蛋白激酶C介导磷脂酶C-γ1参与高温诱导热休克蛋白70表达

目的 研究蛋白激酶C(PKC)是否介导磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)参与高温诱导成纤维细胞热休克蛋白70(HSP70)表达的信号转导通路.方法 以基因敲除方法建立的缺失PLC-γ1基因(plcgl-/-)及野生型PLC-γ1基因(plcgl+/+)小鼠胚胎成纤维细胞为模型,Western免疫印迹-增强化学发光法检测高温诱导时PLC-γ1的磷酸化激活,PKC激酶检测试剂盒测定PKC激活程度,并以酶联免疫吸附(ELISA)法及MTT法测定PKC抑制剂白屈莱红碱(chelerthrine chloride,CH)和激活剂佛波醇-12-豆蔻酰-13乙酸(phorbol12-myristate 13-acetate,PMA)对HSPT0表达及细胞热耐力的影响.结果 plcgl+/+细胞经高温处理,PIE-γ1出现磷酸化激活、PKC活性显著增强(P<0.01);plcgl-/-细胞PKC活性也有所增强,但明显低于plcgl+/+细胞(P<0.01).PKC抑制剂或激活剂能增强或降低两种细胞热耐力,对高温引起的两种细胞HSP70合成都有明显抑制或促进作用.结论 蛋白激酶C可介导磷脂酶C-γ1参与高温诱导成纤维细胞热休克蛋白70表达的信号传递.     

蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

【目的】研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKCα、PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB／c的表达情况。【方法】ES-BALB／c细胞株用普通ES细胞培养液培养，分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿，培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。【结果】免疫组化发现PKCα。在ES-BALB／c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达，以细胞浆和细胞核最甚，而PKCβ，PKCγ，PKCδ和PKCε4种亚型无明显表达；Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带，分子质量约为84ku，而PKCβ、PKCγ，PKCδ和PKCε 4种亚型无蛋白印迹条带。【结论】PKCα在ES细胞阶段即有表达，在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用，而PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。     

慢性庆大霉素损伤后豚鼠前庭感觉上皮蛋白激酶C表达和活性

目的 研究庆大霉素慢性损伤后豚鼠前庭终器蛋白激酶C（PKC）活性的变化及其βⅠ,βⅡ,γ亚型的表达,探讨PKC与前庭损伤修复的关系。方法 采用免疫细胞化学法观察椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴PKCβⅠ,Ⅱ,γ亚型的表达;应用γ－^32P示踪检测前庭终器PKC活性的变化。结果 PKCβⅠ,Ⅱ,γ亚型在前庭感觉上皮细胞均呈阳性表达,上皮下结缔组织呈阴性表达,βⅡ,γ亚型较βⅠ亚型表达稍弱,不同亚型抗原分布不安全相同,与对照组相比,PKCβⅠ,γ在停止注射庆大霉素后1d其表达明显减弱,随后其表达逐渐增加,至1wk其表达已高于对照组,3wk仍未恢复,PKCβⅡ表达各组变化不明显。豚鼠前庭终器PKC活性检测结果与PKCβⅠ,γ表达变化规律基本相似。结论 庆大霉素慢性中毒后逐鼠前庭感觉上皮PKCβⅠ,γ亚型表达及PKC活性均发生变化,且不同亚型抗原分布不安全相同,提示PKC在前庭感觉上皮损伤修复过程中发挥重要作用,不同亚型可能具有不同的作用。     

电刺激大鼠小脑顶核对感觉皮层及基底节PKCγ和PKCδ表达的影响

目的　观察FNS后感觉皮层及基底节PKCγ和PKCδ表达的变化 ,以探讨电刺激大鼠小脑顶核 (FNS)预置性神经保护作用的机制。方法　建立电刺激大鼠小脑顶核模型 ,分别在电刺激后即刻 ( 0h)、1、3、7、10d取感觉皮层及基底节所在脑组织 ,冰冻切片 ,进行PKCγ和PKCδ免疫组化染色 ,图像分析测定平均光密度值。并设立假刺激组及小脑顶核(DN)刺激组作为对照。结果　一侧FNS后即刻 ,对侧感觉皮层及基底节PKCγ和PKCδ表达无明显变化 (P >0 .0 5 ) ,而 1d后PKCγ和PKCδ表达显著增高 (P <0 .0 1) ;3d后 ,其表达有所降低 ,7d后其表达水平仍高于假刺激组 (P <0 .0 5 ) ,10d后降至基础水平。同侧感觉皮层及基底节在FNS后 1d ,PKCγ和PKCδ表达也有显著增高 (P <0 .0 5 ) ,但其增高水平明显低于右侧 ,3d后其表达降至基础水平。假刺激组及DN刺激后 1d ,PKCγ和PKCδ表达无明显改变。结论　FNS诱导皮层及基底节PKCγ和PKCδ表达的增高 ,可能与FNS诱导的预置性神经保护作用有关     

