人重组骨形态发生蛋白-2和β转化生长因子在诱导成骨中的协同作用

目的:对人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)和β转化生长因子(TGF-β)在诱导成骨的协同作用进行探讨. 方法:210只BALB/c小鼠随机分为3组,每组70只,试验侧均位于右后肢,设立rhBMP-2/牛松质骨载体、单纯牛松质骨载体为对照组. 分别于术后12 h～21 d共11个时间点取材,观察其诱导成骨过程. 结果:rhBMP-2/TGF-β/牛松质骨载体组在诱导间充质细胞增殖、分化,软骨细胞及新生骨形成方面均早于rhBMP-2/牛松质骨载体组,成骨量优于rhBMP-2/牛松质骨载体组,其碱性磷酸酶水平高峰较对照组提前,其组织钙含量明显高于对照组(P<0.05). 而单纯牛松质骨载体组在21 d 仅出现了少量增殖的间充质细胞. 结论:rhBMP-2和TGF-β在诱导成骨调节中存在着协同作用.     

骨形态发生蛋白-2在骨修复中的作用研究进展

骨修复是一个十分复杂的过程，受到多种因素的控制，其中骨生长因子对于局部成骨的重要作用已经实验证实，而骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是诸多因子中唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。在BMPs众多亚型中最重要的并且近年来研究较多的是骨形态发生蛋白-2（BMP-2），本文仅对BMP-2在骨修复过程中的作用研究进展综述如下。     

重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)。方法hBMP－2原核表达载体pYR(pBV220－hBMP-2)转化 E coli BL21,SDS－PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析 DEAE和分子筛 S－300纯化重组蛋白,自然缓降复性法对其复性。结果SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带,而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时,其表达效率较高;在此状态下,温度诱导衣达4h,目的蛋白表达量最高,以后随着时间的延长,表达量稍下降。重组蛋白经纯化后植人小鼠肌肉,组织学观察到肌肉内大量间允质细胞增生以及软骨与骨形成。结论重组hBMP－2具有良好异位成骨活性。     

重组人骨形态发生蛋白-7的研究与应用

1965年,Urist[1]在研究中发现,把脱钙的皮质骨植入动物的肌肉中,1～2周后会有新骨形成。他的结论是,植入的骨虽是死的,但其中可能含有某种物质在诱导新骨的形成。Urist从皮质骨中提取物获得了对成骨至关重要的骨形态发生蛋白     

重组人骨形态发生蛋白2诱发黄韧带骨化的病理学研究

目的：研究实验性黄韧带骨化的病理演变特点。方法：将重组人骨形态发生蛋白２（ｒｈＢＭＰ－２）诱发的骨化过程中不同时期的动物黄韧带,采用石蜡切片苏木精－伊红（Ｈ－Ｅ）染色,阿尔辛蓝（ＡＢ）染色和免疫组化染色（分别以Ｓ－１００单抗和胶原Ⅱ单抗为第一抗体）,然后光镜观察。结果：ｒｈＢＭＰ－２植入后,成纤维细胞代谢活跃,出现软骨化生,并逐渐增生活跃,基质中Ⅱ型胶原纤维和硫酸软骨素增多,４周时达到高峰,此后,     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

重组人骨形态发生蛋白—2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2)，方法：hBMP-2原核表达载体pYR(pBV220-hBMP-2)转化E.coli BL21,SDS-PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析DEAE和分子筛S－300纯化重组蛋白，自然缓降复性法对其复性。结果：SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带，而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时，其表达效率较高，在此状态下，温度诱导表达4h，目的蛋白表达量最高，以后随着时间的延长，表达量销下降，重组蛋白经纯化后植入小鼠肌肉，组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生以及软骨与骨形成，结论：重组hBMP-2具有良好异位成骨活性。     

重组人骨形成蛋白-2

1　概　　述骨形成蛋白(bonemorphogeneticpro-tein,BMP)所具有的独特的诱导成骨活性,决定了它在修复骨质缺损和促进骨折愈合等方面可以发挥重要作用〔1〕。目前,人们已从多种动物如牛、猪、羊、兔、鼠、猴和人等的骨基质中分离出BMP〔2〕。不同动物来源的BMP有较高的同源性,具有跨种诱导成骨能力,从动物骨基质中提取的BMP也能在人体内诱导骨质生成,因而近年来已有一些将动物来源的BMP试用于临床的报道。但是,动物来源的BMP毕竟不是人类自身的蛋白质,尽管其免疫原性弱,在人体内还是会引起一定的免疫反应,而且它与人类自身的BMP在诱…     

