不同剂量的阿托伐他汀对心肌损伤大鼠内皮祖细胞动员及血管内皮功能的影响

目的观察不同剂量的阿托伐他汀对心肌损伤后大鼠骨髓和外周血内皮祖细胞动员及血管内皮功能的影响。方法S-D大鼠背部皮肤多点注射异丙肾上腺素(5mg/kg)制造心肌损伤模型后,随机分为生理盐水对照组和不同剂量的阿托伐他汀组[5、10、20、40及80mg/(kg.d)]。4周后,流式细胞仪检测大鼠外周血CD34 和血管内皮生长因子受体2 双阳性细胞数。骨髓和外周血单个核细胞于M199培养基培养,FITC标记的异凝集素和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白染色双阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞,倒置荧光显微镜计数3个随机高倍视野数。阿托伐他汀灌胃3天后测定血清一氧化氮浓度。结果阿托伐他汀各剂量组骨髓培养内皮祖细胞均较对照组明显增加(P<0.05),其中40mg/(kg.d)组内皮祖细胞数量最多,较对照组增加了2.4倍(P<0.05),80mg/(kg.d)组与40mg/(kg.d)组比较稍有下降,但无统计学差异;阿托伐他汀组外周血培养内皮祖细胞较对照组明显增加,40mg/(kg.d)组增加最明显(P<0.05);心肌损伤后外周血CD34 /血管内皮生长因子受体2 细胞较损伤前增加(P<0.05),其中80mg/(kg.d)组最明显,较对照组增加了4.18倍(P<0.05),40mg/(kg.d)组与80mg/(kg.d)组无统计学差异;阿托伐他汀各剂量组血清一氧化氮浓度较对照组明显增加,其中80mg/(kg.d)组增加最明显,并随剂量增加一氧化氮浓度增加。结论阿托伐他汀具有显著的剂量依赖性骨髓动员、促进外周血中内皮祖细胞迁移、改善血管内皮功能的作用。     

2型糖尿病外周血内皮祖细胞的诱导分化及影响因素的研究

目的观察2型糖尿病（T2DM）外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）在体外的分化增殖能力及影响因素。方法取20例T2DM无并发症患者、19例T2DM合并血管并发症患者和21例对照人群外周血EPC培养，观察细胞形态学变化并计数，用流式细胞仪检测贴壁细胞的特异性标志。结果糖尿病血管并发症组培养获得的EPC和EPC集落低于糖尿病无并发症组（P〈0．05）和对照组（P〈0．01）。EPC数量与SBP及FPG呈负相关（R=-0.266，P〈0.05；R=-0.619，P〈0．01），糖尿病人EPC集落生成数量与HbA1C水平呈负相关（R=-0．749，P〈0.05），与糖尿病病程年呈负相关（R=-0.406，P〈0．01）。结论FPG和SBP与EPC的增殖分化有关，T2DM外周血EPC数目减少，与HbA1c、SBP及病程相关。     

外周血内皮祖细胞数量及eNOS基因表达在动脉粥样硬化大鼠中的改变

目的:探讨外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及动脉内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达在动脉粥样硬化(AS)大鼠中的改变。方法:将70只大鼠分为3组:正常对照组20只,采用假手术+普通饲料喂养;实验对照组20只,采用假手术+高脂饲料喂养;AS组30只,采用球囊损伤主动脉内皮、维生素D33×105 U·kg-1·d-1分6次肌内注射和饲以高脂饲料喂养。90d后分别采外周血进行EPCs的分离培养,于倒置相差显微镜下计数内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU),并采用Real-time PCR法检测腹主动脉中eNOS基因的表达。结果:与正常对照组和实验对照组相比,AS组外周血EPCs数量明显减少(P<0.01),eNOS基因表达明显下调(P<0.01);EPCs数量及eNOS表达在正常对照组和实验对照组中差异无统计学意义。结论:AS时EPCs数量减少,eNOS基因表达明显下调。     

