诱导脐血单个核细胞分化为树突状细胞的实验研究

目的：诱导脐血源树突状细胞对恶性血液病脐血移植后的过继免疫治疗十分重要。诱导条件对树突状细胞产率影响很大。本研究观察粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4及TNF-α分阶段诱导脐血单个核细胞来源树突状细胞的效果。方法：通过Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞,以GM-CSF、IL-4及TNF-α分阶段诱导脐血来源树突状细胞的生成,培养12 d收获细胞,以光镜和电镜观察其细胞形态学特点,以流式细胞术检测其表面标记。结果：经培养12 d,每2×10 6脐血单个核细胞收获树突状细胞数为(0.46±0.13)×106,CD80+、CD86+细胞比例分别为89.98%±4.32%、86.86%±7.17%,而CD1a+细胞比例43.16%±5.80%,经光镜和电镜下观察细胞具有典型的树突状细胞形态学特征。结论：通过GM-CSF、IL-4及TNF-α的树突状细胞培养体系和分阶段诱导法可高效率诱导脐血树突状细胞。［中国当代儿科杂志,2004, 6(5): 377-380］     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和

目的从脐血中分离单个核细胞(MNCs),体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能.方法取35份足月顺产新生儿脐血,密度梯度离心法分离出其中的MNCs,采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs.显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色,流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型,体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力.结果从12份脐血中可培养出MSCs,形态上与从其他来源的MSCs类似,可传至20代而无形态上的变化.细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性,非特异性酯酶--α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyric acid esterase,NBE)阳性.其表达CD29、CD44和CD105,特别是人类MSCs标记SH-2 和 SH-3 阳性,而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性,说明它们并非来自造血细胞.这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下,2周左右可以诱导分化形成骨细胞, 20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞.脐血MSCs预诱导12 h后,胞体发生收缩,细胞边缘有细的突起.正式诱导5 h后大多数细胞呈现典型的神经元样.结论胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs.这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能.     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和诱导分化能力的研究

目的 从脐血中分离单个核细胞(MNCs)，体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能。方法 取35份足月顺产新生儿脐血，密度梯度离心法分离出其中的MNCs，采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs。显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色，流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型，体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力。结果 从12份脐血中可培养出MSCs，形态上与从其他来源的MSCs类似，可传至20代而无形态上的变化。细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性，非特异性酯酶——α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyrjc acid esterase，NBE)阳性。其表达CD29、CD44和CD105，特别是人类MSCs标记SH-2和SH-3阳性，而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性，说明它们并非来自造血细胞。这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下，2周左右可以诱导分化形成骨细胞，20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞。脐血MSCs预诱导12h后，胞体发生收缩，细胞边缘有细的突起。正式诱导5h后大多数细胞呈现典型的神经元样。结论 胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs。这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能。     

脐血和外周血来源的巨核细胞体外扩增差异的研究

目的建立外周血(peripheral blood,PB)和脐血(cord blood,CB)来源的CD3+4细胞体外定向诱导扩增巨核细胞(megakaryocyte,MK)的最佳体系,探讨两种来源巨核细胞的扩增差异。方法以Ficoll-Hapaque分离“动员”的外周血和脐血单个核细胞,免疫磁珠分离纯化CD3+4细胞,在含胎牛血清的液体培养体系中,以不同细胞因子组合诱导两种来源的CD3+4细胞,定时进行细胞计数和流式细胞术检测培养体系中CD4+1细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养,测定巨核细胞集落形成单位的数量。结果在血小板生成素(thrombopoietin,TPO)+胎肝酪氨酸激酶配体(FLT-3ligand,FL)+白介素6(interleukin-6,IL-6)+IL-3组合中,外周血来源的CD4+1细胞第10天扩增了131±18倍,脐血来源的CD4+1细胞在培养的第14天扩增了193±25倍,为增殖高峰。均明显高于同来源的其他3组(P<0.05),随着时间的推移两者的CD4+1细胞扩增倍数均呈下降趋势。结论TPO+FL+IL-6+IL-3组合均为CB和PB体外诱导扩增巨核细胞的最佳组合。CB来源的巨核细胞较PB来源的巨核细胞有更强的增生能力,而PB来源的CD3+4细胞产生巨核细胞的时间较CB来源的短,与临床上外周血造血干细胞移植的血小板造血重建快于脐血移植相一致。     

