慢性粒细胞白血病树突状细胞的体外定向诱导扩增及鉴定

目的：W本外定向诱导扩增慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血单个核细胞（PBMNC）来源的树突状细胞（CML－DC）并测定其表型。方法：取CML患者新鲜抗凝血,用淋巴细胞分离液分离PBMNC,经细胞因子rhGM-CSF,rhIL-4,rhTNF-α联合刺激培养9－12d,收集培养细胞,光镜形态学分析并细胞计数,结合PE－CD1a单抗、FITC－CD14居流式细胞 （FCM）上进行CML－DC比例及表型分析。结果CML患者PBMNC经以上细胞因子联合培养,CML－DC含是可达3．5％－23．5％,而新鲜分离的CML患者PBMNC中CML－DC含量仅为0．1％－1％,结论CML患PBMNC 体外定向诱导扩增培养可以生成较多的CML－DC,从而为CML的免疫治疗应用于临床提供了基础。     

慢性髓性白血病细胞来源的树突状细胞大容量诱导及其功能的实验研究

目的　探索大容量诱导慢性髓性白血病 (CML)细胞来源的树突状细胞 (DCs)的适宜方法 ;研究CML DCs刺激自体T淋巴细胞增殖并分泌γ 干扰素 (IFN γ)的能力。方法　用CS 30 0 0 plus血细胞分离机采集初诊CML病人的外周血单个核细胞 (PBMNCs) ;单采的CML PBMNCS转入组织培养袋 ,加入重组人粒 巨细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,培养诱导 7d ;在诱导前后 ,用流式细胞仪分别检测细胞表面HLA DR、CD1a、CD80和CD86的表达水平 ;用3 H TdR掺入法检测CML DCs和CML PBMNCs刺激自体和异体T细胞增殖的能力 ;用ELISA法检测在自体混合淋巴细胞培养 (MLR)时T细胞分泌的IFN γ浓度。结果　用血细胞分离机收集的CML PBMNCs ,在组织培养袋内经细胞因子培养诱导 ,HLA DR、CD1a、CD80、CD86的表达均有明显上调 ,细胞形态也表现典型的DC特征 ;CML DCs能显著刺激自体和异体T细胞增殖 ,而CML PBM NCs仅能刺激异体T细胞的增殖 ,刺激自体T细胞增殖的能力很弱 ;刺激自体T细胞增殖时分泌的IFN γ浓度 ,CML DCs组为 (877± 2 14 )pg/mL ;CML BPMNCs组仅为 (14± 1.7) pg/mL。 结论　单采的CML PBMNCs转入组织培养袋 ,加入rhGM CSF和rhIL 4 ,可收获大容量的CML DCs;CML DCs在体外具有显著刺激自体T细胞增殖     

当归多糖促进慢性粒细胞白血病细胞性树突状细胞的诱导生成

目的 探讨当归多糖(APS)对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞(DCs)的影响。方法 取慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞，分别予粒-巨噬集落刺激因子(GM—CSF)／白介素-4(IL-4)培养或GM-CSF／IL-4联合各浓度APS(50，100，200mg／L)培养，普通光镜和电镜观察细胞形态，台盼蓝拒染法检测细胞成活率，流式细胞仪检测DCs的免疫表型(CD80，CD86，CD83)，自体或异体混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力。结果GM-GSF/TL-4或GM-CSF，IL-4／APS诱导培养的慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞均表现出典型的树突状形态而且表达高水平的免疫表型。GM-CSF／IL-4／APS培养的DCs的细胞成活率和增殖能力显著提高，CD83，CD80，CD86表达显著升高，APS组慢性粒细胞白血病细胞诱导的树突状细胞(CML-DCs)刺激T淋巴细胞的增殖能力更强。结论 GM-CSF/IL-4/APS培养的DCs的CD83，CD80、CD86表达率明显高于GM-CSF／IL-4组。GM-CSF／IL-4／APS诱生的CML-DCs刺激T淋巴细胞增殖能力强于GM-CSF／IL-4组。APS能促进IL-4和GM-CSF对CML-DCs的诱生与成熟。     

