不同胎龄人胎脑皮质枕叶神经干细胞的发育特征

目的探讨不同胎龄胎脑皮质枕叶神经干细胞（NSCs）的发育特征。方法收集胎龄16～36周的水囊引产胎儿90例，采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑皮质枕叶NSCs的分布、形态、生长方式及数量进行检测。结果NSCs主要分布在锥体细胞层及内颗粒细胞层．呈圆形，中等大小，0、1个突起，核相对较大，2—4个核仁，染色质疏松。NSCs呈明显的区域性分布，大部分NSCs以群状、簇状或数个细胞形成的小集落样生长方式存在，少数NSCs以单个形式存在于其他神经细胞中，各胎龄组NSCs在分布、形态、种类、生长方式等方面无明显差异。随着胎龄的增加，皮质枕叶NSCs逐渐减少。结论不同胎龄人胎脑皮质枕叶存在NSCs，其数量随着胎龄的增加而减少。     

32周胎龄人胎脑神经干细胞发育状态的研究

目的探讨人同一胎龄胎脑不同部位神经干细胞的发育状态。方法收集胎龄32周的水囊引产胎儿15例,采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位的神经干细胞(NSCs)的分布、形态、生长方式以及数量进行检测。结果32周胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位均存在NSCs。NSCs呈圆形、椭圆形及星形,以圆形及星形多见;细胞有0~2个突起不等,胞浆丰富,核呈圆形,染色质疏松,1~2个核仁不等。NSCs呈明显的区域性分布,可见群状、集落样、对称分裂、单个存在等生长方式,有的NSCs与其他NSCs形成突触联系。不同部位上述特点有所不同。海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等7个部位NSCs逐渐减少,检出率差异非常显著。结论人胎脑的海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等部位均存在NSCs;且同一胎龄不同部位NSCs在分布、形态、生长方式及数量上存在差异。     

36周胎龄人胎脑不同部位神经干细胞变化特征研究

目的观察同胎龄不同部位人胎脑神经干细胞(NSCs)的变化特征。方法收集胎龄36周的水囊引产胎儿15例,采用免疫组织化学技术对人胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位NSCs的分布、形态、生长方式以及数量进行检测。结果36周胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位均存在NSCs,NSCs呈圆形、椭圆形、星形、多角形及梭形,以圆形及星形多见;细胞0～4个突起不等,胞浆丰富,核呈圆形,染色质疏松,1～2个核仁不等。可见NSCs呈群状、集落样、对称分裂、单个存在等生长方式。海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等7个部位NSCs逐渐减少。结论36周胎龄不同部位NSCs在分布、形态、生长方式及数量上存在差异。     

人胎脑海马部位神经干细胞形态学观察

目的 探讨人胎脑海马部位神经干细胞的形态学发育特点。方法 收集胎龄20～36周的自愿水囊引产胎儿75例，采用免疫组织化学和光镜观察技术对胎脑海马部位神经干细胞的分布、形态、存在方式进行检测。结果 神经干细胞主要分布于海马多形细胞层、锥体细胞层及颗粒细胞层，分子层也可见，细胞呈圆形、椭圆形、三角形及星形，以圆形细胞多见，0～2个突起不等，以1个突起多见。细胞胞浆丰富；核呈圆形及椭圆形，染色质疏松，2～5个核仁不等。多数单个散在分布，可见对称分裂现象，有的干细胞呈簇状分布，有的干细胞突起与别的细胞保持联系。结论 人胎脑海马部位各层均存在神经干细胞，海马可能存在齿状回之外的神经干细胞生发中心。     

人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究

目的研究人胚胎神经干细胞体外长期培养的条件、不同部位脑组织神经干细胞数量及其分化能力和特点。方法分离人胚胎海马、皮质、室周、纹状体脑组织，培养在含碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、表皮生长因子（EGF）、B27、N2掭加剂的无血清培养基中，形成神经球，用有限稀释法进行克隆、传代。计算神经球数量，用溴脱氧尿苷（BrdU）标记神经球，使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞自主分化能力。结粜人胚胎海马、皮质、室周、纹状体部位脑组织均能培养出具有自我增殖能力的神经干细胞，其中海马所含神经干细胞最丰富。室周次之。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。细胞贴壁分化后可形成Nestin、胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）表达阳性细胞。结论胚胎脑组织具有丰富的神经干细胞。具有自我更新和增殖能力，可长期培养。含b-FOF、EGF的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖，保持神经干细胞特性。分离培养的神经干细胞可向神经元、胶质细胞分化。     

利用人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化模型建立体外神经毒性测试的实验研究

目的 许多药物具有神经毒性,尤其是对于儿童的影响更大.目前常用的药物体内毒性实验既耗时又昂贵.人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化有望建立一种理想的用于评价药物神经毒性的体外评估系统.此项研究旨在利用红藻氨酸的神经毒性验证此系统的可行性.方法 单层贴壁状态下,人胚胎干细胞和人羊水干细胞在化学成分明确的诱导条件下向神经细胞诱导.这些细胞经神经细胞特异性的抗体染色证实其特性.诱导得到的神经细胞在不同浓度红藻氨酸的培养液中进行培养和扩增,每代细胞进行计数,绘制细胞的生长曲线.结果 人胚胎干细胞和人羊水干细胞均可被高效地诱导为神经细胞;人胚胎干细胞的神经诱导效率高于人羊水干细胞;红藻氨酸对诱导得到的神经细胞具有毒性,其浓度与毒性呈正相关.结论 人胚胎干细胞和人羊水干细胞的体外神经分化可作为用于评价药物神经毒性的体外评估系统.

