本血吸虫循环抗原的单链抗体的新方法。方法：用日本血吸虫成虫代谢抗原对已构建的抗日本血吸虫噬菌体抗体库进行富集，然后用ELISA法从富集的抗体库中筛选阳性克隆，然后借助ELISA、SDS-PAGE和Western blot等方法对阳性克隆表达产物进行了特异性鉴定，最后对阳性克隆插入片段进行了测序和序列分析。结果：从随机挑取的72个克隆中筛选到阳性克隆6个，经交叉筛选和鉴定最终获得特异性抗日本血吸虫阳性克隆2个。测序和序列分析结果也证实：阳性克隆插入片段推导的氨基酸序列具有典型的抗体可变区特征。结论：用固相富集和ELISA筛选法可以从抗体库中有效地筛选到抗日本血吸虫循环抗原的阳性克隆。     

抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子...     

人抗HBs轻链基因的序列测定及序列分析

目的:获得人源性乙型肝炎病毒抗HBs轻链基因.方法:从已构建的人源性噬菌体抗体库中,用固相化HBs/Ag对构建的人源性噬菌体抗体库进行三轮淘筛,经ELISA实验,筛选到抗HBs噬菌体抗体(P/N:2.415)的阳性克隆,根据已知序列合成一对轻链引物,进行PCR扩增,扩增出轻链目的基因片段,将目的基因片段定向克隆入质粒pUC18,进行序列测定及分析.结果:筛选出的克隆具有HBsAg特异性亲和力,构建了pUCl8-抗HBsk链重组质粒,序列分析其为κ链,为643bp包括了可变区和恒定区.结论:利用抗原抗体特异性反应从噬菌体抗体库中筛选到抗HBs轻链基因.     

从汉坦病毒吸附的特异性B淋巴细胞扩增人抗体可变区基因

从肾综合征出血热恢复期患者外周血中分离人外周血单个核细胞(hPBMNs)贴壁除去吞噬细胞及粒细胞,用汉坦病毒76-118株包被的6孔板吸附分泌抗出血热抗体的特异性B淋巴细胞,提取该种细胞总RNA后,反转录成cDNA,用人抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因的通用引物扩增出VH及VL基因,为今后用噬菌体抗体库技术制备抗汉坦病毒抗体等研究工作奠定了基础。     

抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325 bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×10<'8>的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到M,约为30000 ku,纯度较好的scFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.     

从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv

目的从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体(scFv),测定其特异性结合活性并进行基因序列分析。方法以混合分子量人表皮角蛋白包被固相,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经4轮“吸附洗脱扩增”后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对阳性克隆抗体基因进行DNA指纹分析及序列同源性分析。结果经4轮筛选,获得9株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆,酶切鉴定正确后,经DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因。结论利用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

引导选择抗细胞表面分子单链抗体

目的用引导选择方法从抗KGla细胞的噬菌体展示抗体库中分离单链抗体.方法首先用KGla细胞吸附法富集抗体库3轮或未富集,再分别用抗CD34单克隆抗体为引导分子进行引导选择,分离单克隆后用免疫荧光和流式细胞术鉴别其细胞结合特异性.酶联免疫吸附法分析部分克隆与CD34抗原的结合,并对10个阳性克隆进行DNA序列分析.用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹,鉴别其抗原分子量.结果从144个经3轮富集和引导选择的单菌落中挑选出100个阳性单克隆,从96个未经富集的文库中引导选择出2个阳性克隆.102个阳性克隆中47个可识别KGla、HL60、U937、和CEM细胞(KGla 、HL60 、U937 、CEM ),55个只识别KGla细胞(KGla 、HL60-、U937-、CEM-).其中28个只识别KGla细胞的单克隆经ELISA检测均不结合CD34抗原.10个阳性克隆的DNA序列分析显示来自4种不同克隆,所结合的抗原显示不同的分子量.结论从抗KGla单链抗体库分出102个能识别造血干细胞和祖细胞的阳性克隆,引导选择在改进筛选效率方面具有优越性.     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库,并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集,挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库,库容为 １０６,并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能,抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

Isolation of human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by immobilized metal affinity chromatography

Objective To isolate human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by a new method of panning phage antibody library based on immobilized metal affinity chromatography （1MAC）. Methods Phage antibody library was allowed to mix with hex-His tagged expressed HEV specific antigen, NE2, in solution for adequate binding before affinity resin for hex-His was added. The non-specific phage antibodies were removed by extensive washing and the specific bound phage antibodies could then be eluted to infect TG1 or repeat the binding process for subsequent rounds of purification. The specificity of the selected human antibodies were tested by antigen competitive ELISA, human sera blocking ELISA, scFv expression, and sequence analysis. Results His-NE2 specific recombinant phages were successfully enriched after panning procedure. Two individual phage clones, 126 and 138, showed 50% inhibition in NE2 antigen competition ELISA and obvious blocking effect by HEV positive serum in blocking ELISA. Soluble scFv of 126, 138 bound to NE2 specifically. Conclusion Two specific human phage antibodies against hepatitis E virus （HEV） from phage display library were isolated by immobilized metal affinity chromatography. The immobilized metal affinity chromatography applied to phage antibody selection was a helpful supplement to the selection in solution.     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFV-M97基因克隆及分泌性表达

目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体.方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×109pfu/ml单链抗体库.对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体.结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732 bp.其中VH 351 bp,编码117个氨基酸;VL 336 bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gly4Ser)3相连.阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20 h,培养液上清中有2 μg/ml可溶性单链抗体.免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力.结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础.     

胃癌单克隆抗体MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv的制备

目的 获得胃癌单克隆抗体（简称单抗）MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv（抗－Id ScFv），为研制MG7的抗－Id ScFv重组胃癌瘤苗奠定基础。方法 以MG7单抗与匙孔血蓝蛋白（KLH）的交联物免疫Balb/c小鼠，取脾分离mRNA。以逆转录聚合酶链反应技术分别扩增抗体重、轻链可变区基因（VH和VL），经linkerDNA连接ScFv基因片段。将ScFv DNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1。在辅助噬菌体M13K07的作用下，获得重组噬菌体抗体ScFv。以单抗MG7对重组噬菌体抗ScFv进行四轮筛选后，随机挑取克隆，经噬菌体ELISA筛选抗－IdScFv单克隆，并对其所属抗－Id类型进行初步鉴定。结果 VH、VL和ScFvDNA分析约为340、320和750bp。经富集后，在随机筛检的60个克隆中得到24个噬菌体呈现型抗－IdScFv单克隆，阳性率为40％。在24个克隆中，有5个为β或γ型抗－IdScFv。结论 用噬菌体抗体技术能够成功地获得单抗MG7的抗－IdScFv，为开展用抗－IdScFv防治胃癌的研究创造了条件。