HL-60细胞降钙素基因高甲基化的发生机制

目的 :探讨HL 6 0细胞降钙素基因高甲基化的发生机制。方法 :采用HL 6 0细胞 ,以正常骨髓单个核细胞为对照 ,应用甲基化敏感的限制性内切酶消化 ,结合设有内外参照的PCR技术 ,检测CT基因甲基化状态 ;应用同位素微量分析法检测DNA 胞嘧啶 甲基转移酶 (DNA cytosin methyltransferase,MTase)活性 ;应用RT PCR技术检测MTase基因表达水平。结果 :HL 6 0细胞经甲基化敏感的内切酶HpaⅡ消化后仍可扩增出清晰的CT基因特异条带 ,提示CT基因 5′端呈高甲基化状态 ;HL 6 0细胞MTase活性平均测定值为 5 39.9Bq ,是正常骨髓单个核细胞 (平均 2 1 8Bq)的 2 9.8倍 ;MTase基因的mRNA表达水平以MTase与β actin内参照RT PCR产物的比值表示 ,HL 6 0细胞 (0 .72 )为正常对照 (0 .0 2 )的 36倍。结论 :HL 6 0细胞CT基因呈高甲基化状态 ,MTase活性增高可能是其发生机制之一     

白血病细胞系中WT1基因启动子区域DNA甲基化的研究

目的应用基于聚合酶链反应(PCR)的实验方法,研究白血病细胞系中WT1基因启动子区域的DNA甲基化水平及其与WT1基因表达的关系.方法采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术,检测HL-60、Jurkat及KG-1等白血病细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态;以5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-CdR)对启动子区域DNA高甲基化的U937细胞系进行去甲基化处理后,观察WT1基因表达水平的改变.结果 HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1水平高表达,而Jurkat和U937细胞表达水平极低,同时检测到这两个细胞系存在WT1基因启动子区域DNA高甲基化;经去甲基化处理后,U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者升高.结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一.     

TET酶及其中间产物5hmC研究进展

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,在胚胎重编程、干细胞分化和肿瘤的发生中发挥调控作用。 TET(ten-eleven translocation)酶为关键的去甲基化酶,可连续将 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)氧化为 5-羟甲基胞嘧啶(5-hydro-xymethylcytosine,5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和 5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC),这些碱基代表DNA的表观遗传修饰状态,同时调控DNA去甲基化的进程。研究TET蛋白如何调控DNA甲基化修饰和基因的表达有助于我们深入了解正常的生长发育和人类疾病的表观调控。     

DNA甲基化与肿瘤

DNA甲基化是一种重要的基因调控方式，DNA甲基化水平的改变在肿瘤的发生、发展中有重要的作用，DNA甲基化改变引起细胞中C→T突变、癌基因的低甲基化、抑癌基因的高甲基化、错配修复基因异常以及诱导染色体不稳定从而导致肿瘤的发生，利用肿瘤发生中DNA甲基化特征可对其进行有效的治疗。     

胸腺嘧啶脱氧核糖核酸糖基化酶的研究现状及进展

胸腺嘧啶脱氧核糖核酸糖基化酶(thymine DNA glycosylase，TDG)属于单功能尿嘧啶脱氧核糖核酸糖基化酶(uracil DNA glycosidase，UDG)超家族中的成员，在基因组稳定和表观遗传调控中具有双重作用。TDG参与调控DNA甲基化(DNA methylation)和去甲基化(DNA demethylation)。DNA甲基化主要为胞嘧啶(cytosine，C)甲基化，是指胞嘧啶以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl Methionine，SAM)为甲基供体，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)的作用下，在胞嘧啶第5位碳原子上加上一个甲基，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。5mC广泛存在于哺乳动物基因组中，并在基因组稳定性维持、组织特异性基因沉默、逆转录转座子沉默等诸多生物学过程中发挥重要作用。DNA去甲基化是指5mC还原为C，这个过程也是由DNMTs完成的。DNA去甲基化包括被动去甲基化和主动去甲基化2种途径。被动DNA去甲基化是指在DNA复制过程中，新合成的子链DNA未能维持甲基化状态，导致DNA甲基化的被动稀释(passive dilution)；DNA主动去甲基化过程不涉及DNA复制，是指通过TDG等酶的作用去除5mC和5-羧基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)的氧化产物，即5-甲羟基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)。TDG还通过碱基切除修复途径(base excision repair，BER)切割糖与靶碱之间的N-糖苷键，在纠正错配及损伤的DNA碱基对(base pair，bp)中起重要作用。最近的研究表明TDG还在转录调控、胚胎发育及肿瘤治疗等领域发挥重要作用。本文总结了近年来TDG的研究现状及进展，为进一步的深入研究提供理论支持。      

p15基因甲基化与肿瘤的关系

DNA甲基化作为转录水平的DNA修饰方式之一 ,在调节基因表达和维持细胞正常分化起重要作用。DNA甲基化在胚胎发育的初期是必须的 ,但在人类的恶性肿瘤中 ,DNA甲基化的改变是普遍的异常现象 ,DNA甲基化的修饰参与肿瘤形成。造血系统恶性肿瘤中 ,控制和调节造血细胞生长和分化的基     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。     

