bFGF和EGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

目的：观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对体外培养胚胎神经管神经干细胞生长和分化的影响。方法：从孕12天大鼠胚胎神经管分离神经干细胞，进行原代培养，分为bFGF组、EGF组、bFGF＋EGF组及对照组：培养过程中观察干细胞的生长，培养2小时做nestin染色鉴定神经干细胞，培养第5天用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果：取材细胞大部分为nestin免疫阳性细胞；各实验组均可促进培养细胞的生长和分 化。免疫组化中，EGF使神经干细胞增殖成团，增加GFAP的表达（P＜0．01）；bFGF能明显增加NSE及GFAP的表达（P＜0．01）；两种因子联合应用，神经元和神经胶质细胞均比对照组增多（P＜0．01）。结论：EGF和bFGF两类生长因子均能促进胚胎神经干细胞的生长，在分化方面，EGF倾向于诱导干细胞增并向着胶质细胞分化，bFGF则诱导干细胞分 成更多的神经元。     

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为神经元的体外实验研究*

 目的： 探讨源于小鼠的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）体外定向分化为神经元的方法,为大量稳定地获得神经元及提供种子细胞治疗脊髓损伤奠定体外实验基础。方法: 源于小鼠的iPSCs在不同的诱导培养基中经悬浮、贴壁、再悬浮和再贴壁培养。免疫荧光检测iPSCs多能性标志物、神经干细胞及其分化细胞标志物的表达。RT-PCR检测神经元及胶质细胞基因表达并行神经元基因测序鉴定,流式细胞术检测iPSCs定向分化为神经干细胞及进一步分化为神经元的比例。结果: 源于小鼠的iPSCs表达干细胞多能性标志物Sox2、Oct4和SSEA1。悬浮培养可以形成类球形拟胚体;经诱导及机械分离后的细胞可形成神经球,神经球经诱导后可分化为神经元。免疫荧光显示iPSCs可诱导出表达nestin的神经球,贴壁培养的神经球可分化为分别表达微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）及髓磷脂碱性蛋白(MBP)的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。RT-PCR及基因鉴定结果显示形成小鼠神经元;流式细胞术检测结果显示分化细胞中神经干细胞和神经元的比例分别为63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。结论: 源于小鼠的诱导多能干细胞能够稳定地在体外定向分化为神经元,为脊髓损伤的治疗提供了一个可靠的细胞来源。     

神经干细胞分化影响因素的研究进展

神经干细胞（neural stem ceils，NSCs）在体外诱导条件下，可以分化成神经系统的三种主要细胞：神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。移植入动物体内它也能分化成神经元和胶质细胞并能迁移到宿主中枢神经系统（CNS）的不同部位，与宿主细胞形成突触联系。其影响因素有外部因素和内在机制两个方面，文章对生长因子、细胞因子、局部微环境等外部因素和bHLH基因转录因子、Notch信号途径、DNA甲基化等内在机制对NSCs分化影响研究进展作一综述。     

不同分化阶段诱导性多能干细胞移植实验研究进展

诱导性多能干细胞（iPSCs）是由动物体细胞重编程得到的具有胚胎干细胞特性的全能干细胞。近年来,随着多能干细胞诱导技术的不断优化以及体外分化技术的飞速发展,多种分化状态的多能干细胞被用于移植实验。我们结合最新研究进展,阐述各种分化阶段诱导性多能干细胞用于动物移植治疗的优缺点,以及最新移植方法所存在的问题。     

以4种基因诱导产前诊断绒毛细胞建立诱导性多能干细胞

背景：诱导性多能干细胞因具有多能性特征,可以诱导分化为特定的细胞,包括神经细胞、造血细胞等。 目的：建立产前诊断绒毛细胞来源的诱导性多能干细胞。 方法：运用反转录病毒介导4种基因hOct4、hSox2、hc-Myc、hKlf4诱导产前诊断绒毛细胞,对建立的诱导性多能干细胞进行多能性、体内外分化能力、核型等鉴定。 结果与结论：建立的诱导性多能干细胞能维持自我更新状态,在蛋白和mRNA水平上高表达全能性的标志基因,具有体内、外分化潜能;在体外长期培养能维持正常核型。说明4种全能性基因转入绒毛细胞可获得具有多能性的诱导性多能干细胞,这为胎儿的细胞自体移植治疗提供理想来源,为产前诊断疾病机制研究提供很好的细胞模型。     

