负载宫颈癌肿瘤裂解物的树突状细胞诱导的CTL杀伤效应

目的:利用树突状细胞(DC)递呈肿瘤抗原的生物学特性,提高细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对宫颈癌细胞的杀伤活性。方法:联合应用重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导培养宫颈癌患者外周血DC,以宫颈癌组织肿瘤相关抗原(TAA)激活DC,诱导异体T细胞增殖分化为CTL,以MTT法测定CTL增殖活性及其对宫颈癌Hela细胞株的特异性杀伤活性。结果:宫颈癌患者外周血来源DC负载宫颈癌肿瘤裂解物后,可促进CTL增殖,诱导产生的CTL对宫颈癌细胞具有高效而特异的杀伤率,且显著高于异种肿瘤细胞(P<0.05)。结论:DC能递呈宫颈癌肿瘤抗原,诱导产生抗原特异和高效的CTL,提示负载肿瘤裂解物的DC,具有为宫颈癌患者进行特异性免疫治疗的临床应用前景。     

脐血来源树突状细胞体外扩增及诱导特异性抗卵巢癌免疫

目的 :研究脐血来源树突状细胞 (DC)的体外扩增及诱导特异性抗卵巢癌细胞的免疫效应。方法 :①从脐血中分离单个核细胞 (MNCs)后 ,获得单核细胞 (Mo)。粒单集落刺激因子 (GM -CSF)和白介素 4(IL - 4)诱导分化扩增 ,培养 7天后应用流式细胞仪进行表型分析。②诱导单核细胞分化的第 3天加入人卵巢癌细胞株 3A0的冻融抗原 ,共培养 4天后获得负载肿瘤抗原的成熟DC ;将致敏DC与从脐血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养 3天 ,获得细胞毒T淋巴细胞 (CTL) ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测CTL及上清液对人卵巢癌细胞株 3A0、人胚肾细胞株 2 93T(对照细胞 )、人肝癌细胞株HCCC - 9810的细胞毒作用。结果 :①脐血来源Mo在GM -CSF和IL - 4作用下 ,7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CD1a、CD80 (B7- 1)、CD86 (B7- 2 )、HLA -DR、CD83。②DC可负载并递呈肿瘤抗原 ,激活同种异体T淋巴细胞 ,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对卵巢癌细胞 3A0有特异性杀伤、抑制作用 (P <0 .0 5 )。结论 :脐血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC ,并诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应。     

负载hGM-CSF基因的慢病毒载体介导的宫颈癌DC疫苗抗肿瘤活性的初步研究

目的:制备负载hGM-CSF基因的宫颈癌DC疫苗并研究其抗肿瘤作用。方法:(1)分离制备脐血来源的DC,通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定;(2)Lenti-hGM-CSF转导DC细胞,ELISA方法检测DC细胞上清液中hGM-CSF的含量。宫颈癌HeLa细胞冻融抗原刺激DC细胞制备DC疫苗;(3)DC疫苗刺激同种T淋巴细胞诱导特异性CTL并用MTT法检测其增殖能力和对靶细胞的特异性杀伤能力。结果:(1)经Lenti-hGM-CSF转导后DC培养液中hGM-CSF含量明显高于未转染的DC细胞(P0.01);(2)Lenti-hGM-CSF转染的宫颈癌DC疫苗刺激淋巴细胞的增殖指数(SI)达2.16,明显优于未转染的宫颈癌DC疫苗;(3)经Lenti-hGM-CSF修饰的宫颈癌DC疫苗诱导的CTL对宫颈癌HeLa细胞的杀伤活性达51.12%,高于未经修饰的DC诱导的CTL(P0.05)。结论:用Lenti-hGM-CSF修饰制备的宫颈癌DC疫苗,其刺激T细胞增殖的能力增强,诱导的CTL对宫颈癌HeLa细胞具有显著增强的杀伤效应。     

