构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体

目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌。pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Westernblotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达。结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低。结论成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础。     

小鼠4-1BBLcDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆小鼠4-1 BBL基因，构建其真核表达载体，并观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：取C57BL/6小鼠脾细胞，经PHA诱导后，以RT-PCR克隆4-1 BBLcDNA，测序，构建pCDNA3．1( )-m4-1BBL真核表达质粒，转染COS-7细胞，RT-PCR检测m4-1BBLmRNA表达，间接免疫荧光法和流式细胞仪检测4-1 BBL蛋白的表达，结果：从小鼠脾细胞中克隆到m4-1 BBL cDNA，经测序完全正确，所构建的m4-1BBL质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论：小鼠4-1BBLcDNA基因克隆、真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

survivin基因启动子驱动的肿瘤特异性腺病毒载体的构建

目的:构建肿瘤特异性启动子驱动的腺病毒载体,检测survivin基因启动子在喉癌细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,构建分别携带survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Ad-SP-EGFP和Ad-CMV-EGFP,后转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP表达。结果:成功构建survivin基因启动子的腺病毒载体;Ad-SP-EGFP转染后荧光镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞无表达。结论:成功制备肿瘤特异性survivin启动子驱动的腺病毒,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

人膜连蛋白A2基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达

目的:构建重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag,并检测其在小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6的表达情况。方法:利用DNA重组技术将人膜连蛋白A2(annexin A2,ANXA2)基因克隆入慢病毒表达载体pWPT中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag与包装质粒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-ANXA2-Flag,并感染小鼠肝癌细胞株Hepa 1-6,用RT-PCR检测ANXA2 mRNA转录水平,Western blot法检测ANXA2-Flag蛋白的表达情况,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag;RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染Hepa 1-6细胞后,ANXA2基因能够在细胞内正确的转录、翻译并稳定表达ANXA2蛋白;经过LV-ANXA2-Flag感染后,Hepa 1-6细胞S期细胞比例明显高于对照细胞。结论:成功建立ANXA2基因慢病毒表达载体pWPT-ANXA2-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠肝癌...     

编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建Nogo受体(NgR)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行缺血性脑损伤的基因治疗研究奠定基础.方法:将前期构建的大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含NgR基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌.将pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Adeno-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、PCR产物测序及病毒滴度测定.结果:结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后的PCR及DNA测序结果证明Adeno-U6-shRNA包被成功.结论:成功构建了大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体Adeno-U6-shRNA,将为应用基因沉默技术研究NgR在缺血性脑损伤后神经再生中的作用奠定基础.     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

甲胎蛋白基因转录调控元件驱动白细胞介素-2基因在肝癌细胞中的特异性表达

目的利用小鼠甲胎蛋白(AFP)基因转录调控元件驱动白细胞介素-2(IL-2)基因在肝癌细胞中特异性表达.方法构建逆转录病毒载体pDOR-mAFP-IL-2,采用经包装后的病毒分别感染AFP阳性的小鼠肝癌细胞Hepa1-6和AFP阴性的小鼠ψ2细胞,检测IL-2表达.结果该载体能使IL-2基因在Hepa1-6细胞中特异性表达而不能在ψ2细胞中表达.结论采用具有肝癌特异性活性的AFP基因转录调控元件可以驱动IL-2基因在肝癌细胞中特异性表达,为进一步开展直接体内靶向性肝癌基因治疗实验研究提供了依据.     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体,检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,构建分别携带Survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pSurp-EGFP和pCMV-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Adeno-SP-EGFP和Adeno-CMV-EGFP,分别转染BIU87及SV-HUC-1,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP,其转染BIU87及SV-HUC-1后,在荧光显微镜下可以观察到BIU87细胞呈现出较强绿色荧光,而SV-HUC-1细胞中仅有散在少量绿色荧光。结论成功制备的携带有Survivin启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,为下一步进行肿瘤特异性的基因治疗研究奠定了基础。     

小鼠CD200基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建携带小鼠 CD200 基因的重组腺病毒载体,并鉴定其在小鼠胰腺内皮细胞（mile sven 1,MS1）中mCD200基因的表达情况。方法：mCD200 基因亚克隆至腺病毒穿梭质粒pYr-adshuttle-4,获得重组质粒 pYr-ads-4-mCD200。从该重组质粒上利用LR（attL×attR）特异性同源重组的方法,将 mCD200 表达框构建至腺病毒骨架质粒pAd/PL-DEST上,获得的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切,转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAd-4-mCD200,并用酶切和PCR等鉴定。采用TCID 50（tissue cell infectious dosage 50,TCID50）法测定重组腺病毒滴度。同时在HEK293细胞中进行病毒扩增,并感染小鼠内皮细胞MS1,通过荧光显微镜、real-time PCR检测MS1中小鼠CD200基因的表达。结果：PCR鉴定重组腺病毒证实重组腺病毒rAd-4-mCD200 构建成功;扩增后检测病毒滴度约为109~1010 pfu/ml;荧光显微镜及real-time PCR检测发现该重组腺病毒能在MS1细胞中高效的表达。结论：构建的重组腺病毒 rAd-4-mCD200在MS1细胞中成功表达mCD200基因,为下一步开展关于CD200 基因免疫抑制调节等相关研究奠定了基础。     