大鼠延髓和脊髓背角的PKCγ阳性神经元向孤束核投射

目的观察延髓和脊髓背角内蛋白激酶Cγ亚单位(PKCγ)阳性神经元向孤束核的投射. 方法荧光金(FG)逆行追踪与PKCγ的免疫荧光组织化学染色相结合的双标记技术. 结果 PKCγ阳性神经元主要分布于延髓和脊髓背角的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ层及脊髓的外侧脊核;将FG注入孤束核后,在延髓和脊髓背角的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ层及脊髓的外侧脊核内可见FG标记神经元;部分FG标记神经元呈PKCγ阳性,FG/PKCγ双标神经元也主要见于延髓和脊髓背角的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ层及脊髓的外侧脊核. 结论延髓和脊髓背角的PKCγ阳性神经元可能参与将躯体和内脏伤害性刺激信息向孤束核的传递.     

大鼠延髓和脊髓背角内PKCγ阳性神经元向中缝大核的投射

目的 研究大鼠延髓背角和脊髓背角浅层内蛋白激酶Cγ亚单位（PKCγ）阳性神经元向中缝大核（NRM）的投射。方法 荧光金（FG）逆行追踪和PKCγ免疫荧光组织化学染色相结合的双标记方法。结果 将FG注入NRM，在延髓和脊髓背角的Ⅰ-Ⅲ层内可见FG逆标神经元；PKCγ阳性神经元主要分布于延髓和脊髓背角的Ⅱ层内侧部及Ⅱ、Ⅲ层交界处，Ⅰ、Ⅲ层内较少；延髓背角Ⅰ层和脊髓背角Ⅰ－Ⅲ层可观察到FG逆标并呈PKCγ阳性的双标神经元。结论 延髓和脊髓背角浅层向NRM投射的神经元含PKCγ，提示PKCγ在向NRM传递痛信息的通路中可能发挥重要作用。     

大鼠延髓和脊髓背角的RKCγ阳性神经元向孤束核投射

目的：观察延髓和脊髓背角内蛋白激酶Cγ亚单位（PKCγ）阳性神经元向孤束核的投射。方法：荧光金（FG）逆行追踪与PKCγ的免疫荧光组织化学染色相结合的双标记技术。结果：PKCγ阳性神经元主要分布于延髓和脊髓背的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ层及脊髓的外侧脊核,将FG注入孤束核后,在延髓和背髓背角的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ层及脊髓的外侧脊核内可见FG标记神经元;部分FG标记神经元呈PKCγ阳性;FG／PKCγ双标神经元也主要见于延髓和脊髓背角的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ层及脊髓的外侧脊核。结论：延髓和脊髓背角的PKCγ阳性神经元可能参与将躯体和内脏伤害性刺激信息向孤束核的传递。     

大鼠延髓和脊髓背角内PKCγ阳性神经元向中缝苍白核的投射

目的研究大鼠延髓背角和脊髓背角浅层内蛋白激酶C的γ亚单位（PKCγ）阳性神经元向中缝苍白核（NRP）的投射。方法采用荧光金（FG）逆行追踪和PKCγ免疫荧光组织化学染色相结合的双标记方法。结果将FG注入NRP,在延髓和脊髓背角的Ⅰ-Ⅲ层内可见FG逆标神经元;PKCγ阳性神经元主要分布于延髓和脊髓背角的Ⅱ层内侧部及Ⅱ、Ⅲ层交界处,Ⅰ、Ⅲ层内较少;延髓背角Ⅰ层和脊髓背角Ⅰ-Ⅲ层可观察到FG逆标并呈PKCγ阳性的双标神经元。结论延髓和脊髓背角浅层向NRP投射的神经元是PKCγ阳性神经元,提示其在向NRP传递的信息通路中可能发挥重要作用。     