芪红合剂含药血清对体外培养人外周血内皮祖细胞NO及NOS的影响

目的观察芪红合剂含药血清对人外周血内皮祖细胞(EPCs)一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影响,探讨其对人外周血内皮祖细胞的保护机制。方法12只雄性Wistar大鼠随机分为芪红合剂组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)和对照组,制备含药血清和空白血清。采集健康成人外周血,分离单核细胞,体外培养7d后,收集贴壁细胞,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪鉴定正在分化的EPCs,加入含不同浓度芪红合剂药物血清及空白血清的M199培养基孵育24h,将其在倒置荧光显微镜下计数,硝酸还原酶法测定NO,化学比色法测定NOS。结果芪红合剂药物组的血清NO水平和NOS活性明显高于空白血清对照组(P0.05),并且呈剂量依赖性。结论芪红合剂可能通过增加EPCsNOS活性,促进NO分泌,防止血管内皮损伤及动员血管内皮祖细胞修复损伤血管来发挥血管内皮保护作用。     

内皮型一氧化氮合酶对内皮祖细胞生物学功能的影响

一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)参与调节机体多种生理活动,在心血管系统中的作用亦倍受重视。近年来,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的又一生物学作用已引起人们的关注。本文探讨了eNOS在内皮祖细胞的动员、分化和归巢中的作用,及其促进内皮祖细胞的生物学功能。     

内皮型一氧化氮合酶对内皮祖细胞生物学功能的影响

一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)参与调节机体多种生理活动,在心血管系统中的作用亦倍受重视.近年来,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的又一生物学作用已引起人们的关注.本文探讨了eNOS在内皮祖细胞的动员、分化和归巢中的作用,及其促进内皮祖细胞的生物学功能.     

兔血管内皮祖细胞的分离及诱导分化

目的:探讨自兔骨髓中分离及诱导血管内皮祖细胞(EPCs)的方法。方法:抽取兔骨髓,Ficoll离心液梯度离心,分离出骨髓单个核细胞,用含有血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的M199培养液诱导培养EPCs,透射电镜及免疫荧光法对所培养细胞进行鉴定。结果:细胞诱导培养48~72h后即可见有细胞贴壁,逐渐变成梭形。培养至8d左右,可观察到数条由梭形贴壁细胞直线生长连接而成的条索,7~10d出现多个细胞团,贴壁的梭形细胞开始从细胞团的边缘出芽长出,培养至14d左右,细胞逐渐融合,连接成大片条索状结构。透射电镜及免疫荧光检查证实为血管内皮祖细胞。结论:梯度离心法自兔骨髓获得单个核细胞,在体外经诱导分化可获得血管内皮祖细胞。     

体外D3小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的研究

目的复制体外胚胎干细胞（ESCs）向内皮细胞分化的模型,明确ESCs向内皮细胞分化的进程,确定细胞移植的最佳时间点。方法在含有血管内皮生长因子165、碱性成纤维细胞生长因子的诱导分化培养基中,体外诱导小鼠ESCs向内皮细胞分化,在分化的第3、6、9、12天检测内皮细胞特异标志物血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）和血管性假血友病因子（vWF）,并观察分化过程中细胞形态及生长方式改变。结果细胞分化第6天,部分细胞爬出细胞集落,增大并呈单层生长方式生长;第9天表达VEGFR-2及vWF;第12天细胞内空泡形成、胞体碎裂,细胞衰老。结论在本实验条件下,分化第9天的细胞分化完成、状态良好,适合血管损伤疾病的细胞移植治疗。     

原花青素对高糖环境下大鼠内皮祖细胞血管内皮生长因子受体2及其传导通路的影响

目的探讨高糖环境下原花青素(OPC)对体外培养的大鼠内皮祖细胞血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)及其下游相关通路的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC);分别检测正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)培养的EPC增殖和氧化应激产物产生情况,再通过在不同原花青素浓度下检测各时间点EPC增殖的方法,筛选出最佳原花青素浓度(30 mg/L);分别用Matrigel基质胶检测正常糖+OPC组、正常糖组、高糖+OPC组、高糖组EPC成管能力;最后在1、3、5、7天分别检测正常糖+OPC组、正常糖组、高糖+OPC组、高糖组EPC的丙二醛水平以及VEGFR-2、p-AKT、核因子κB(NF-κB)和核因子κB抑制蛋白α(IKB-α)的相对表达量。结果随时间推移,高糖组中EPC细胞凋亡和氧化应激产物均较正常糖组逐渐增多;正常糖+OPC组、正常糖组EPC成管数目无明显差异,高糖+OPC组成管数目较高糖组明显增多;在1、3、5、7天时OPC在正常糖浓度下对EPC产生的氧化应激产物及VEGFR-2、p-AKT、NF-κB和IKB-α蛋白的相对表达量没有显著影响,而在高糖环境下可以明显降低氧化应激产物的生成及上调VEGFR-2、p-AKT和NF-κB蛋白相对表达量,下调IKB-α蛋白相对表达量。结论原花青素可能通过缓解高糖环境对EPC的氧化损伤作用,上调内皮祖细胞VEGFR-2及其下游通路蛋白表达,进而促进细胞增殖。     

辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞分化的不同影响

目的：观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞（SPC）和内皮祖细胞（EPC）分化的影响。方法：采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入不同浓度辛伐他汀（0．01～10μmol／L）培养8d。采用平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定FITC—UEA—I和Di I-acLDL双染阳性细胞为正在分化的EPC,并在倒置荧光显微镜下计数。结果：辛伐他汀显著抑制骨髓单个核细胞分化为SPC。0．01μmol／L辛伐他汀组与对照组SPC数量分别为79±5对85±4（P〈0．05）。辛伐他汀显著促进骨髓单个核细胞向EPC分化,其促进作用随辛伐他汀浓度升高而增加,在1．0μmol／L达最大效应。1μmol／L辛伐他汀组与对照组EPC数量分别为87±5对39±4（P〈0．01）。结论：辛伐他汀选择性抑制骨髓单个核细胞向SPC分化,促进其向EPC分化,局部应用有促进损伤血管再内皮化和抑制新生内膜过度增生的可能。     

酸性成纤维细胞生长因子对人脐带血内皮祖细胞凋亡的影响

目的 探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对人脐带血中内皮祖细胞凋亡的影响及机制.方法 选择健康产妇脐带血,密度梯度离心法获取脐带血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞并加入不同浓度(2、5、10μg/L)aFGF干预24 h,流式细胞仪检测aFGF对细胞凋亡的影响,逆转录-聚合酶链反应检测Bcl-2 mRNA表达,Western Blot检测Bcl-2蛋白表达.同时对作用效果最为显著的组(5μg,/L aFGF组)分别培养6、12、24、48 h,分别观察内皮祖细胞数量及凋亡状况,从而对其时效关系进行观察.结果 与对照组比较,不同浓度的aFGF可以显著抑制内皮祖细胞凋亡(P＜0.05);5μg/L aFGF作用24 h时对细胞凋亡抑制的影响最为显著(P＜0.05).Bcl-2mRNA和蛋白的表达显著高于对照组.结论 aFGF能抑制人脐带血内皮祖细胞的凋亡,并通过上调凋亡抑制基因Bcl-2而发挥抑制细胞凋亡的作用.     

C反应蛋白对外周血内皮祖细胞数量及功能的影响

目的研究C反应蛋白对人外周血内皮祖细胞数量及功能的影响。方法从外周血中分离出单个核细胞，体外培养7天，在贴壁细胞中加入不同浓度的C反应蛋白（1mg／L、2．5mg／L和5．0mg／L）作用不同时间（24h、48h和72h），用四唑盐比色试验（MI]r）和细胞集落形成单位计数的方法评价C反应蛋白对内皮祖细胞增殖的影响；采用趋化试验评价不同浓度的C反应蛋白对血管内皮生长因子诱导的内皮祖细胞趋化能力的影响；检测细胞上清中一氧化氯的浓度变化；逆转录-聚合酶链式反应检测细胞内皮源性一氧化氮合酶表达强度变化。结果C反应蛋白减少内皮祖细胞的集落形成单位数量及抑制内皮祖细胞的增殖能力；随着C反应蛋白浓度的增加，内皮祖细胞的趋化能力受到抑制；同样细胞分泌的一氧化氮减少，内皮源性一氧化氮合酶表达减弱。结论C反应蛋白可能通过押制内皮祖细胞的增殖和趋化能力促进内皮功能不全的发展。     