重组人胶原绑定骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的表达、纯化与复性

目的: 利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域(CBD)的骨形态发生蛋白2(BMP2),研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法: 将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入BMP2基因序列的N端,构建重组蛋白表达质粒pet21b/CBD-BMP2,转化入工程性大肠杆菌BL21菌株内;37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)持续诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性;0.22 μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌,通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达、纯化以及复性;BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果: 重组质粒pet21b/CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达;CBD-BMP2以包涵体形式表达;SDS-PAGE分析,8 mol·L^-1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中,经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中,单体相对分子质量约为14000;稀释复性后SDS-PAGE分析,相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带,重组蛋白单链成功复性为二聚体结构,相对分子质量约为28000;过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L^-1,回收率约为73%。结论: 重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内,CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。     

重组人骨形态发生蛋白诱导异位成骨的病理学观察

目的：本文报告了重组人骨形态发生蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２）在小鼠肌肉内诱导异位成骨的生物学作用，方法：将大肠杆功表达的ｒｈＢＭＰ－２成熟肽植入小鼠股部肌肉。结果：植入ｒｈＢＭＰ－２后ｄ１就有间充质细胞向植入区内聚集；ｄ５出现典型的软骨细胞；ｄ７钙化开始；ｄ１０形成雏形的骨髓腔，ｄ１４骨髓腔内出现幼稚的造血细胞；２１ｄ－３０ｄ形成大量网状骨小梁、骨单位、在骨小梁间隙出现骨髓细胞。结论：大肠杆菌中表达     

Implantation of xenogeneic bone combined with recombinant human bone morphogenetic protein-2 into bone defect—An scanning electron microscopic study

Xenogeneicbonehasagreatpotentialforgraftingowingtoitsunlimitedsourcesandsimple,economicalcharacters'However,theimmunere-jectionevokedbyxenograftrestrictsitsclinicalap-plication.Howtoeliminatetheantigenicityofthegraftwhilepreserveitsosteoinductivepropertiesisthekeytosuccessfulgraftingandisalsothepur-poseofthisstudy.Thechemicallytreatedsheepcancellousbonehasasuitableframeworkformechanicalsupportandisagoodcarrierofbonemorphogeneticprotein(BMP)withattenuatedantigenicity,butitlacksosteoinductivefa…     

Expression of mature peptide of human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli

bonemorphogenetlcprotein-:antI--/eisiveroleduringboneregenerationandrepairaswellasduringvariousstagesofelnbryonaldevelopment['].ThelengthofthecompletecDNAofhumanhonemorphogeneticprotein-2(hBMP-2)is1587hp,whose1188hpopenreadingframeencodesa396aminoacidsproteinwhichconsistsofasignalpeptide,apro--Peptideanda114ahanoacidmaturePeptide.FunctionalhBMP-2waseverexpressedinCOS,CHOandinsectcells,hutnotinE.colt:'.liuXinping['.",InZifan[5',ZhaoMing='jandlinbangetal-':haveexpressedvariedC-tenonalP…     

Reconstruction of orbital defect in rabbits with composite of calcium phosphate cement and recombinant human bone morphogenetic protein-2

Background Calcium phosphate cement （CPC） is a biocompatible and osteoconductive bone substitute, and recombinant human bone morphogenetic protein-2 （rhBMP-2） has strong osteoinductibility, therefore we developed a composite bone substitute with CPC and rhBMP-2 and evaluate its reconstruction effect in rabbit orbital defect.Methods Thirty-six rabbits were randomly divided into two groups and a 5 mmx5 mmx2 mm bone defect in the infraorbital rim was induced by surgery in each orbit （72 orbits in all）. The orbital defects were treated with pure CPC or composite of CPC and rhBMP-2. The osteogenesis ability of different bone substitute was evaluated by gross observation, histological examination, histomorphometrical evaluation, compressive load-to-failure testing, and scanning electron microscope （SEM）.Results Gross observation showed that both bone substitutes were safe and effective for reconstruction of orbital defect. However, histological examination, histomorphometrical evaluation and SEM showed that CPC/rhBMP-2 group had faster speed in new bone formation and degradation of substitute material than CPC group. Compressive load-to-failure testing showed that CPC/rhBMP-2 group had stronger compressive strength than CPC group at every stage with significant difference （P ＜0.05）.Conclusion Composite of CPC/rhBMP-2 is an ideal bioactive material for repairing orbital defect, with good osteoconductibility and osteoinductibility.     