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性

目的探讨人脐带血来源间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经元样细胞的可行性及条件。方法采用Fi- coll-Paque(1.077 g/mL)分离液密度梯度分离人脐带血中MSCs,体外扩增纯化后,二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察,细胞免疫化学法鉴定。结果诱导后脐血MSCs具有典型神经元形态细胞,免疫细胞化学显示神经丝蛋白(NF-M)染色呈强阳性,占(81．86±4．06)％;Nestin染色呈阳性细胞占(39．99±4．60)％;GFAP染色阴性。结论人脐带血MSCs在体外培养及诱导条件下可定向分化为神经元样细胞。     

体外扩增脐血CD+ 34细胞

目的探讨某些造血细胞因子对脐血造血干细胞的扩增效应。方法脐血ＣＤ＋３４细胞经免疫磁珠法分选后，在含有重组人Ｆｌｔ３配基（ｒｈＦｌｔ３Ｌ）、干细胞因子（ｒｈＳＣＦ）、白细胞介素１β（ｒｈＩＬ１β）、ｒｈＩＬ３和ｒｈＩＬ６的液体培养体系中培养７至１４天。采用流式细胞仪、造血细胞集落和长期培养起始细胞（ＬＴＣＩＣ）方法检测扩增后的细胞。结果在上述细胞因子作用下，脐血ＣＤ＋３４细胞明显扩增。细胞总数、ＣＤ＋３４细胞和造血细胞集落总数在第７天分别扩增３１±１９、４±５、１０±６７倍、第９天分别扩增２３６±１０６、２０±２０、５７±６２，第１４天分别扩增７７０±５０５、３０±３０、１８９±１３３。扩增的细胞以髓系祖细胞为主，极少红系祖细胞，无淋巴系细胞，并含有ＬＴＣＩＣ。结论理想的造血细胞因子的组合可以加速体外扩增脐血ＣＤ＋３４细胞，在细胞数量和质量上可能满足成人移植的需要     

应用5-杂氮脱氧胞苷诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的体外研究

目的 探讨5-氮杂脱氧胞苷(5-AzaC)体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的可行性.方法 B超引导下穿刺抽得孕中期羊水,体外分离、培养得到羊水来源间充质干细胞,传代后计数细胞并绘制生长曲线.体外成骨、成脂诱导观察人羊水来源间充质干细胞多向分化能力.采用5-AzaC对羊水来源间充质干细胞成肌诱导2周,观察细胞形态学变化,RT-PCR、免疫荧光染色方法鉴定成肌细胞特异mRNA及蛋白表达.结果 人羊水来源间充质干细胞体外培养后迅速进入对数生长期,培养7 d未达到平台期.茜素红和油红O染色证实人羊水来源间充质干细胞可诱导分化为成骨、成脂细胞样细胞.人羊水来源间充质干细胞经5-AzaC诱导2周逐渐变长梭形.而对照组细胞呈扁平多角形.免疫荧光染色及RT-PCR结果提示实验组细胞表达肌结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白I(Tn I)、横纹肌辅肌动蛋白(α-Actinin)及mRNA;对照组呈阴性.结论 人羊水来源间充质干细胞体外增殖能力强,能分化为成骨、成脂细胞样细胞.5-AzaC能在体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化.     

人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程免疫特性的研究

目的研究人脐带间充质干细胞(huMSCs)向胰岛素分泌细胞(IPCs)分化过程中的免疫学特性,为huMSCs作为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的细胞来源提供依据。方法以流式细胞术检测huMSCs及huMSCs源性IPCs的免疫表型;RT-PCR法检测huMSCs及huMSCs源性IPCs的HLA-A、HLA-DR基因的表达;CCK8法测定细胞增殖率,观察huMSCs及huMSCs源性IPCs对外周血单个核细胞增殖的影响。结果 huMSCs在体外培养条件诱导下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能;huMSCs及huMSCs源性IPCs均不表达CD80、CD86、CD40、CD40L、HLA-DR,均表达HLA-A;huMSCs能够抑制PHA刺激的外周血单个核细胞的增殖,但huMSCs源性IPCs未见该作用。结论 huMSCs及huMSCs源性IPCs均具有低免疫原性,可作为胰岛细胞移植的细胞来源,huMSCs对免疫反应具有负调节作用,但huMSCs源性IPCs不具有该作用。     