慢性粒细胞白血病来源的DC细胞体外诱导高效而特异的抗肿瘤免疫

目的：选用慢粒患者的原代血细胞,经细胞因子组合联合诱导,生成携带白血病抗原信息的树突状细胞（Ｄｅｎｄｒｉ－ｔｉｃＣｅｌｌ,ＤＣ）,为ＤＣ疗法在临床上的应用提供理论依据。方法：慢粒（急变期）病人的ＰＢＭＣ用ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４＋ＴＮＦα诱导后进行形态和细胞表型的鉴定。应用同种混合淋巴细胞反应和细胞毒性实验,观察诱生之ＤＣ刺激淋巴细胞增殖的能力以及介导抗白血病特异性细胞毒性反应的能力。利用酶联免疫吸附实验检测ＤＣ产生ＩＬ－１２及协助产生ＩＦＮ－γ的能力。结果：诱生ＤＣ均具有ＤＣ的形态特征和超微结构。表达ＤＣ相关表面分化抗原。并可刺激Ｔ淋巴细胞产生较强的增殖效应。诱导出针对自身肿瘤靶细胞的特异性ＣＴＬ反应。同时可不同程度的分泌ＩＬ－１２和可协助Ｔ细胞产生ＩＦＮ－γ。结论：慢粒细胞在适当的细胞因子的诱导下,可分化为具有ＤＣ形态的细胞,后者可诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫。     

人慢性粒细胞白血病树突状细胞的培养和鉴定

为探讨树突状细胞(ＤＣ)疫苗在慢性髓性白血病(ＣＭＬ)治疗中的作用,我们首先建立从ＣＭＬ骨髓和外周血单个核细胞中培养ＤＣ的方法,并比较ＣＭＬ来源的ＤＣ与正作者单位:100034北京医科大学人民医院血液病研究所常骨髓来源的ＤＣ在形态和表面分子表达等方面的差异,以寻找提高ＣＭＬ来源树突状细胞功能的措施,为进一步应用ＤＣ疫苗治疗ＣＭＬ提供线索。一、对象与方法1对象:25例成人Ｂｃｒ/Ａｂｌ融合基因和染色体阳性ＣＭＬ慢性期骨髓和外周血标本,诊断和分期依据国际骨髓移植登记组分期标准。正常骨髓标本6例。2树突状细胞培养:骨髓或外周…     

rhGM-CSF联合rhIL-4对髓性白血病细胞B7分子表达的上调作用

目的 探讨GM－CSF联合IL－4对髓性白血病细胞表面B7分子表达的上调作用。方法 从初诊急性或慢性髓性白血病患者的外周血中分离出单个核细胞（PBMNC）,用rhGM-CSF联合rhIL-4共同孵育7－10d;通过流式细胞仪检测细胞因子诱导前后细胞表面B7分子的表达。结果 未经细胞因子诱导的白血病细胞表面B7分子低表达或缺如,经过GM－CSF联合IL－4 7－10d的诱导,可显著上调B7分子的表达。结论 髓性白血病细胞表面存在B7分子表达缺陷;用GM－CSF联合IL－4进行诱导是纠正这种缺陷的一条途径。     

慢性粒细胞白血病树突状细胞诱导及其抗肿瘤功能的体外研究

目的 探讨人慢性粒细胞白血病(CGL)来源的树突状细胞(DC)的免疫功能。方法 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)联合重组人白介素(rhIL)-4在体外诱导培养CGL细胞,获得DC。应用流式细胞仪(FACS)检测诱导前、后的细胞表型,观察其诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的体外抗肿瘤效应。采用酶联免疫吸附试验(ELIS)测定DC培养及DC与外周血单个核细胞(PBMNC)共同培养的上清液中IL-12及干扰素(IFN)-γ的量。结果 联合rhGM-CSF及rhIL-4可诱导CGL细胞分化为DC;CGL-DC体外激活的CTL对CGL细胞具有特异性细胞毒活性;分别从诱导DC培养上清液和DC PBMNC培养的上清液中检测出一定量IL-12及IFN-γ。结论 CGL-DC具有抗原提呈细胞的免疫功能,可望用于CGL的免疫治疗。     

自体树突状细胞用于慢性粒细胞白血病骨髓净化的初步研究

目的 考察慢性粒细胞白血病（CML）树突状细胞（DC）刺激自体骨髓T细胞,清除白血病细胞的作用。方法 采用3例CML病人（2例慢性期和1例急变期）外周血,分离单个核细胞（PBMNC）,经塑料贴壁后在含自体血浆、重组人白介素4（rhIL－4)、重组人粒－单集落刺激因子（rhGM－CSF）和重组人肿瘤坏死因子（rhTNFα）的RPMI－1640培养液。37℃CO2孵箱培养10天,或用免疫磁珠从PBMNC分离DC,在含自体血浆、rhGMCSF和rhTNFα的RPMI1640培养液培养3天,收获的细胞即DC加到含rhIL－2的Dexter骨髓长期培养体系,置37℃,5％CO2孵箱培养7天,观察前后骨髓细胞的免疫表型和P210阳性细胞比例。结果 从CML病人外周血获得的DC大多数表达P210。在含rhIL－2的Dexter体系加入DC能进一步增加体系中的T细胞数。在2例慢性期病人体系中的P210。在含rhIL－2的Dexter体系加入DC能进一步增加体系中的T细胞数。在2例慢性期病人体系中的P210阳性细胞减少,但在急性期病例,体系中P210细胞明显增加。结论 CML病人的DC表达P210,能刺激自体骨髓中T细胞增生,在慢性期病人,这些自体DC活化的骨髓T细胞有清除白血病细胞的作用。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓中不同细胞诱生树突状细胞的体外研究