一种人诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化方案的建立及鉴定

背景：人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞性状高度类似的多能干细胞,其具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力,因此能够为临床细胞替代治疗提供足量目的细胞。目的：构建并鉴定一种高效的基于人诱导多能干细胞的内皮细胞定向分化实验方案。方法：采用免疫荧光技术对人诱导多能干细胞干性和增殖活性进行鉴定。采用转录因子重组蛋白和小分子化合物时序性调控系列信号通路,即在第0,1,2,5天顺序加入激活素A、GSK通路抑制剂CHIR99021/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/CHIR99021,人诱导多能干细胞经历心脏中胚层、内皮前体细胞命运转变并最终分化成为有功能的内皮细胞。采用明场显微镜、实时定量PCR、免疫荧光动态观察不同阶段细胞形态特征和分子标记物,采用血管成环实验验证内皮细胞的体外血管形成功能。结果与结论：(1)人诱导多能干细胞内源性高表达诱导多能干细胞干性特异标记物(OCT4、NANOG、SSEA4)和增殖标记物(Ki67);(2)开始分化后的人诱导多能干细胞经历了诱导多能干细胞、心脏中胚层、内皮前体细胞、内皮细...     

大鼠海马神经干细胞体外增殖、凋亡和分化的激光扫描共焦显微镜观察

目的 采用激光扫描共焦显微镜观察体外培养胎鼠海马神经干细胞（NSCs）增殖、凋亡及其分化情况。方法 体外分离培养胚胎大鼠海马NSCs,把神经干细胞球培养在共焦显微镜专用培养皿中。用 Hoechst 33258染细胞核,免疫荧光细胞化学技术检测巢蛋白（Nestin）的表达以鉴定NSCs,检测神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白（β-Ⅲ tubulin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达以测定NSCs的分化能力。通过激光扫描共焦显微镜对神经干细胞球进行光学连续断层扫描,然后用软件进行三维重建,立体动态观察神经球。结果 通过激光扫描共焦显微镜观察到神经球     

兴奋性氨基酸抑制胎鼠神经干细胞的增殖

目的：研究兴奋性氨基酸对体外培养胎鼠神经干细胞（NSCs）增殖的影响。 方法:体外分离、培养与鉴定SD胚胎大鼠脑室下带(SVZ)神经干细胞，利用MTT比色法测定兴奋性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）和谷氨酸（Glu）对细胞增殖的作用。 结果:成功分离出具有胚胎源性的神经干细胞，NMDA和Glu均能导致神经干细胞的增殖活性下降。 结论:培养的SVZ区域细胞具有自我更新和多分化潜能，是中枢神经系统干细胞，兴奋性氨基酸能有效地抑制神经干细胞的增殖。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

纤维母细胞生长因子依赖的鼠诱导性多潜能干细胞具有类胚胎干细胞多能性

近期研究表明干细胞在形态、分子以及功能上都存在两种明显特殊形式:以鼠源胚胎干细胞为代表的一类白血病抑制因子依赖性多能状态,以及鼠类外胚层干细胞为代表的纤维母细胞生长因子依赖性原始多能状态。在鼠源外胚层干细胞培养条件下诱导性多潜能干细胞的诱导取决于纤维母细胞生长因子,研究发现纤维母细胞生长因子诱导性多潜能干细胞意外地表现出类胚胎干细胞或内细胞群的性能。纤维母细胞生长因子诱导性多潜能干细胞有X染色体活性、多遗传性分化、畸胎瘤潜能以及在有机体内的嵌合能力。调查结果表明在129和B16鼠系中,无论出于何种生长因子环境下,诱导性多潜能干细胞都能保持原始多能状态。关键分子信号通路的描述说明纤维母细胞生长因子诱导性多潜能干细胞有赖于活化素和纤维母细     