Abstract：

Objective A lot of drugs have side effects on the central nerves system. Especially in children. In vivo neurotoxicity tests are time-consuming and expensive. The neural differentiation of human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells provides all ideal in vitro system that Can be applied to evaluate neurotoxicity of drugs. This study was to try to establish such a system. The kainie acid was selected to test the neurotoxicity. Methods The human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells were indueed to differentiate into neural cells by a chemically defined neural induction medium. The induced neural cells were propagated in the presence of basic fibroblast growth factor. Immunocytochemical staining Was applied to confirm these cells' neural identity. The induced cells were propagated under different concentration of kainic acid, then the gosh curve were made based on the cell numbers. Results Both of the human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells could be efficiently induced to be differentiated into neural cells. The neural differentiation efficiency of human embryonic stem cells is higher than that of human amniotic fluid stem cells. The kainic acid has neurotoxieity to the indueed neural cells. Conclusions The neural differentiation of human embryonic stem cells and amniotic fluid stem cells were proved to provide a rapid and convenient approach for estimating the neurotoxlcity of drugs.     

人胎脑室下区发育过程中神经干细胞的变化

目的观察人胎脑室下区不同发育时期神经干细胞(NSCs)的变化,为调控自身NSCs治疗神经系统退行性疾病提供实验依据。方法收集胎龄24~28周的水囊引产胎儿30例,采用原位杂交及光镜技术对其脑室下区NSCs的分布、形态以及生长方式进行检测。结果不同胎龄人胎脑室下区均可见Nestin mRNA表达阳性NSCs,NSCs呈星形,有3~6个突起,多个突起形成网丛,细胞散在分布在网丛中,胞核呈圆形,1~4个核仁,细胞染色质疏松。多数NSCs单个存在,可见对称分裂的NestinmRNA表达阳性NSCs和3个NSCs形成的集落样生长方式。不同胎龄Nestin mRNA表达阳性NSCs的分布部位、细胞形态无明显区别,但Nestin mRNA表达阳性NSCs生长方式上存在一定差异。结论不同胎龄人胎脑室下区均存在NSCs,NSCs生长方式随胎龄不同而变化,调控在体NSCs有望成为治疗儿童神经退行性疾病的另一种有效方法。     

不同实验方法在人胎脑海马神经干细胞检测中的应用

目的探讨精确可靠的检测人胎脑神经干细胞(NSCs)的方法。方法收集胎龄32周的水囊引产胎儿10例,灌注固定后分别予石蜡包埋和冷冻切片,采用HE检测Nestin蛋白表达免疫组织化学染色和光镜技术对人胎脑海马部位两种切片组织结构的改变和NSCs进行检测。结果石蜡切片海马组织Nestin蛋白表达阳性NSCs数较少,每个NSCs中Nestin蛋白表达的量也较少:而冷冻切片Nestin蛋白表达阳性NSCs数较多,且每个NSCs中Nestin蛋白表达的量也较多,石蜡切片中组织及细胞结构完整性优于冷冻切片。结论水囊引产、灌注固定及冷冻切片三结合研究人胎脑组织NSCs,是一种可靠、精确而敏感的实验方法。     

人胎胸腺皮质和髓质表面积的发育规律

国内外虽对人胎胸腺发生及发育进行了大量的研究[1,2 ] ,但尚未见到对胸腺皮质和髓质表面积进行定量分析的报道。本研究试图从量的角度探讨胸腺皮、髓质表面积生长发育的规律 ,现报告如下。材料与方法一、材料　胎儿标本 79例。二、方法　 1.切片制作 :每例胎儿取胸腺 1～ 8块 ,10 %中性缓冲福尔马林液固定 ,石蜡包埋。只有 1个组织块的连续切片。每隔 9张抽一张贴片 ,每例 10张切片 ,片厚 6μｍ。ＨＥ染色。用精度为 1ｍｍ的直尺测量组织块脱水前后的长度与组织块在切片方向和切片同一方向组织长度 ,求得线性缩水因子ｆｓ=0 .80 0 ,校正挤…     