反相高效液相色谱法测定人乳腺癌MCF7细胞中基因组DNA甲基化水平

目的 利用反相高效液相色谱法检测MCF7细胞系中基因组DNA的甲基化水平.方法 采用Nano LC(75 μm×15 cm,5 μm)和Micro LC(1.0 mm×15 cm,5 μm)的C18反相色谱柱,以甲醇-醋酸铵缓冲液(pH 5.0)为流动相,使用线性梯度程序,将MCF7细胞中基因组DNA水解产物进行分离,两种体系流速分别是300 nl/min和40μl/min,在273 nm波长处检测,利用外标法分别检测DNA中脱氧胞嘧啶(dC和甲基化脱氧胞嘧啶(5mdC)含量.结果 MCF7基因组DNA的水解产物,经反相色谱分离得到的峰图有较好的准确性与重复性;DNA水解后的产物为弱保留化合物,且Micro LC分离效果优于Nano LC;乳腺癌细胞MCF7甲基化水平为19.3%,高于正常细胞中基因组DNA甲基化水平.结论成功的将MCF7细胞中基因组DNA水解产物经反相色谱分离;使用Micro LC分离DNA水解后的弱保留产物较佳;MCF7细胞系基因组DNA甲基化水平高于正常细胞.     

DNA甲基化研究及其检测方法的新进展

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DN-MT)的催化下,在胞嘧啶的第五位碳原子上加一甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。修饰过程中,DNA的甲基化并不改变基因的碱基序列,而是通过影响基因的表达以改变其功能。近年大量研究证实,DNA甲基化的变异(全基因组的低甲基化     

DNA甲基化与肿瘤研究进展

细胞癌变是一个多阶段复杂过程 ,它包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活 ,并涉及基因和基因外的多种改变。近来 ,人们发现肿瘤细胞的总体甲基化水平低于正常细胞 ,而在某些CpG岛甲基化程度增高。DNA甲基化在X染色体、基因表达及基因组印迹中[1 ] 起着重要作用。同时 ,近年来研究发现DNA甲基化的异常影响肿瘤的发生发展。1　DNA甲基化与基因表达1.1　DNA甲基化与去甲基化　DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶 (DNAmethyltransferase ,DMT)的催化下 ,以s 腺苷甲硫氨酸 (SAM)为甲基供体 ,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲…     

基于错配杂交化学发光定量检测MGMT基因过甲基化

目的利用错配杂交和化学发光技术,建立一种检测MGMT基因启动子区过甲基化的定量分析方法。方法基因组DNA经过亚硫酸氢钠修饰,所有未甲基化的胞嘧啶都被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化。设计特异的PCR引物(不含CpG位点),同时扩增含有CpG位点甲基化或非甲基化目的 MGMT基因启动子区,用两条分别与甲基化及非甲基化CpG位点互补的寡核苷酸探针与扩增产物杂交,化学发光检测,通过两条探针的杂交信号强度之比确定样品DNA中MGMT甲基化的程度。结果检测混合样品中MGMT基因的甲基化水平与结果完全相符,并可用于肿瘤组织样品的MGMT甲基化定量检测。结论与现有方法相比,本法是一种检测快速、操作简便的MGMT基因甲基化的定量检测方法。     

基于错配杂交化学发光定量检测MGMT基因过甲基化简

目的 利用错配杂交和化学发光技术,建立一种检测MGMT基因启动子区过甲基化的定量分析方法.方法 基因组DNA经过亚硫酸氢钠修饰,所有未甲基化的胞嘧啶都被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不发生变化.设计特异的PCR引物（不合CpG位点）,同时扩增含有CpG位点甲基化或非甲基化目的MGMT基因启动子区,用两条分别与甲基化及非甲基化CpG位点互补的寡核苷酸探针与扩增产物杂交,化学发光检测,通过两条探针的杂交信号强度之比确定样品DNA中MGMT甲基化的程度.结果 检测混合样品中MGMT基因的甲基化水平与结果完全相符,并可用于肿瘤组织样品的MGMT甲基化定量检测.结论 与现有方法相比,本法是一种检测快速、操作简便的MGMT基因甲基化的定量检测方法.     