目的:体外诱导慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)、CD34+细胞、单核细胞为树突状细胞(DCs),并对其形态、表型及其刺激T细胞增殖作用进行比较。方法:利用GM-CSF、IL-4、TNF-α体外定向诱导生成树突状细胞,利用流式细胞仪对所诱生的细胞进行细胞形态及表型检测,用D-FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性。并应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果:CML患者BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞体外均可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs,前者DCs产量明显高于后二者,但均具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力,且三者无显著性差异。结论:来源于CML患者骨髓的BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞均可诱生成CMLDCs,对T细胞均具有刺激增殖能力,但BMMNCs所诱生的DC主要来源于未成熟的中性粒细胞。     

慢性粒细胞白血病患者树突状细胞抗原加工递呈和迁移功能观察

目的:研究细胞因子体外联合诱导培养的慢性粒细胞白血病(CML)患者树突状细胞(DCs)的表型和抗原递呈、分泌和迁移功能的变化.方法:分离CML患者(CML组)和健康志愿者(正常组)外周血单个核细胞(PMNCs),经培养获取贴壁细胞,将CML组和正常组的贴壁细胞及K562细胞用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α体外诱导10 d后,流式细胞仪检测细胞的免疫表型;培养5 d后,用ELISA检测细胞的内吞功能;应用混合淋巴细胞培养分析3组DCs对静息T细胞的免疫刺激活性.结果:正常组、CML组、K562组DCs的特异性标志CD83和共刺激分子标记CD80和CD86以及CD11和HLA-DR的表达差异无统计学意义(P＞0.05);DCs的抗原吞噬、迁移能力和对T细胞的免疫刺激活性,CML组和K562组之间差异无统计学意义(P＞0.05),CML组和正常组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论:CML患者DCs的免疫表型和正常人相似,但其抗原捕获、递呈和迁移功能有缺陷.     

慢性髓系白血病来源的树突状细胞生物学特性的研究

目的:体外诱导慢性髓系白血病(CML)原代细胞分化生成树突状细胞(Dendritic cells DCs),并研究其生物学特性和功能.方法: 分离初诊13例CML患者的骨髓单个核细胞和5例正常人外周血的单个核细胞,用rhGM -CSF 1 000 U/ml、rhIL-4 500 U/ml和TNF-α50 U/ml联合培养10 d;形态学(Wright染色、倒置显微镜、透射电镜),免疫学(CD80、CD86、CD83、CD 1a、HLA-DR)鉴定,荧光原位杂交(FISH)进行细胞遗传学分析,ELISA检测分泌IL- 12的能力和混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能.结果:慢性白血病细胞体外诱导后,大部分细胞呈现树突状细胞的典型形态,而且有免疫标记的明显上调(CD 86 24.49±25.87 vs 61.73±28.54;CD1a 10.41±9.52 vs 47.26±3 5.60,P<0.05);FISH证实这类DC还携带有白血病克隆,并且具有分泌IL-12和刺激T淋巴细胞增殖的能力.结论:在体外可成功地将CML细胞诱导分化成树突状细胞 ,这类DC与正常DC无论在形态学和免疫学表达方面均相似,但是功能较弱.     

甲磺酸伊马替尼对慢性髓细胞白血病树突状细胞发育的影响及机制探讨

目的 研究甲磺酸伊马替尼（Imatinib,STI571）对慢性髓细胞白血病（CML）树突状细胞（DC）发育的影响及探讨其可能作用机制.方法 分离CML骨髓单个核细胞,在培养体系中加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）培养（对照组）和在此基础上再加入STI571培养（实验组）,于第8天加入重组人肿瘤坏死因子d（rhTNF-α）进一步刺激成熟.观察培养后细胞形态、表型、混合淋巴细胞反应等指标,检测培养上清血管内皮生长因子（VEGF）浓度、细胞核因子κB（NF-κB）活性.结果 2组均呈现典型的树突状细胞形态,实验组CD80、CD86、CD83和人类白细胞抗原DR（HLA-DR）的表达、刺激淋巴细胞增殖的能力显著高于对照组（均P＜0.05）;实验组VEGF浓度显著低于对照组（P＜0.05）,而NF-κB活性显著高于对照组（P＜0.05）.结论 STI571可促进CML骨髓来源DC的活化,这可能与其解除了CML来源VEGF对DCNF-κB活性的抑制有关.     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞的体外扩增培养