大脑皮质类器官培养及其在中枢神经系统疾病中的应用

文题释义： 大脑皮质类器官：利用三维细胞培养的方法,在合适的条件下将多能干细胞从单细胞生成一种能发育成神经上皮并具有类似活体大脑组织的复杂结构。 自我重组：像胚胎干细胞或诱导性多能干细胞这一类的多能干细胞,具有自发发育成某些原始结构的趋势。 背景：大脑组织是人体发育最复杂的结构,许多人类大脑疾病难以在动物体内重现,因此建立大脑发育的体外模型具有非常重要的研究价值。最近几年随着干细胞领域的飞速发展,出现了一种人工组织培养技术,即通过体外三维培养的方式,将干细胞从单个细胞生成一种复杂的、类似活体组织的结构,这种结构称为类器官。 目的：文章从大脑类器官的培养现状、发生机制、组织学特征及在神经系统疾病中的应用等多个方面综述了近年来大脑类器官的研究进展,并分析了目前大脑类器官的研究缺陷,旨在为相关领域的研究提供参考。 方法：由第一作者检索1998年1月至2019年6月中国知网、万方、PubMed数据库相关文献,检索词为“类器官、大脑类器官、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、神经发生、大脑皮质、发育、神经退行性疾病”“organoids,cerebral organoids,embryonic stem cells,induced pluripotent stem cells, neurogenesis,cerebral cortex,development,neurological diseases,self-organization”,纳入45篇文献进行综述。 结果与结论：利用多能干细胞自我重组的特性及添加神经诱导因子的方法,在体外可以有效产生大脑皮质类器官。作为一种全新的生物培养技术,大脑类器官在研究活体组织的发育、疾病形成的机制、组织替代疗法以及药物实验等方面都有很大的研究和应用价值。 ORCID: 0000-0002-8700-3030(范文娟) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

WNT/β-catenin信号调节神经干细胞向少突胶质-GABA能神经元分化的体外研究

目的:在体外研究Wnt/β-catenin信号对于少突胶质-GABA能神经元前体细胞分化的影响。方法:培养胎鼠中脑神经干细胞,在Wnt3a刺激或过表达β-catenin的条件下进行诱导分化,采用免疫细胞化学染色和Western Blot检测Wnt/β-catenin信号激活时,少突胶质-GABA能神经元共同前体细胞标记蛋白DLX2,少突胶质细胞标记蛋白NG2,GABA能神经元标记蛋白GAD67的表达。结果:Western Blot显示Wnt-3a处理上调β-catenin和Wnt/β-catenin信号下游靶基因cyclin D1和Axin2的表达;Wnt3a处理和过表达β-catenin的神经干细胞可显著上调Dlx2,NG2和GAD67阳性细胞的百分率(P0.05)。Wnt3a刺激和β-catenin过表达均抑制神经干细胞向星型胶质细胞方向的分化。结论:Wnt/β-catenin信号可在体外促进神经干细胞向GABA能神经元和少突胶质细胞方向分化。     

施万细胞对培养的神经干细胞存活及其分化的影响

目的：探讨施万细胞能否在体外促进神经干细胞的存活和分化。方法：分离和克隆新生大鼠海马组织的神经干细胞；同时获取从神经和臂丛神经，从中分离和纯化施万细胞。将施万细胞和神经干细胞进行共培养，借助免疫细胞化学技术检测培养的神经干细胞巢蛋白（nestin)的表达及其分化后神经丝蛋白（NF）和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。应用扫描电镜观察神经干细胞的形态变化。结果：与施万细胞一起培养的神经干细胞存活数量增加，分为为神经元样细胞的数量也明显增加。这些神经元样细胞的初级突起比对照组的明显增长。施万细胞能使神经干细胞胞体表面不规则的凹凸变得平整。共培养的施万细胞和神经干细胞可以3种方式接触生长：1．胞体与胞体接触；2．胞体与突起接触；3．突起与突起接触。结论：施万细胞促进体外培养的神经干细胞的存活及其分化为神经元样细胞。     

rhIL-1β、rhIL-2和rhIL-6对体外培养海马神经胶质细胞c-fos表达的影响

采用免疫组织化学方法观察了重组人白细胞介素-1β、重组人白细胞介素-2和重组人白细胞介素-6对体外培养大鼠海马神经胶质细胞c-fos表达的影响。结果证明，培养12d的海马神经胶质细胞与重组人白细胞介素-1β（100U／ml）、重组人白细胞介素-2（200U／ml）和重组人白细胞介素-（200U／ml）一起孵育2h后出现FOS-免疫反应阳性的细胞核，随着所给剂量的逐渐加大，FOS反应阳性胞核数量也逐渐增多．图象分析的结果显示，FOS反应阳性胞核的平均光密度亦随剂量的逐渐加大而逐渐增加．本研究的结果提示：重组人白细胞介素-1β、-2及-6均能诱导体外培养大鼠海马神经胶质细胞c-fos的表达。说明三者对体外培养的海马神经胶质细胞具有生物学作用。推测c－fos表达可能是这些细胞因子发挥生物效应的重要中间途径。     