树突状细胞与卵巢癌细胞的融合及体外抗肿瘤作用的研究

目的 :比较脐血及以卵巢癌患者外周血来源的树突状细胞 (DC)的特点 ,研究DC 卵巢癌融合瘤苗的体外免疫应答效果。方法 :从脐血及卵巢癌患者外周血中诱导扩增DC ,从数量、形态、细胞表面标志及刺激增殖活性方面进行比较。体外培养卵巢癌患者癌细胞 ,将其与脐血DC在聚乙二醇 (PEG)介导下融合 ,活化自体T细胞 ,MTT法检测杀伤效果。结果 :体外诱导卵巢癌患者外周血DC ,每 2 0ml血能够获得 (0 .6～ 1.6 )× 10 6 个细胞 ;体外诱导脐血DC ,每 2 0ml血能够获得 (1.8～ 3.5 )× 10 6 个细胞 ,二者有明显差异 (P<0 .0 5 )。卵巢癌患者外周血DC在混和淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)中显示了更为显著的刺激增殖活性。两者表达高水平的MHCII类分子和共刺激分子。经脐血DC 自体卵巢癌融合细胞活化的T细胞 ,对卵巢癌细胞株细胞的杀伤没有增加 ,而增强了对自体卵巢癌细胞的杀伤力。结论 :由脐血诱导可以获得更多数量的DC。脐血DC与自体卵巢癌细胞融合 ,能使肿瘤相关抗原有效提呈 ,激活T细胞 ,使它成为抗原特异性CTL ,有效杀伤自体癌细胞     

冻融抗原致敏的树突细胞对裸鼠人卵巢癌移植瘤治疗作用的研究

目的 :研究冻融抗原致敏的树突细胞 (DC)对裸鼠人卵巢癌移植瘤的治疗作用。方法 :联合应用粒性白细胞与巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)及白介素 4 (IL 4 )从正常足月产妇分娩后新生儿脐血中培养出DC ,以人卵巢癌细胞系 3AO细胞冻融抗原激活DC ,测定其诱导的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)对 3AO的杀伤活性 ;CTL预防性接种于裸鼠皮下 ,观察裸鼠人卵巢癌移植瘤的发生率 ,以DC激活的CTL治疗裸鼠人卵巢癌移植瘤并观察治疗效果。结果 :体外抗原冲击致敏的DC能显著刺激T淋巴细胞增殖 ,其诱导的CTL对细胞系 3AO具有显著的杀伤作用 ,在效靶比为 4 0 :1、2 0 :1、10 :1、5 :1时 72h杀伤率平均分别为 90 .1%、67.4 %、4 0 .4 %、17.8%。DC激活的CTL能预防裸鼠人卵巢癌移植瘤的发生 (预防组 16.6% ,对照组 10 0 % ,P <0 .0 0 1) ,并能抑制移植瘤生长 ,对照组、治疗组移植瘤的大小分别为 (5 .6± 1.1)cm3 、(2 .7± 0 .78)cm3 (P <0 .0 1)。结论 :人卵巢癌细胞冻融抗原体外冲击致敏的DC可作为一种抗癌疫苗在免疫治疗卵巢癌患者中发挥重要作用     

树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫的实验研究

目的 观察人外周血树突状细胞(Dendritic cells,DC),体外能否诱导抗卵巢癌免疫应答。方法 用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)从健康女性外周血分化诱导DC,以源于人卵巢癌细胞系HO-8910的肿瘤抗原粗提物冲击致敏DC,将致敏DC、同源淋巴细胞和卵巢癌细胞共育,观察负载抗原DC体外诱导淋巴细胞对HO-8910细胞的杀伤作用,同时设不同类型肿瘤细胞(Eca-109和PC-12)作为对照。MTT法测定细胞杀伤活性。结果 经卵巢癌细胞HO-8910肿瘤抗原脉冲致敏的DC能诱导淋巴细胞特异性地杀伤卵巢癌细胞。结论 用GM-CSF、IL-4和TNF-α从人外周血诱生的DC能从卵巢癌细胞HO-8910冻融物有效递呈抗原并诱导出高效而特异的抗卵巢癌免疫反应。     

6811抗独特型微抗体负载树突状细胞对卵巢癌细胞系细胞杀伤作用的体外研究

目的 用6811抗独特型微抗体体外负载树突状细胞(DC)，以期诱导出抗原特异性的抗肿瘤免疫反应。方法 分离培养HLA-A2 健康人外周血树突状细胞，培养过程中用6811微抗体负载，无关抗原F(ab)2负载及未负载组为对照。光镜、电镜下观察树突的形态；流式细胞仪检测DC表面分子表达；^3H-TdR掺入法测DC刺激自体T细胞增殖；^51Cr6h释放试验测激活的T细胞对卵巢癌细胞系的杀伤。结果 培养的树突细胞有典型形态，CD80、CD86、HLA-DR等表面分子呈高表达(分别为65％、86．2％、93．7％)；6811微抗体负载的DC不仅能刺激自体T细胞的增殖，而且其诱导的CTL细胞对HLA-A2 、OC166-9 卵巢癌细胞系HOC1A有特异性的杀伤，结论 6811抗独特型微抗体模拟卵巢癌抗原OC166-9负载树突状细胞在体外可以诱导出抗原特异性的细胞毒T细胞，为进一步研究6811微抗体对卵巢癌免疫治疗作用提供了依据。     