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能，构建人4-1BBI。转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBI。全长基因，继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／4-1BBI。与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。^3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响，ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明，L929／4．1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明，L929／4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因，构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929／4-1BBL，该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号，促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。     

稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立

目的建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株。方法以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR．26a序列418bp,片段两侧添加XbaI和BamHI酶切位点,In．Fusion克隆至pHAGE．fullEFla．MCS．IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定;所构建的载体命名为pLVT．miR26a。获得pLVT．miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞（Hepl．6）、人肝癌细胞（BEL．7402、HepG2、Sk—Hep．1、HepG2．1uc）,以建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞系：qRT．PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平。结果测序和酶切证实成功构建了pLVT．miR26a,按标准程序生产的携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞。结论成功建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础。     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。     

大鼠PEDF44mer慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠色素上皮衍生因子（PEDF）44mer基因的慢病毒表达载体并检测其表达.方法 化学合成PEDF 44mer-6his,亚克隆入GV206载体,测序鉴定.挑取阳性克隆转染293T细胞,实时荧光定量PCR法测定病毒滴度.将已构建的病毒转染293T细胞,RT-PCR和Western blot法检测44mer-6his表达.结果 阳性克隆测序与设计的44mer基因序列完全一致,44mer慢病毒构建成功.实时荧光定量 PCR法检测病毒滴度为2.00E＋9 TU/ml.44mer慢病毒转染293T细胞后,RT-PCR检测到44mer表达.Western blot显示44mer-6his融合蛋白表达阳性.结论 成功设计构建了PEDF 44mer慢病毒,为进一步研究44mer在缺血性心肌病中的作用和机制奠定基础.     

重组腺相关病毒介导TRAIL对卵巢癌裸鼠肝转移的抑制作用的实验研究

目的探讨重组腺相关病毒介导TRAIL对卵巢癌裸鼠肝转移的抑制作用。方法构建卵巢癌裸鼠肝转移模型。选择重组腺相关病毒rAAV—PEG—sTRAIL治疗，将裸鼠分为TRAIL治疗组和对照组，治疗6w后，观察肝转移率和肝转移结节数；Tunnel法分析TRAIL对肿瘤细胞的凋亡诱导情况。结果全身系统性给予重组腺相关病毒介导TRAIL后，治疗组和对照组相比转移率低，肝转移结节数目少，差异有统计学意义（p〈0．05）；Tunnel法分析TRAIL可诱导肿瘤细胞凋亡。结论重组腺相关病毒介导TRAIL可抑制卵巢癌裸鼠肝的转移生长，TRAIL用于卵巢癌肝转移的基因治疗中具有较好的应用前景。     

甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测

目的构建甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的原核表达载体,诱导NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定;预测人NP蛋白的B细胞抗原表位。方法以pcDNA3.1(+)/NP为模板,利用PCR方法扩增目的片段NP,再将此片段插入原核表达载体pET-32a(+),并进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的质粒转入表达菌Rosetta-gami(2)中,用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测表达产物。按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplns-Schulz方法预测蛋白骨架区的柔韧性;用Kyte-Doolittle方法预测其亲水性,Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数。结果成功构建了流感病毒核蛋白(NP)的原核表达载体,经SDS-PAGE检测NP蛋白得到了表达,Western Blot证明表达的重组蛋白具有免疫活性。在蛋白质第6～11、79～91、241～248和319～326区段附近很可能为B细胞表位优势区域。结论流感病毒核蛋白的表达及B细胞表位的预测为流感病毒的快速诊断试剂的研发工作提供了基础。     

pLIVE—IL-1β表达载体的构建及在Hepal- 6细胞的表达

目的构建应用于体内表达和研究的小鼠IL-1β肝癌细胞特异性表达载体，观察其在小鼠HE—PA1-6细胞中的表达水平。方法分离BALB／c小鼠外周血淋巴细胞，LPS刺激后提到总RNA，RT—PCR扩增IL-1β基因，与pLIVETM连接构建pLIVE-IL-1β重组表达载体，并通过菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列分析进行鉴定。利用TransITTM将pLIVE-IL-1B转染至Hepa1-6肝癌细胞，RT—PCR分析IL-1β的表达水平。结果从小鼠腹腔巨噬细胞中RT-PCR扩增得到一822bp的片段，纯化的PCR产物与pLIVETM同时经XhoⅠ和NheⅠ双酶切后连接，菌落PCR鉴定获得多个阳性克隆，经质粒XhoⅠ4-NheⅠ限制性酶谱分析，酶解出822bp的条带，DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GeneBank登录的小鼠IL-1β基因一致。将该载体转染Hepal-6细胞，RT．-PCR证实，与转染pLIVETM的对照细胞相比，IL-1β的表达水平明显升高。结论成功构建了小鼠IL—1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL—1β，该载体能够在小鼠肝癌细胞中稳定高效表达IL-1β。