人脐血间充质干细胞对脐血CD+34细胞体外扩增作用的研究

目的 探讨含人脐血来源的间充质干细胞(MSCs)体系在体外对脐血造血干细胞(HSCs)扩增作用。方法 (1)用含人脐血MSCs及不同造血生长因子(HGFs)组合的无血清扩增体系对人脐血CD34^ 细胞进行体外扩增。(2)于扩增前及扩增后第6、12天分别用双色流式细胞仪动态检测HSCs表面抗原标记：CD34^ 、CD34^ CD38^-、CD34^ CD3^ 、CD34^ CD19^ 、CD34^ 和CD34^ CD41^ 。细胞的含量。(3)按本实验室方法行体外半固体培养,观察扩增前后脐血细胞粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)、混合集落形成单位(CFU-Mix)及高增殖集落形成单位(CFU-HPP)集落形成情况。结果(1)含人脐血MSCs体系对脐血CD34^ CD38^ 细胞的扩增倍数在第6天和第12大分别为159和437倍。该业群百分比在单纯因子组扩增第12天时为1．98％,而在含脐血MSCs组为9．98%,明显高于扩增前。(2)集落培养表明,含脐血MSCs组扩增第12天与扩增第6天相比,其CFU-Mix和CFU-HPP的扩增倍数增加,而单纯因子组这两种集落的扩增倍数下降。(3)随扩增天数的增加,两组扩增体系中CD34^ CD3^ 和CD34^ CD41a^ 细胞均明显增加,而CD34^ CD19^ 和CD34^ CD3^ 细胞均明显减少。两组相比,含脐血MSCs组差异更显著。结论 (1)含脐血MSCs体系不仅能扩增更原始的造血干／祖细胞(HSPC),且具有在短期内(12d)保持HSCs不耗竭。(2)含脐血MSCs体系对脐血CD34^ 细胞向定向祖细胞的扩增,主要为髓系及巨核系祖细胞,而对其向淋巴系祖细胞的扩增具有抑制作用。     

小儿急性细菌性痢疾血循环内皮细胞的变化和意义

目的：观察小儿急性细菌性痢疾时血循环内皮细胞(CEC)的变化和意义。方法：将患儿分为观察组(急性细菌性痢疾患儿30例)及对照组(病毒性肠炎30例),其中观察组又分为观察组Ⅰ(中毒型8例)和观察组Ⅱ(普通型22例)。采用流式细胞仪检测患儿在发病第1天及第5天时的血循环内皮细胞(CEC)数。结果：观察组患儿第1天CEC水平(4.57±0.69)个/mm3高于该组第5天(1.06±0.15)个/mm3及对照组第1天(1.22±0.23)个/mm3、第5天(1.18±0.20)个/mm3 CEC水平,差异有显著性(P<0.01)。观察组Ⅰ第1天CEC水平(5.43±0.50)个/mm3,明显高于观察组Ⅱ第1天的CEC水平(4.25±0.44),P<0.01;而二者第5天CEC水平(0.98±0.12 vs 1.10±1.15)差异无显著性(P>0.05)。结论：CEC可能对鉴别急性细菌性痢疾具有重要意义,并可能成为此类疾病早期诊断,选择积极治疗的重要指标。     

人脐静脉内皮细胞制备饲养层对胚胎干细胞生长的支持作用

目的探讨人脐静脉内皮细胞是否可作为饲养层支持胚胎干细胞(ESC)的生长,维持ESC的未分化状态。方法取健康产妇产后的脐带,胶原酶灌注消化脐静脉血管,分离内皮细胞原代培养,并连续传代扩增细胞,Ⅷ因子相关抗原鉴定。采用生长良好的3代以上内皮细胞,经丝裂霉素C(10mg/L)灭活后制备饲养层,将E14.1 ESC接种到该饲养层上进行传代培养,观察ESC的形态学特征,测定不同传代时间的ESC碱性磷酸酶(AKP)活性、干细胞标志物Oct-4的表达,严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内畸胎瘤形成实验鉴定其全能分化特性。结果人脐静脉血管来源的内皮细胞能够在体外培养过程中生长、增殖旺盛,细胞连续传代10代以上能完整的保持正常的细胞形态学特征和生物学特性。经丝裂霉素C处理后细胞停止增殖,在24h内能较好的保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞的基本条件。E14.1 ESC在人脐静脉内皮细胞上传3～8代能较好的保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达AKP及干细胞因子Oct-4;体内全能分化实验显示:在内皮细胞上生长6代和10代以上的E14.1 ESC接种到SCID小鼠6周后均能形成畸胎瘤,含有3个胚层的组织细胞。结论人脐静脉血管内皮细胞可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效支持ESC的生长,克服了目前人ESC使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了ESC临床应用的生物安全性问题。     