白细胞介素12转染树突状细胞后与新建卵巢上皮性癌细胞融合的免疫原性研究

目的研究白细胞介素（IL）12转染入树突状细胞（DC）后,与新建卵巢上皮性癌细胞融合形成融合细胞,分析融合细胞的体外免疫杀伤效应。方法以新鲜卵巢上皮性癌组织建立卵巢上皮性癌细胞系,并进行鉴定。体外诱导产生人脐血DC。将IL-12与pcDNA3．1（＋）质粒连接后,分别通过脂质体法和电穿孔法将IL-12-pcDNA3．1（＋）质粒转染DC,再使用聚乙二酸法将新建卵巢上皮性癌细胞与转染IL-12的DC融合,用四甲基偶氮唑蓝法检测融合细胞的体外免疫杀伤效应。结果（1）形态学观察和免疫组化法检测结果均证实,新建卵巢上皮性癌细胞系为原代卵巢上皮性癌细胞。（2）人脐血培养7-10d,贴壁细胞出现大量毛刺状突起;免疫荧光染色显示,脐血DC主要组织相容性复合物Ⅱ类分子人白细胞抗原（HLA）-DR的阳性表达率为99％,共刺激分子B7-2的阳性表达率为50％。（3）RT—PCR技术检测结果证实IL—12转染DC成功。将转染IL—12的DC与新建卵巢上皮性癌细胞融合,RT—PCR技术和免疫荧光染色分析结果均证实融合细胞形成。（4）将转染IL—12的DC和新建卵巢上皮性癌的融合细胞、DC和新建卵巢上皮性癌的融合细胞分别与患者的外周血单个核细胞共同培养,激活T淋巴细胞,结果显示,两种活化后的T淋巴细胞均能杀伤新建卵巢上皮性癌细胞,且前者作用更强。结论转染IL—12后的DC与新建卵巢上皮性癌细胞融合后形成的融合细胞能激活T淋巴细胞,且其体外免疫杀伤效应更强。     

6B11抗独特型微抗体负载树突状细胞对卵巢癌细胞系细胞杀伤作用的体外研究

目的　用 6B1 1抗独特型微抗体体外负载树突状细胞 (DC) ,以期诱导出抗原特异性的抗肿瘤免疫反应。方法　分离培养HLA -A2 健康人外周血树突状细胞 ,培养过程中用 6B1 1微抗体负载 ,无关抗原F (ab)’2负载及未负载组为对照。光镜、电镜下观察树突的形态 ;流式细胞仪检测DC表面分子表达 ;3 H -TdR掺入法测DC刺激自体T细胞增殖 ;51 Cr 6h释放试验测激活的T细胞对卵巢癌细胞系的杀伤。结果　培养的树突细胞有典型形态 ,CD80、CD86、HLA -DR等表面分子呈高表达 (分别为 6 5 %、 86 2 %、 93 7% ) ;6B1 1微抗体负载的DC不仅能刺激自体T细胞的增殖 ,而且其诱导的CTL细胞对HLA -A2 、OC1 6 6 - 9 卵巢癌细胞系HOC1A有特异性的杀伤 ,结论　 6B1 1抗独特型微抗体模拟卵巢癌抗原OC1 6 6 - 9负载树突状细胞在体外可以诱导出抗原特异性的细胞毒T细胞 ,为进一步研究 6B1 1微抗体对卵巢癌免疫治疗作用提供了依据     

卵巢癌患者腹水来源树突状细胞强化CIK细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用

目的:建立诱导卵巢癌患者腹水来源的树突状细胞(DC)的方法,并观察腹水DC对CIK细胞在体外杀伤卵巢癌细胞系SKOV3的作用。方法:分离腹水单核细胞后诱导DC,分离患者外周血单个核细胞诱生CIK细胞,通过流式细胞仪分析免疫表型,并以LDH释放法检测DC对CIK细胞在体外杀伤卵巢癌细胞株的作用。结果:除外周血单核细胞来源DC表达CD86较高外,其他表面分子及异基因刺激能力在不同来源的DC间没有差异。负载SKOV3抗原的DC能诱导出CIK细胞对SKOV3细胞系最强的细胞毒杀伤力,负载HO8910的DC与单纯DC次之,且两者无差异。CIK组细胞毒性最低。结论:卵巢癌患者腹水中含有大量的免疫活性细胞,其中更有丰富的DC前体细胞,可诱导出成熟有功能的DC。冻融肿瘤细胞获取全细胞抗原法可以在不明确肿瘤特异抗原的情况下使用,负载于DC后可以诱导出CIK细胞的特异性杀伤。     