DNA甲基化异常与肿瘤研究现状

在真核细胞中,5-甲基胞嘧啶(5-MC)是唯一天然存在的修饰碱基,约占整个胞嘧啶的3％,这些甲基化部位90％存在于CG序列中,不同的组织DNA具有不同的甲基化类型。在细胞生长分化或损伤修复过程中,新复制的DNA是半甲基化的,需要通过S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,并由DNA甲基转移酶将甲基转移至胞嘧啶环的第五位碳原子上,这种作用就叫维     

雄激素非依赖性前列腺癌耐药转化过程中异常甲基化基因的鉴定

目的探讨DNA甲基化在雄激素非依赖性前列腺癌耐药转变过程中的作用。方法以雄激素依赖性前列腺癌LNCa P细胞为对照组,雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCa P-AI为实验组,采用Illumina DNA甲基化芯片检测两组细胞基因组DNA甲基化水平,并对甲基化芯片数据进行生物信息学分析;实时荧光定量RT-PCR检测前列腺特异抗原PSA mRNA的相对表达量。结果 LNCa P细胞相比,发现LNCa P-AI细胞共有2619个基因甲基化水平发生改变,其中758个基因发生高甲基化,占差异基因的28.9%,1860个基因表现为低甲基化,占差异基因的71.1%,这些差异甲基化基因涉及Notch信号通路和胰岛素样生长因子1信号通路。LNCa P-AI细胞PSA基因甲基化水平上升了3.67倍,其PSA mRNA表达水平下调了6.5倍。结论DNA甲基化参与了前列腺癌雄激素非依赖性转变的过程,可能是导致前列腺癌耐药的诱因之一。     

人DNA甲基转移酶家族与肿瘤发生发展关系的研究进展

DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化完成的,在高等真核生物中只发现了DNA-C5胞嘧啶的甲基化形式。在DNA甲基化过程中,胞嘧啶从DNA双螺旋中突出,进入与酶结合部位的裂隙,并通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DN-MT),把活性甲基从S-腺苷蛋氨酸(SAM)转移至C5胞嘧啶位上,形成5-     

Hela细胞雄激素受体基因外显子1的甲基化检测

目的:检测Hela细胞雄激素受体(AR)基因外显子1的甲基化水平.方法:用亚硫酸氢盐克隆测序法和联合亚硫酸氢盐的限制酶法(COBRA)检测不同来源Hela细胞AR基因外显子1的甲基化水平,BiQ Analyzer软件分析测序结果.结果:在非CpG胞嘧啶转化率＞98％的前提下,Hela细胞AR基因外显子1片段的总甲基化率...     

DNA甲基化在肿瘤发生中的作用

在肿瘤发生中，DNA异常甲基化表现为遗传和表遗传两种效应。遗传效应通过甲基化胞嘧啶的自发性脱氨和增加外来致癌物的亲和力等方式起作用，引起基因突变频率增加。而通过DNA CpG岛的甲基化使某些重要基因失去功能是肿瘤发病中的一个重要因素。     

“第六碱基”——5-羟甲基胞嘧啶研究进展

<正>表观遗传学是目前生物领域最热门的研究之一,其中DNA甲基化是表观遗传学修饰的一种重要方式~([1]),指在DNA分子中加入甲基的过程。大量研究表明,DNA甲基化可引起DNA构象、染色质结构、DNA稳定性以及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因表达~([2])。遗传信息载体DNA由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶4种碱基组成,胞嘧啶(cytosine,C)可在DNA甲基化转移酶     

DNA甲基化导致肿瘤的分子机制

DNA甲基化是指在DNA甲基化酶的作用下,以S-腺苷酸-L-甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上的过程。基因的正常功能除了依赖于正常结构外,还依赖于正常的甲基化状态。DNA的异常甲基化在肿瘤发生中起重要作用。在肿瘤的发生过程中常常出现整个基因组甲基化水平的降低,而且特定癌基因也常呈低甲基化状态,而一些肿瘤抑制基因除了点突变或基因缺失外,启动子序列高甲基化致转录抑制,可使这些基因失活。本文对DNA甲基化引起肿瘤的机制予以综述。     

磷酸酶基因CpG岛甲基化状态及其在膀胱移行细胞癌中的表达

目的探讨磷酸酶基因（PTEN）CpG岛甲基化状态及其在膀胱移行细胞癌（BTCC）中的表达。方法应用甲基化特异性聚合酶链式反应检测32例BTCC和癌旁正常组织标本中PTEN基因启动子区甲基化状态,逆转录聚合酶链式反应和蛋白印迹法检测其mRNA和蛋白表达水平。结果PTEN基因在BTCC组织中甲基化率为65．6％,随着肿瘤分级、分期的增加,甲基化水平逐渐升高,而在正常膀胱组织中未发现甲基化。PTENmRNA和蛋白表达在正常组织和BTCC组织中分别为93．8％、62．5％和15．6％、6．3％,差异有统计学意义（P〈0．01）。在21例启动子异常甲基化的BTCC组织标本中,19例伴有PTEN基因表达缺失或下调,两者之间存在明显负相关（r=--0．564,P〈0．01）。结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活,使其mRNA和蛋白表达减少甚至缺失,是膀胱癌发生、发展的原因之一。