神经干细胞分化调节机制与应用前景

Reynolds等（1992）将成鼠的纹状体在表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）存在下离体培养，发现可表达nestin的细胞，并证实该细胞具有增殖能力，可分化为神经元与胶质细胞。这一发现打破了以往认为的中枢神经系统（central neural system，CNS）神经元损伤不可再生的观点。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）具有干细胞的一般特性：自我更新和多向分化，且具有潜在的迁移能力，这些良好的生物学特性，使其具有广泛的应用前景，对于NSCs的研究为脑功能的恢复带来了曙光。     

细胞因子对少突胶质细胞增殖的调节作用

少突胶质细胞（Oligodendrocyte）是中枢神经系统（CNS）的成髓鞘胶质细胞，包绕神经元轴突形成髓鞘，作为绝缘层保证轴突进行正常快速电传导。近年来研究认为，少突胶质细胞还具有为中枢神经系统提供营养因子和生长因子、表达轴突生长抑制因子等作用，与中枢神经系统的损伤修复具有密切的联系。     

大鼠骨髓间充质于细胞体外诱导分化为具有起搏功能的心肌细胞

目的寻求体外诱导骨髓间充质干细胞分化为具有起搏功能的心肌细胞的方法和途径。方法分离大鼠骨髓间充质干细胞，在体外分别用5-氮胞什（5AZA）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）＋内皮细胞生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF）、干细胞因子（SCF）和窦房结心肌细胞（SAN CMs）裂解液进行诱导。观察细胞形态，用免疫组化和流式细胞技术测定心脏特异性肌钙蛋白T（cTnT）、连接蛋白43以及超极化激活的核酸环化酶门控的离子通道（HCN）2／4的表达，并测定细胞起搏电流If。结果上述方法均能在体外将干细胞诱导为表达心肌细胞特异性蛋白的心肌样细胞，并且均有HCN2表达。5-AZA、bFGF＋EGF和SANCMs组表达HCN2比例较高（22．9％、22．3％和11％），且均能测到起搏电流（If）的存在。结论窦房结裂解液是体外诱导骨髓间质千细胞分化为具有起搏功能的心肌细胞的理想方法，HCN是很有前景的分选具有起搏功能的心肌细胞的标志蛋白。     

某些影响神经干细胞增殖分化的某些因素

1992年,Reynolds和Weiss首先从成年小鼠纹状体分离培养出能在体外不断增殖、具有多种分化潜能的细胞群.这些细胞具有以下一些特征：来自神经系统;能自我更新;通过不对称分裂产生一个新的干细胞和一个祖细胞,对称分裂则产生两个干细胞或祖细胞;可分化为中枢神经系统内神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞这三种主要细胞.     

骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验研究

目的：通过体内、外实验，研究骨髓基质干细胞（BMSCs）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的治疗作用及其机制。方法：建立Lewis大鼠EAE动物模型，在免疫后第6天尾静脉回输PKH26标记的BMSCs，于发病高峰期处死大鼠，组织取材。通过临床评估、荧光示踪、免疫学病理学等方法检测，评估BMSCs对EAE的治疗作用及其机制。同时在体外用化学方法诱导BMSCs向少突胶质细胞分化，观察其分化的情况。结果：通过尾静脉回输，BMSCs能够聚集到病变部位，并发生分化。与对照组相比，回输组大鼠发病临床评分较低，中枢神经系统脱髓鞘的病理改变和炎性细胞浸润减轻，CD4^＋和CD8^＋T细胞表达明显减少（P〈0．05），血清及淋巴细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平显著降低（P〈0．05），IL4的分泌水平显著升高（P〈0．05）。体外诱导72小时未见到BMSCs向少突胶质细胞分化；4天后45％的BMSCs发生分化。结论：在体外BMSCs通过化学诱导可以向少突胶质细胞分化；在体内BMSCs能向病变部位迁移，并部分分化成少突胶质细胞，同时BMSCs通过调节免疫系统的炎症细胞因子表达、CD4^＋和CD8^＋T细胞数和Th1和Th2细胞平衡，对EAE起治疗作用。     

神经干细胞微环境的研究进展

传统观念认为，成年哺乳动物中枢神经系统是不可能再生的。近年来的一些研究表明，成年啮齿类和灵长类动物CNS仍然可产生新的神经元，并证实在成人脑组织中也有神经干细胞(neural stem cells，NSCs)存在。神经干细胞在体外可被生长因子诱导而增殖，并保持分化成神经元或胶质细胞的潜能，移植后能在宿主的神经组织中生存、整合及分化，并且通过基因转染后可表达外源性基因产物。