脐血中树突状细胞的体外诱导和抗肿瘤效应的实验研究

探讨脐血来源的树突状细胞（ＤＣ）的体外诱导及其在抗肿瘤免疫中的作用。方法无菌条件下常规要脐血,采用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞,去除悬浮细胞后获得单核细胞。将获得的单核细胞分为两组,实验组１在含有细胞因子白介素４（ＩＬ－４）、粒单细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）的综合成培养液ＤＭＥＭ中培养,对照组１培养液中未加上述细胞因子,第１０天收集部分细胞进行细胞表型分析,并     

卵巢癌细胞B7-H4基因高表达抑制CTL细胞杀伤作用的研究

目的:探讨卵巢癌细胞B7-H4基因高表达对靶向诱导的CTL细胞体外杀伤的影响。方法:RT-PCR法扩增编码基因,构建真核表达载体PEGFP-N1/B7-H4,脂质体介导将重组质粒PEGFP-N1/B7-H4导入SKOV3细胞中,筛选建立高表达细胞株。细胞免疫组织化检学检测B7-H4蛋白的表达。利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34+细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法从卵巢癌细胞SKOV3中提取可溶性冻融抗原并负载DC诱导生成CTL。MTT法检测经抗原负载后激活的CTL细胞对SKOV3/B7-H4、SKOV3/neo和SKOV3细胞的杀伤作用。结果:成功构建了人B7-H4真核表达载体,SK-OV3/B7-H4细胞稳定表达B7-H4蛋白。CTL细胞对SKOV3/B7-H4细胞杀伤作用明显低于阴性对照组(20.12%±3.14%vs36.34%±4.53%,P<0.05)。结论:卵巢癌细胞B7-H4基因表达可抑制靶向诱导的CTL细胞毒性,可能与肿瘤细胞免疫逃逸有着密切的关系。     

Induction of tumor-specific cytotoxicity in tumor infiltrating lymphocytes by HPV16 and HPV18 E7-pulsed autologous dendritic cells in patients with cancer of the uterine cervix

OBJECTIVE: To evaluate the potential of autologous dendritic cells (DC) pulsed with HPV16 and HPV18 E7 oncoprotein in restoring tumor-specific cytotoxicity in populations of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) for adoptive immunotherapy of cervical cancer patients. METHODS: Full-length E7-pulsed DC-stimulated CD8(+) T cells derived from peripheral blood (PBL) and from tumor tissues (TIL) were tested and compared for their ability to induce a HLA class-I-restricted cytotoxic T lymphocyte (CTL) response against autologous tumor cells. In addition, in order to correlate cytotoxic activity by CTL with a particular lymphoid subset, analysis of surface antigens and intracellular CD3 zeta chain and two-color flow cytometric analysis of intracellular cytokine expression (IFN-gamma vs IL-4) at the single cell level were performed. RESULTS: DC stimulation induced powerful cytotoxicity against autologous tumor target cells by TIL-derived CD8(+) T cells from all three cervical cancer patients, while autologous Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cell lines were not lysed. Killing of autologous tumor cells was higher by CD8(+) T cells from TIL compared to PBL (P > 0.01) and was more strongly inhibited by anti-HLA class I MAb (P > 0.05). Phenotypically, all CTL populations were CD3(+)/CD8(+), with higher levels of CD56 expression by TIL-derived CTL. Finally, although a marked Type 1 cytokine bias (i.e., IFN-gamma(high)/IL-4(low)) was observable in both PBL- and TIL-derived DC-stimulated CD8(+) T cell populations, TIL-derived CD8(+) T cells showed a higher percentage of IFN-gamma-positive cells compared to PBL. CONCLUSIONS: Full-length E7-pulsed DC can consistently restore strong CD8(+) CTL responses against autologous HPV16- and HPV18-infected cervical cancer cells. DC-stimulated TIL may represent a superior source of tumor-specific CTL compared to PBL for adoptive T cell immunotherapy of patients harboring metastatic or recurrent cervical cancer refractory to standard treatment modalities.     