C反应蛋白对外周血内皮祖细胞数量及功能的影响

目的研究C反应蛋白对人外周血内皮祖细胞数量及功能的影响。方法从外周血中分离出单个核细胞,体外培养7天,在贴壁细胞中加入不同浓度的C反应蛋白(1 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L)作用不同时间(24 h、48 h和72 h),用四唑盐比色试验(MTT)和细胞集落形成单位计数的方法评价C反应蛋白对内皮祖细胞增殖的影响;采用趋化试验评价不同浓度的C反应蛋白对血管内皮生长因子诱导的内皮祖细胞趋化能力的影响;检测细胞上清中一氧化氮的浓度变化;逆转录—聚合酶链式反应检测细胞内皮源性一氧化氮合酶表达强度变化。结果C反应蛋白减少内皮祖细胞的集落形成单位数量及抑制内皮祖细胞的增殖能力;随着C反应蛋白浓度的增加,内皮祖细胞的趋化能力受到抑制;同样细胞分泌的一氧化氮减少,内皮源性一氧化氮合酶表达减弱。结论C反应蛋白可能通过抑制内皮祖细胞的增殖和趋化能力促进内皮功能不全的发展。     

sEHi对颈动脉狭窄患者外周血早期内皮祖细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨可溶性环氧化物水解酶抑制剂（sEHi）AUDA对颈动脉狭窄（CS）患者外周血来源的早期内皮祖细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 采用密度梯度离心法,从CS患者外周血获取单个核细胞,培养至7天,收集贴壁细胞,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪进行早期内皮祖细胞鉴定。分别用不同浓度（0、0.1、1、10 μmol/L）AUDA干预24 h,采用免疫印迹法观察AUDA处理后其VEGF的表达。取年龄性别匹配的健康体检者的早期内皮祖细胞作为对照组。结果 与对照组相比,CS患者早期内皮祖细胞VEGF表达显著下降;与处理前（0 μmol/L AUDA）相比,AUDA呈剂量依赖性地增强CS患者早期内皮祖细胞VEGF表达。结论 sEHi通过环氧二十碳三烯酸介导上调早期内皮祖细胞VEGF的表达,并呈浓度依赖性,其有望成为一类治疗CS的新型药物。     

高血压前期人群一氧化氮水平的性别差异及其与内皮祖细胞的关系

目的探讨高血压前期人群一氧化氮水平的性别差异,并分析其与循环内皮祖细胞(EPC)数量和功能的相关性。方法招募80例平均年龄为46.4±4.3岁的人群作为研究对象,其中21例绝经前健康女性,20例绝经前高血压前期女性,19例健康男性和20例高血压前期男性,测定四组血浆和EPC分泌的一氧化氮、粒-巨噬细胞集落刺激因子和血管内皮生长因子水平。结果与健康男性组和高血压前期男性组比较,绝经前健康女性组和绝经前高血压前期女性组血浆和循环EPC分泌的一氧化氮水平明显增加(P0.05);健康男性组血浆和循环EPC分泌的一氧化氮水平比高血压前期男性组高(P0.05);而绝经前健康女性组和绝经前高血压前期女性组血浆和循环EPC分泌的一氧化氮水平无明显差异(P0.05);血浆一氧化氮水平或循环EPC分泌的一氧化氮水平与循环EPC数量及功能呈明显的直线相关关系(P0.05)。四组血浆和EPC分泌的血管内皮生长因子和粒-巨噬细胞集落刺激因子水平无明显差异(P0.05)。结论相对高血压前期男性患者,绝经前高血压前期女性人群一氧化氮水平受到保护,且一氧化氮水平与EPC数量和功能相关。     

剪应力和血管内皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化

目的 研究血管内皮生长因子与剪应力对骨髓间充质干细胞分化的作用.方法 分离成人骨髓单个核细胞,经贴壁法获取骨髓间充质干细胞.所获细胞用血管内皮生长因子、剪应力(8和15 dyn/cm2)、血管内皮生长因子联合剪应力分别作用7天、24 h、24 h,观察细胞形态变化,并进行内皮细胞标记物假性血友病因子定性间接免疫荧光染色,进行Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验以鉴定内皮细胞功能.结果 在剪应力(8 dyn/cm2)、血管内皮生长因子分别作用24 h、7天后,骨髓间充质干细胞形态变得偏圆、呈多角形,血管内皮生长因子联合剪应力诱导组细胞平行于流体方向排列,假性血友病因子染色阳性,提示内皮细胞表型特征,同时Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验阳性,提示具有内皮细胞功能.血管内皮生长因子诱导组、15 dyn/cm2剪应力组作用24 h的骨髓间充质干细胞,假性血友病因子染色与Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白摄取实验均阴性,提示未出现向内皮细胞分化.血管内皮生长因子和15 dyn/cm2剪应力共同作用24 h后,骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化.结论 剪应力可诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,且与力的大小有关.血管内皮生长因子可联合剪应力诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化.且诱导效果优于单独使用剪应力.     