胶原膜复合rhBMP-2引导牙周组织再生的组织学观察

目的：探讨胶原膜复合rhBMP-2对大鼠牙周组织缺损模型牙周组织再生修复的影响。方法：18只健康雄性Wistar大鼠,于下前牙龈颊沟冠方1 mm处制备实验性牙周组织缺损模型,随机分为对照组、胶原膜组（Co组）和胶原膜复合rhBMP-2组（Co/rhBMP-2组）。术后4、6和8周分批处死大鼠,取实验部位进行组织学观察。结果：Co/rhBMP-2组术后4周缺损区可见大量新生骨;6周新生骨充满缺损区;8周新生牙槽骨密度较高,根面有新生牙周膜和牙骨质样组织,未见牙龈上皮长入。Co组术后4周缺损边缘可见新骨形成;6周新生骨量增多,但尚未充满缺损区;8周根面有少量牙周膜和牙骨质样组织形成。对照组术后4周缺损边缘有少量新骨沉积;6周缺损边缘可见束状胶原纤维;8周切迹内仅有少量新生牙周组织形成,并有牙龈上皮长入。结论：胶原膜复合rhBMP-2既有引导作用,防止牙龈上皮长入,维持生长空间;又具有诱导骨形成作用,能促进牙周组织修复再生。     

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白2缓释体对铬磨损颗粒诱导的溶骨效应的影响

目的建立大鼠植骨气囊模型,观察在不同浓度重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)缓释体干预下气囊内组织的破骨细胞分化因子(RANKL)、骨破坏素(OPG)表达情况。方法在大鼠背部注入空气形成气囊,取同源大鼠的颅骨植入气囊内。将已制成的植骨气囊模型大鼠分成5组:空白组、铬颗粒组、50μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组、100μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组和200μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组。各组分别用药处理,2周后取出囊腔内组织进行RANKL、OPG的Wester-blot、Rt-PCR检测,并对囊腔内骨片行TRAP染色,用计算机图像分析技术测定骨片破骨细胞染色面积,进行药效评价。结果 RANKL、OPG在各组囊腔组织中均有表达。骨片破骨细胞染色面积、RANKL、OPG的Wester-blot和RT-PCR结果及RANKL/OPG值,在铬颗粒组中明显高于其他4组(P<0.05);在3个rhBMP-2缓释体干预组内,随着rhBMP-2缓释体浓度增高呈递减趋势,组间差异均有统计学意义(P<0.05);在空白组和200μg/L rhBMP-2缓释体+铬颗粒组间未见明显差异(P>0.05)。结论大鼠植骨气囊模型成功的模拟了人工关节无菌性松动的生物学和组织学特征。铬颗粒可以引起RANKL/OPG值升高,促进溶骨;rhBMP-2缓释体通过降低RANKL/OPG值,从而促进成骨、抑制骨吸收效益。     

重组人骨形成蛋白－2与异种骨复合移植的扫描电镜观察

目的：明确含有重组人骨形成蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２）的新型复合异种骨的骨修复能力。方法：将ｒｈＢＭＰ－２与经综合化学处理的新生小羊骨松质（ＣＢ）结合，制备成复合异种骨．将复合异种骨植人兔下颌骨缺损，并以单纯松质骨移植、自体骨移植作为对照组，术后２、４、８、１２周分别取材做扫描电镜观察。结果：复合异种骨移植后，植骨区有大量新骨形成，新骨的量随移植时间延长而逐渐增多。自体骨移植组扫描电镜下表现与复合异种骨组基本相同。而单纯骨松质载体移植后，植入区多为纤维结缔组织，新骨形成少．结论：ｒｈＢＭＰ－２可显著促进复合异种骨内的新骨形成。这种新型复合异种骨可能是一种较理想的植骨材料，可望用于人体植骨     

Reconstruction of orbital defect in rabbits with composite of calcium phosphate cement and recombinant human bone morphogenetic protein-2

PURPOSE Calcium phosphate cement (CPC) is a biocompatible and osteoconductive bone substitute, and recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) has strong osteoinductibility, therefore we developed a composite bone substitute with CPC and rhBMP-2 and evaluate its reconstruction effect in rabbit orbital defect. METHODS Thirty-six rabbits were randomly divided into two groups and a 5mm×5mm×2mm bone defect in the infraorbital rim was induced by surgery in each orbit (72 orbits in all). The orbital defects were treated with pure CPC or composite of CPC and rhBMP-2. The osteogenesis ability of different bone substitute was evaluated by gross observation, histological examination, histomorphometrical evaluation, compressive load-to-failure testing, and scanning electron microscope (SEM). RESULTS Gross observation showed that both bone substitutes were safe and effective for reconstruction of orbital defect. However, histological examination, histomorphometrical evaluation and SEM showed that CPC/rhBMP-2 group had faster speed in new bone formation and degradation of substitute material than CPC group. Compressive load-to-failure testing showed that CPC/rhBMP-2 group had stronger compressive strength than CPC group at every stage with significant difference (P<0.05). CONCLUSIONS Composite of CPC/rhBMP-2 is an ideal bioactive material for repairing orbital defect, with good osteoconductibility and osteoinductibility.