急性下呼吸道感染患儿一氧化氮,循环内皮细胞改变及相关性研究

研究目的：急性下呼吸道感染（ＡＬＲＩ）时血管内皮细胞损伤机制及其临床意义。研究方法：ＡＬＲＩ患儿３６例，正常健康儿童３０例为对照组。测定一氧化氮（ＮＯ）水平及循环内皮细胞（ＣＥＣ）数量。研究结果：ＮＯ的稳定代射产物一循环亚硝酸／硝酸根离子（ＮＯ＾－２／ＮＯ＾－３）水平，对照组为２４．５±１４．１μｍｏｌ／Ｌ，ＡＬＲＩ组为４４．６±２２．６μｍｏｌ／Ｌ，差异显著（Ｐ＜０．０５）。ＣＥＣ数量对照组５．     

重组人白细胞介素-10对缺氧条件下人肺微血管内皮细胞凋亡的影响

目的研究低氧条件下,重组人IL-10(rhIL-10)对人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性的影响。方法常规培养HPMVEC细胞株,分为5组:正常对照组(常规培养);缺氧对照组(50 mL·L-1CO2,950mL·L-1N2);缺氧培养并加入rhIL-10,并按rhIL-10剂量(10×103ng.L-1、50×103ng.L-1、100×103ng.L-1)分为rhIL-10低剂量干预组、rhIL-10中剂量干预组、rhIL-10高剂量干预组。培养4 h、12 h、24 h、48 h离心收集细胞,化学比色法检测细胞核内Caspase-3活性,24 h核荧光染色并在荧光显微镜下观察荧光强度,并进行统计学分析。结果 4 h,凋亡蛋白Caspase-3相对活性各组间无明显差异(P>0.05);12 h,缺氧对照组,rhIL-10低、中剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa<0.05),rhIL-10高剂量干预组与正常对照组比较无明显差异(P>0.05),rhIL-10各剂量干预组与缺氧对照组比较显著降低(Pa<0.05);24 h,缺氧对照组、rhIL-10各剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa<0.05),rhIL-10各剂量干预组与缺氧对照组比较明显降低(Pa<0.05);48 h,缺氧对照组和rhIL-10低剂量干预组与正常对照组比较显著升高(Pa<0.05),低、中、高剂量rhIL-10干预组与缺氧对照组比较明显降低(Pa>0.05);缺氧凋亡峰值见于24 h。24 h,各组行凋亡细胞核Hoechst荧光染色,缺氧对照组和rhIL-10低、中、高剂量干预组灰度值与正常对照组比较均显著升高(Pa<0.05);rhIL-10低、中、高剂量rhIL-10干预组与缺氧对照组比较显著降低(Pa<0.05)。结论缺氧可促进HPMVEC凋亡,rhIL-10可一定程度地抑制HPMVEC凋亡,这些变化可能与急性缺氧性各器官疾病密切相关。     

缺氧对鼠脑微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物的影响

目的：探讨缺氧对体外培养鼠脑微血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator, TPA)的影响。方法：分别对新生小鼠脑微血管内皮细胞进行原代和传代缺氧条件下培养,常规培养作为空白对照,每组各取8例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA活性。结果：原代培养内皮细胞空白对照组、缺氧组分泌TPA活性分别为(19.4±1.7)×10-2 IU/ml,(22.5±1.5)×10-2 IU/ml,两者有显著性差异(P0.05)。结论：体外培养鼠脑微血管内皮细胞能合成分泌TPA;缺氧状态下原代培养内皮细胞产生的TPA活性增高。内皮细胞分泌的TPA可能是脑缺氧缺血致不可逆神经元损伤的一个重要媒介。     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DCs）的实验方法,实现体外大规模扩增高纯度DCs用于临床免疫治疗。方法E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DCs。不成熟DCs（im-DCs）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ-DR表达。用磷酸酯多糖（LPS）促进DCs成熟,收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查,分析细胞表型并与im-DCs细胞表型做对比,异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果ESC来源DCs呈典型DCs形态学表现。im-DCCD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达低,m-DCCD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达均较前明显升高。功能检测发现,ESC来源DCs具有强烈激发同种异体淋巴细胞增殖的作用,证实ESC来源的DCs具备正常的免疫学功能。结论使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DCs。故ESC可作为DCs来源一条新途径,对于体外大规模制备DCs用于免疫过继治疗提供一个较好的方法。