大鼠延髓背角和脊髓背角内PKCγ阳性神经元向中缝隐核的投射

目的研究大鼠延髓背角和脊髓背角浅层内蛋白激酶Cγ亚单位（PKCγ）阳性神经元向中缝隐核（NRO）的投射。方法应用荧光金（FG）逆行追踪和PKCγ免疫荧光组织化学染色相结合的双标记方法,观察大鼠延髓背角和脊髓背角内PKCγ阳性神经元向中缝隐核的投射。结果将FG注入NRO,在延髓背角和脊髓背角的Ⅰ-Ⅲ层内可见FG逆标神经元;PKCγ阳性神经元主要分布于延髓背角和脊髓背角的Ⅱ层内侧部及Ⅱ、Ⅲ层交界处,Ⅰ、Ⅲ层内较少;延髓背角Ⅰ层和脊髓背角Ⅰ-Ⅲ层可观察到FG逆标并呈PKCγ阳性的双标神经元。结论延髓背角和脊髓背角浅层向NRO投射的神经元为PKCγ阳性神经元,其在向NRO传递信息的通路中可能发挥重要作用。     

大鼠延髓背角内PKCγ阳性超微结构的观察

目的 观察蛋白激酶Cγ亚单位（PKCγ）阳性超微结构在大鼠延髓背角内的定位分布及其突触联系。方法 用PKCγ的特异性抗体进行免疫组织化学染色并在电镜下观察。结果 PKCγ阳性胞体和突起密集地分布于延髓背角的Ⅱ层内侧部，Ⅱ层与Ⅲ层交界部内呈中等密度，Ⅰ层，Ⅱ层外侧部和Ⅲ层深部的阳性胞体和树突较少见；PKCγ的阳性反应产物主要聚集于胞膜和树突膜的内侧，其他部位较稀疏；PKCγ阳性胞体和树突多与阴性轴突终末形成非对称性轴-体和轴-树突触联系。结论 大鼠延髓背角内有PKCγ阳性胞体和树突，它们与阴性轴突终末形成突触联系。本研究的结果为PKCγ参与外周伤害性信号的处理提供了形态学依据。     

大鼠蛋白激酶Cγ基因小发卡RNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的鉴定

目的：研究指出蛋白激酶Cγ（PKCγ）在脊髓水平上参与了伤害性信号的传递,文中拟构建大鼠PKCγ基因的小发卡RNA（shRNA）慢病毒载体,并在细胞水平鉴定其干扰效率。方法：根据PKCγ-mRNA序列,选择3条19nt的靶序列,设计并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入到pLVTHM载体的H1启动子后获得重组质粒,同时构建一个非特异性对照质粒。将所构建的质粒与pMDLg-pRRE、pR sv-REV、pMD2G共转染293T细胞,包装产生慢病毒后,分别感染C6细胞,经免疫印迹技术（W estern b lot）检测PKCγ基因的蛋白表达水平以评价慢病毒载体的抑制效率。结果：测序证实成功构建了3个大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,分别感染C6细胞后pLV-PKC2和pLV-PKC3可明显降低PKCγ蛋白的表达,其中以pLV-PKC2（靶向位点：＋1913＋1931）的慢病毒抑制效率最高。结论：成功构建了大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,且慢病毒载体pLV-PKC2能特异、高效地抑制PKCγ基因的表达。     

肿胀激活状态下蛋白激酶C同工酶亚型在胃癌耐药细胞系的亚细胞分布变化及其意义

目的 探讨肿胀激活状态下，传统型蛋白激酶C（cPKC)同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞系SGC7901/VCR的表达，亚细胞分布变化及其意义。方法 采用免疫荧光及免疫印迹方法，观察正常状态及持续低渗灌流不同时间cPKC同工酶亚型的亚细胞分布变化，利用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察PKCα与-P-糖蛋白（Pgp)的共表达。结果 在正常状态下，cPKC的4种同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞SCG7901/VCR细胞质及细胞膜均有表达：PKCα在耐药细胞表达呈强阳恬药敏细胞表达呈强阳性，PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性。持续低渗灌流，在耐药系10min已发现有PKCα、PKCγ的移位及细胞体积的增大；30minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；60min时PKCα及PKCγ基本恢复至正常位置。细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα及PKCγ几乎全部一笔勾销 位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；40minPKCα及PKCγ基本恢复至正常位置，细胞体积也恢复正常，而PKCβ1及PKCβα在耐药细胞及药敏细胞的亚细胞分布无明显变化。共聚焦显微镜提示PKCα及PKCγ同工酶亚型参与了Pgp与低渗刺激下细胞共表达，以耐药细胞表达明显。结论 只有PKCα及Pgp表达量有关，而PKCβ1及PKCβⅡ可能与这一过程无关。βββ     

氧化低密度脂蛋白对THP-1巨噬细胞脂质蓄积、亲脂素与过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达及蛋白激酶Cα活性的影响