同型半胱氨酸对外周血内皮前体细胞的影响及粒细胞集落刺激因子的干预作用

目的观察高蛋氨酸饮食对外周血内皮前体细胞数量的影响及粒细胞集落刺激因子对该影响的干预作用。方法雄性新西兰兔随机分为四组:正常对照组、同型半胱氨酸组、粒细胞集落刺激因子组、同型半胱氨酸 粒细胞集落刺激因子组。正常对照组及粒细胞集落刺激因子组普食,同型半胱氨酸及同型半胱氨酸 粒细胞集落刺激因子两组饲以1%蛋氨酸饮食,粒细胞集落刺激因子及同型半胱氨酸 粒细胞集落刺激因子组予以粒细胞集落刺激因子50μgd,腹腔注射。观察1、2、3、4、8、12周外周血内皮前体细胞数量的变化。第12周测血清一氧化氮、同型半胱氨酸。结果①外周血内皮前体细胞数量变化:正常对照组基本稳定于低水平;粒细胞集落刺激因子组相对稳定于高水平;同型半胱氨酸组前4周呈下降趋势,第8、12周升高,但与正常对照组无统计学差异;同型半胱氨酸 粒细胞集落刺激因子组呈下降趋势,前2周高于正常对照组(P<0.01),第2周开始低于粒细胞集落刺激因子组(P<0.01)。②血清一氧化氮值:同型半胱氨酸组低于正常对照组(P<0.01),而同型半胱氨酸 粒细胞集落刺激因子组高于同型半胱氨酸组(P<0.05)。③血清同型半胱氨酸值:同型半胱氨酸组和同型半胱氨酸 粒细胞集落刺激因子组显著高于正常对照组和粒细胞集落刺激因子组(P<0.01)。结论同型半胱氨酸开始使内皮前体细胞下降,随后升高;并可致血清一氧化氮下降。粒细胞集落刺激因子前2周可升高同型半胱氨酸组内皮前体细胞,以后不增高;并可拮抗同型半胱氨酸引起的一氧化氮下降。粒细胞集落刺激因子改善同型半胱氨酸引起的内皮功能损害,可能与其动员内皮前体细胞有关。粒细胞集落刺激因子对血清同型半胱氨酸无影响。     

内含子源性miRNA通过转录因子AP1调节内皮型一氧化氮合酶表达及血管内皮细胞增殖作用

目的　前期工作发现,内皮型一氧化氮合酶（eNOS）第4内含子的27碱基重复子产生相应27-nt　miRNA,并对eNOS的转录和表达有负反馈调节作用。进一步探讨该内含子源性27-nt　miRNA对内皮型一氧化氮合酶基因调节的分子机制及血管内皮细胞增殖相关转录因子AP1的作用机制。方法　应用MTT法检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖抑制率;细胞划痕实验检测HUVEC迁移能力;免疫组织化学方法检测内皮细胞中eNOS和AP1蛋白表达水平;进一步用Western　Blot检测27-nt　miRNA表达相关情况及细胞核转录因子eNOS表达情况。结果　27-nt　miRNA对HUVEC增殖具有强烈抑制作用　（P<0.05）;27-nt　miRNA对HUVEC迁移具有显著抑制作用（P<0.05）;27-nt　miRNA显著降低eNOS和AP1蛋白表达（P<0.05）;27-nt　miRNA通过负调控AP1降低eNOS蛋白表达（P<0.05）。结论　27-nt　miRNA显著抑制eNOS和AP1蛋白表达,AP1在27-nt　miRNA对eNOS表达调节中起重要作用。