光动力学处理的肿瘤细胞裂解物对大鼠骨髓树突细胞作用的体外研究

目的:研究光动力学处理的肿瘤细胞裂解物对大鼠骨髓树突细胞的体外作用,探讨光动力学治疗(PDT)在机体抗肿瘤免疫中的作用机制和光动力学处理的肿瘤细胞裂解物作为肿瘤疫苗的可行性。方法:光动力学方法处理大鼠卵巢癌NuTu19细胞,提取肿瘤细胞裂解物;应用重组大鼠rGM-CSF、rIL-4体外培养大鼠骨髓树突细胞;取培养第6天的大鼠未成熟树突细胞与光动力学处理的肿瘤细胞裂解物共培养,流式细胞仪检测细胞表型;收集上清,ELISA检测大鼠IL-12的表达;混合淋巴细胞反应测定负载光动力学肿瘤细胞裂解物的大鼠树突细胞激发T淋巴细胞增殖的能力。结果:大鼠骨髓树突细胞培养第6天,70.31%表达大鼠树突细胞特异性表面标志OX62;培养第6天的大鼠未成熟树突细胞与光动力学处理的肿瘤细胞裂解物共培养较与冻溶肿瘤细胞裂解物共培养,显著提高了成熟树突细胞的比例;IL-12表达亦明显升高(P<0.05)。负载光动力学肿瘤细胞裂解物的大鼠树突细胞对T淋巴细胞增殖刺激能力增强。结论:光动力学处理的肿瘤细胞裂解物可促进大鼠骨髓树突细胞体外成熟,并分泌IL-12;光动力学处理的肿瘤细胞裂解物可进一步作为肿瘤疫苗进行体内研究。     

卵巢上皮性癌抗独特型抗体6B11T细胞表位的鉴定

目的 鉴定卵巢上皮性癌(卵巢癌)抗独特型抗体6B11的T细胞表位,探讨其诱导抗卵巢癌细胞免疫的分子基础.方法 利用表位预测和12结合力分析实验筛选6B11的互补决定区(CDR)人白细胞抗原(HLA)A0201结合肽.以负载肽的抗原递呈细胞刺激HLA-A2阳性的自体淋巴细胞,获得特异性细胞毒淋巴细胞(CTL),经51Cr释放实验确定6B11的CTL表位.以6B11特异性CTL为反应细胞、负载肽的树突状细胞为刺激细胞,经细胞增殖实验确定6B11的辅助性T细胞(Th)表位.经细胞因子含量测定和干扰素(IFN)γ分泌细胞频数分析,进一步验证获得的表位.结果 6B11轻链可变区CDR3肽(VL CDR3)诱导的CTL能杀伤靶抗原阳性的卵巢癌细胞,该杀伤作用能被抗人主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子抗体阻断,具有MHC-Ⅰ类分子依赖性,为6B11的CTL表位.6B11重链可变区CDR3肽(VH CDR3)能诱导6B11特异性CTL的增殖,该增殖作用大部分能被抗人MHC-Ⅱ类分子抗体阻断,具有MHC-Ⅱ类分子依赖性,为6B11 Th表位.6B11及其表位联合诱导的CTL与卵巢癌细胞共育后均分泌高水平白细胞介素(IL)2(分别为1630、1503 ng/L)、IFN-γ(分别为5620、5421 ng/L)和低水平IL-4(分别为253、274 ng/L),且存在特异性IFN-γ分泌细胞,细胞频数分别为196个/1 ×106个T细胞和184个/1×106个T细胞.结论 6B11具有模拟卵巢癌抗原的CTL和Th表位,对于抗独特型抗体作为抗肿瘤疫苗应用具有重要的理论和实践价值.     

靶向沉默Gata3对妊娠期哮喘小鼠树突状细胞表型及效应T细胞失衡表达的影响

目的:研究慢病毒介导siRNA靶向沉默Gata3基因表达对妊娠哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)抗原递呈及其免疫生物学特性的影响。方法:以脂质体DNA沉淀法将重组慢病毒干扰质粒与包装质粒共转染AD293细胞,包装生成慢病毒感染体外诱导DC,RT-PCR、Western blot分析其对siGata3基因的整合转录效果;流式细胞术观察细胞表型变化。通过尾静脉注射将pSH1/siGata3转移至小鼠体内,ELISA法测定其肺泡灌洗液(BALF)中的炎性因子含量;MTT法验证混合淋巴细胞反应(MLR)后T细胞增殖能力。结果:经重组、包装携有Gata3特异siRNA慢病毒感染DC成功,其siRNA靶点Gata3 mRNA及蛋白的转录表达分别下调87.30%和81.33%(P0.05);同时降低DCs膜表面CD86荧光强度(P0.05)。减少pSH1/siGata3组小鼠BALF中IL-5、IL-17分泌而提升IL-12水平(P0.05);MLR证实,共培养感染DC激活T细胞的能力明显不足(P0.05)。结论:siRNA干扰可有效抑制模型小鼠免疫微环境特定Gata3通路,阻遏T细胞及其亚群分化由此来诱导DC免疫耐受,为妊娠期哮喘防治奠定基础并提供新的思路和手段。