目的:以THP-1巨噬细胞为研究对象,观察氧化低密度脂蛋白(oxLDL)对细胞内脂质蓄积、亲脂素(adipophilin)与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达以及蛋白激酶Cα(PKCα)活性的影响.方法:用0、10、20、40、80 mg/L oxLDL与THP-1巨噬细胞共孵育24 h,油红O染色和高效液相色谱检测细胞内脂质蓄积情况;半定量RT-PCR和Western blot检测adipophilin、PPARγ和PKCα表达的变化情况;PepTag非放射性蛋白激酶检测法对荷脂细胞胞膜PKCα活性进行定量检测.结果:随着oxLDL浓度的增加,THP-1巨噬细胞内脂滴增加变大,胆固醇酯/总胆固醇比值升高,adipophilin、PPARγ和PKCα表达增强(与0 mg/L oxLDL处理组比较,P均<0.05),胞膜PKCα活性由(0.07±0.01)kU/L增至(0.14±0.02)kU/L(P<0.05).结论:oxLDL可增强巨噬细胞PKCα活性,上调PKCα、PPARγ和adipophilin的表达,促进THP-1巨噬细胞中脂质的蓄积;oxLDL、PKCα、PPARγ和adipophilin之间可能存在着某种调控机制.     

大鼠福尔马林内脏炎症痛过程中脊髓PKCγ、PKCβⅡ膜转位的变化

目的 初步探讨PKCγ、PKCβⅡ在内脏炎症痛过程中的作用。方法 本实验用福尔马林复制的内脏炎症痛模型，经脊髓蛛网膜下腔插管给予PKCγ、PKCβⅡ激动剂PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）和抑制剂H-7（1-（5-isoquinolinesulfonyl）2-methylpiperazine dihydrochloride）。结合 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白印迹（Western-blot）等生化技术，选用成年健康Wistar大鼠，随机分4组：N；F＋IT＋NaCl；F＋IT＋PMA；F＋IT＋H-7。共分福尔马林直肠内致炎后30min、60min和120min三个时间段。结果 在福尔马林直肠致炎后30min内，F＋IT＋NaCl组与N组PKCγ膜转位相比明显增多（P〈0．01），F＋IT＋PMA组与F＋IT＋NaCl组相比明显减少（P〈0．05），F＋IT＋H-7组与F＋IT＋NaCl组相比明显增高（P〈0．05）；在福尔马林直肠致炎后的30min、60min和120min三个时间段内，PKCβⅡ膜转位没有明显变化（P〉0．05）。结论　福尔马林致内脏炎症痛过程中PKCγ被激活、PKCβⅡ没有被激活，提示PKCγ可能参与了内脏炎症痛的发生；PKCβⅡ可能没有参与内脏炎症痛的发生。     

双歧杆菌DNA对巨噬细胞MAPK和PKG以及NF-kB的影响

目的 以信号分子MAPK家系、PKC家族和NF-kB为线索探索青春型双歧杆菌的DNA激活巨噬细胞的途径.方法 以激光共聚焦显微镜定量测定小鼠腹腔巨噬细胞ERK1/2、JNK、p38、PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ、PKC ε和PKCζ的含量.以细胞免疫化学方法检测巨噬细胞NF-kB的阳性细胞密度.结果 双歧杆菌DNA注射组小鼠腹腔巨噬细胞ERK1/2、PKCα和PKCβH的平均荧光强度明显高于对照组(P＜0.01),而JNK、p38、PKCβⅠ、PKCγ、PKC ε和PKCζ的平均荧光强度在两组间则差异无显著性(P＞0.05).双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞NF-kB的阳性细胞密度显著高于对照组(P＜0.01).结论 青春型双歧杆菌的DNA可通过活化ERK1/2、PKC α、PKC βⅡ和NF-kB来激活巨噬细胞.     

胃泌素对人胃癌细胞BGC-823生长的影响和受体后信息传递

目的：观察胃泌素对人低分化胃癌细胞株BGC-823的生长调控作用，测定细胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量、蛋白激酶c（PKC）活性及PKC亚型的表达，探讨受体后信息传导途径。方法：应用MTT法观察细胞的增殖程度，放射免疫分析方法测定细胞内cAMP含量，[γ-^32P]ATP掺入外源性底物的方砖测定PKC活性，Western blot方法分析PKC亚型α，β1,β2及ε的表达。结果：胃泌素能促进BGC-823细胞的生长。且与剂量呈正相关（r=0．74，P〈0．05）；这种促生长作用被胃泌素受体拮抗剂丙谷胺拮抗。胃泌素能促进细胞PKC活性的增加，cAMP含量无明显变化；胃泌素使PKCα表达明显增加，PKCβ1、PKCβ2及PKCε无明显表达。结论：胃泌素促进胃癌细胞BGC-823生长的作用由相应的受体介导，其受体后信息传递途径可能涉及二酯酰甘油蛋白激酶C系统，PKCα在胃泌素的受体后信息传递中起重要作用。     