人脐静脉内皮细胞制备饲养层对胚胎干细胞生长的支持作用

目的探讨人脐静脉内皮细胞是否可作为饲养层支持胚胎干细胞(ESC)的生长,维持ESC的未分化状态。方法取健康产妇产后的脐带,胶原酶灌注消化脐静脉血管,分离内皮细胞原代培养,并连续传代扩增细胞,Ⅷ因子相关抗原鉴定。采用生长良好的3代以上内皮细胞,经丝裂霉素C(10mg/L)灭活后制备饲养层,将E14.1 ESC接种到该饲养层上进行传代培养,观察ESC的形态学特征,测定不同传代时间的ESC碱性磷酸酶(AKP)活性、干细胞标志物Oct-4的表达,严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内畸胎瘤形成实验鉴定其全能分化特性。结果人脐静脉血管来源的内皮细胞能够在体外培养过程中生长、增殖旺盛,细胞连续传代10代以上能完整的保持正常的细胞形态学特征和生物学特性。经丝裂霉素C处理后细胞停止增殖,在24h内能较好的保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞的基本条件。E14.1 ESC在人脐静脉内皮细胞上传3～8代能较好的保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达AKP及干细胞因子Oct-4;体内全能分化实验显示:在内皮细胞上生长6代和10代以上的E14.1 ESC接种到SCID小鼠6周后均能形成畸胎瘤,含有3个胚层的组织细胞。结论人脐静脉血管内皮细胞可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效支持ESC的生长,克服了目前人ESC使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了ESC临床应用的生物安全性问题。     

人脐带血间充质干细胞在缺氧缺血性脑病新生鼠脑内的定植

目的探讨脐带血间充质干细胞(MSCs)培养及其在缺氧缺血性脑病(HIE)新生鼠脑内的定植。方法用出生7 d的新生SD大鼠制作HIE模型,同时在当天分别用2种方法(定向注射和尾静脉注射方式)接受经Hoechst 33258标记24 h的MSCs移植,15~30 d观察MSCs存活情况。结果用改良Rice法可制备7日龄新生鼠单侧脑损伤为主的HIE模型;经定向注射和尾静脉注射移植的MSCs能在HIE脑内定植,分布在患侧大脑皮层、海马等部位,并主要以额叶为多,和宿主脑组织融合在一起。结论在体外培养条件下,人脐血MSCs可以生长,当MSCs移植到HIE模型鼠后,细胞能和脑实质融合在一起,并更多地向脑损伤部位迁移聚集。     

胚胎干细胞诱导分化为造血干细胞重建造血功能的作用

目的探讨胚胎干细胞（ESC）定向分化来源的造血干细胞（HSC）体内重建造血功能的作用。方法将小鼠E14.1胚胎干细胞采用三步诱导法在体外分化发育为HSC,流式细胞仪检测HSC表面标志性抗原CD34^＋/Sca-1^＋的表达,体内畸胎瘤形成实验检测其致瘤性,造血克隆形成（CFU）实验观察其体外造血集落形成情况,免疫磁珠分选纯化HSC移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性小鼠观察其体内重建造血的功能。结果多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESC发育为含丰富造血前体细胞的胚胎体（EB）,诱导14 d后,EB中CD34^＋/Sca-1^＋细胞数达峰值,为（13.72±2.07）%。收获此阶段的EB行第二步诱导分化16 d后,CD34^＋/Sca-1^＋细胞数可增至（24.62±2.50）%,CFU培养出现红系和粒系造血克隆;在骨髓基质细胞加胎肝基质细胞上清液培养体系中进行第三步诱导分化15 d后,CD34^＋/Sca-1^＋细胞达峰值,为（58.64±4.20）%,CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落,W right-G iemsa染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSC经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠,移植组小鼠＋10 d造血功能开始恢复,观察40 d后除血小板恢复较慢外,白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常,植入率为71.4%,存活率为43.0%,染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论采用分阶段诱导的方法,可在体外定向诱导小鼠ESC分化发育为HSC,此来源的HSC较安全,无致瘤性,并具备体内重建造血功能的能力。     

HCK基因在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达

目的 探讨HCK基因在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达及HCK基因在维持胚胎干细胞未分化状态中的意义.方法 培养小鼠胚胎干细胞,并诱导其向心肌细胞分化.抽提其胚胎干细胞未分化及分化第2、4、6、8天的总RNA,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对HCK基因mRNA的表达进行半定量分析;同时抽提胚胎干细胞未分化及分化第2、4、6、8天的总蛋白,应用Western-blot方法对HCK蛋白的表达进行半定量分析.采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,P＜0.05为有统计学差异.结果 HCK基因mRNA在未分化的胚胎干细胞(D0)及分化的第2天(D2)均有表达,而在分化的第4天(D4)开始已不能检测到有表达,HCK基因mRNA的表达水平随小鼠胚胎干细胞的分化呈急剧下调趋势;HCK蛋白的表达与mRNA的表达相一致,在小鼠胚胎干细胞的分化进程中逐渐下调,至第4天已基本检测不出.结论 HCK基因随着小鼠胚胎干细胞向心肌分化,表达呈下调的趋势,HCK基因可能在维持胚胎干细胞未分化状态中起重要作用.     

新生大鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨新生大鼠神经干细胞的分离培养方法及其外源报告基因在神经干细胞中的表达情况。方法 采用无血清细胞培养技术，间接免疫细胞化学染色法及其绿色荧光蛋白转导技术。结果 从新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达成熟神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。绿色荧光蛋白报告基因转导神经干细胞后能够有效表达。结论 该方法分离培养的神经干细胞保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新、增殖能力和多分化潜能，而且外源报告基因在神经干细胞中能够有效表达。