目的 :探讨慢性髓性白血病 (CML)来源的树突状细胞 (DC)的体外扩增及其功能 .方法 :采用两步法 ,首先将慢性髓性白血病骨髓或外周血CD34+ 细胞与rhFlt3 L和rhTPO共育 7d,再用rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4诱导培养1 4d ;同时以rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4直接诱导体系作对照 .获得的DC通过免疫表型检测、电镜分析及染色体鉴定 ,并用MTT法检测其刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细胞的杀伤作用 .结果 :两步法培养 2 1d ,CML的CD34+ 细胞扩增 (76 . 5 6± 5 . 1 7)倍 ,DC产率 (39. 1 0± 8. 0 3) % ,直接诱导产生DC扩增倍数及比例均低于两步法 (P <0 . 0 1 ) ,且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖进而杀伤CML细胞 .结论 :两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率 ,优于直接诱导培养 ;CML细胞来源的DC可诱导抗白血病免疫应答的产生     

慢性粒细胞白血病干细胞microRNA的表达

目的 通过比较慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓的白血病干细胞(LSC)和健康人骨髓正常造血干细胞(HSC)的microRNA (miRNA)表达谱,鉴定在CML LSC表达异常的miRNAs.方法 通过磁珠法分选获得分子表型为CD34+ CD38-的CML LSC和正常HSC.使用Exiqon人miRNA芯片检测miRNA的表达情况.选取差异表达的miRNAs进行qRT-PCR验证.结果 利用Exiqon人miRNA芯片一共检测了1 900个人源miRNAs的表达情况.其中1个miRNA在CML LSC中发生显著的表达上调,46个miRNAs发生显著的表达下调.基于KEGG的pathway显著性分析显示,CML LSC表达下调的miRNAs参与的显著性信号转导通路是神经营养因子信号通路.qRT-PCR检测miR-584-5p、miR-675-3p和miR-431-5p的表达情况与miRNA芯片检测结果一致.结论 鉴定了在人CML LSC中表达异常的miRNAs,为miRNA在CML LSC中的潜在应用奠定基础.     

儿童B系急性淋巴细胞白血病树突状细胞的生物学特性

目的 体外诱导培养正常儿童与B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)儿童的树突状细胞(DC),比较二者的生物学特性.方法 分离10例B-ALL初诊患儿(ALL组)和10例正常儿童(对照组)的外周血单个核细胞,以rhGM-CSF(20 ng/mL)、rhIL-4(10 ng/mL)及TNF-α(10 ng/mL)联合培养8 d,显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞免疫表型(CD11c、CD80、CD83、CD86),ELISA检测培养上清中IL-12的浓度,混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能,电化学法检测上清中葡萄糖浓度.结果 ALL组细胞未表现出DC的典型形态,CD11c、CD80、CD83、CD86表达均较对照组细胞低(P< 0.05),分泌IL-12的能力弱于对照组细胞(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖的能力弱于对照组细胞,ALL组细胞培养上清中的葡萄糖浓度高于对照组(P<0.05).结论 B-ALL来源的DC成熟度异常,功能减弱,葡萄糖代谢异常可能是其成熟异常的原因之一.     

格列卫联合清髓性异基因造血干细胞移植治疗慢性髓性白血病

目的:探讨格列卫联合清髓性异基因造血干细胞移植在治疗慢性髓性白血病(CML)中的作用。方法:9例CML患者(5例CP,2例为AP,2例为BP),男性,在清髓性异基因造血干细胞移植前、后口服格列卫(300~600 mg/d)治疗,移植预处理方案为BuCy2:Bu 16 mg/kg,口服(6例)或12.8 mg/kg,静脉滴注(3例)加CTX 120 mg/kg。供受者HLA配型完全相合,其中亲缘移植7例,无关供者移植2例。以霉酚酸酯联合环孢菌素A和短程MTX预防aGVHD。移植物有核细胞数5.3(3.7~8.7)×108/kg,CD34 细胞数4.8(2.8~8.5)×106/kg,粒-巨噬细胞集落形成的单位数2.8(1.9~5.3)×105/kg。结果:9例CML患者在移植前,经格列卫治疗后获完全血液学缓解(HCR)。移植后中性粒细胞>0.5×109/L中位时间12(8~26)天,血小板计数>20×109/L中位时间为20(8~25)天。移植后并发/度aGVHD3例,cGVHD4例,无早期死亡。移植后30天9例患者均获完全细胞遗传学缓解(CCR),STR检测供髓完全植入。中位随访31(7~34)月,1例治疗前CML急变患者移植后4月因复发死亡,其余病患均获完全分子学缓解(CMR),总体无病生存率88.9%。结论:清髓性异基因造血干细胞移植前、后联合格列卫治疗CML,是一种安全有效的治疗方法,值得临床进一步推广。     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。