大肠癌细胞膜磷脂变化与蛋白激酶C同功酶表达对肝转移的影响

目的 :探讨结直肠癌细胞膜磷脂变化与蛋白激酶C(PKC)同功酶表达的关系及对肝转移的影响。方法 :采用高效液相色谱法 ,检测大肠癌原发灶、癌旁肠黏膜、肝转移灶细胞膜磷脂酰肌醇 (PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺 (PE)和磷脂酰胆碱 (PC)。采用QRT -PCR方法检测PKC -α -ε- ζ同功酶mRNA的表达。结果检测 4 8例大肠癌标本。在癌原发灶、肝转移灶中 ,PI、PE、PC含量高于癌旁肠黏膜组织 (P <0 .0 1)。肝转移灶与原发灶相中PI、PC含量无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,PE含量显著高于癌原发灶 (P <0 .0 1)。癌原发灶和肝转移灶中PKC -ε、- ζ表达高于癌旁肠黏膜组织 (P <0 .0 1) ,PKC -α表达水平降低。PE含量与PKC -ε、- ζ表达成正比 ,与肝转移呈正相关。PKC -α表达与PE含量成反比 ,与肝转移呈负相关。结论 :细胞膜磷脂PE含量升高 ,PKC -ε、- ζ增强表达和PKC -α表达水平降低与结直肠癌肝转移有密切关系。     

双歧杆菌DNA对巨噬细胞MAPK和PKC以及NF—κB的影响

目的以信号分子MAPK家系、PKC家族和NF—κB为线索探索青春型双歧杆菌的DNA激活巨噬细胞的途径。方法以激光共聚焦显微镜定量测定小鼠腹腔巨噬细胞ERK1／2．JNK、p38、PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ、PKCε和PKCζ的含量。以细胞免疫化学方法检测巨噬细胞NF—κB的阳性细胞密度。结果双歧杆菌DNA注射组小鼠腹腔巨噬细胞ERK1／2、PKCα和PKCβⅡ的平均荧光强度明显高于对照组（P〈0．01），而JNK、p38、PKCβⅠ、PKCγ、PKCε和PKCζ的平均荧光强度在两组间则差异无显著性（P〉0．05）。双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞NF—κB的阳性细胞密度显著高于对照组（P〈0．01）。结论青春型双歧杆菌的DNA可通过活化ERK1／2、PKCα、PKCβⅡ和NF-κB来激活巨噬细胞。     

第三代维甲类化合物丁羟胺酸在体外对蛋白激酶C的抑制作用

丁羟胺酸(R8605)是本所新合成的第三代维甲类化合物。在体外对二乙酰甘油和TPA活化PKC过程有抑制作用;对Ca~(2+)、磷脂和二乙酰甘油非依赖性PKC磷酸化鱼精蛋白有抑制作用。其IC50分别为65、70和100μmol/L。丁羟胺酸对PKC活性的抑制有助于解释其抗促癌作用机理。     

七总皂苷对快速老化SAMP8小鼠PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路的影响

【摘要】 目的 探讨三七总皂苷（PNS)对快速老化SAMP8小鼠PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路的影响。方法将SAMP8小鼠随机分为模型组、PNS高剂量组、PNS低剂量组,以SAMR1为对照,每天灌胃1次,连续2个月。药物干预后,尼氏染色法观察海马CA1区形态,酶活性试剂盒检测PKC的活性,实时定量PCR检测PI3K、Akt、PLCγ1和PKC mRNA的含量,免疫印迹法检测PI3K、Akt 和磷酸化Akt 蛋白、PLCγ1和磷酸化PLCγ1蛋白的表达水平。结果尼氏染色检测显示模型组SAMP8海马CA1区神经元数量减少,排列稀疏,PNS可减轻海马CA1区神经元损伤。酶活性试剂盒检测结果显示,与模型组相比,PNS高、低剂量组的PKC活性均显著提高（P<0.05）,RT-PCR和免疫印迹结果显示,与模型组相比,PNS高剂量组的 PI3K、Akt 、PLCγ1和PKC mRNA含量明显增加（P<0.05）,PNS高、低剂量组的PI3K、磷酸化Akt和 磷酸化PLCγ1的蛋白表达水平均显著上升（P<0.05）。结论PNS可激活快速老化SAMP8小鼠PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信号通路,可能是其改善神经元损伤的作用机制。