不同产地牛蒡rDNA ITS的PCR扩增、克隆及序列分析

目的:对中国11个不同产地的牛蒡进行ITS序列分析,为牛蒡DNA分子鉴定提供参考。方法:从11个不同产地的牛蒡中提取总DNA,用通用引物对ITS序列进行扩增,对扩增产物克隆测序。结果:牛蒡完整的ITS序列长度范围为641 bp,不同产地间无长度差异,GC含量为59.1%~59.6%之间,其中ITS1序列为256 bp,GC含量为58.6%~59.4%之间,其中ITS2序列为221 bp,GC含量为63.8%~64.7%之间。结论:11个不同产地的牛蒡ITS序列遗传距离为0.0000~0.0094,平均遗传距离为0.0024,相似度在99%以上,可以作为DNA分子鉴定的依据。     

牛蒡子及其伪品的ITS序列分子鉴定研究

目的:研究牛蒡子与伪品之间的DNA分子鉴别方法.方法:采集全国26个不同产地的牛蒡子药材26份和4种伪品毛头牛蒡、大翅蓟、紫穗槐、水飞蓟10份样品进行总DNA的提取,PCR扩增,对扩增产物克隆并测序,计算机软件统计分 析.结果:测得了36份样品的ITS序列全长,分别为牛蒡子641 bp,毛头牛蒡为641 bp;大翅蓟为639 bp;水飞蓟为630～631bp;紫穗槐为625～626 bp,在GenBank中注册,获得登记号.牛蒡子样品间的相似度大于99%,牛蒡子与大翅蓟、水飞蓟、紫穗槐间的相似度低于95%,毛头牛蒡与牛蒡子的相似度为98.29%～99.22%.通过以ITS序列重建系统树进行的聚类分析可以将牛蒡子与伪品有效的区分开.结论:根据ITS序列,能够有效的区分牛蒡子与伪品.     

基于ITS2序列鉴定谷物芽类药材及其混伪品

目的：应用ITS2序列对2010版《中国药典》谷物芽类药材稻芽、谷芽、麦芽及其混伪品进行分子鉴定,以保证药材质量和临床疗效。方法：提取稻芽、谷芽和麦芽药材DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2序列并双向测序,应用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行校对拼接,并去除低质量序列及引物区,得到ITS2序列。用MEGA6.0软件对所有10个物种74条序列计算种内和种间K2P（Kimura 2-Parameter）遗传距离,分析变异位点并构建邻接（NJ）树。结果：稻芽、谷芽和麦芽的基原植物稻、粟和大麦的种内最大K2P遗传距离均远小于其与混伪品之间的种间最小K2P遗传遗传距离;NJ树结果显示稻、粟和大麦各自聚为一支,均与混伪品明显区分开,各混伪品物种也单独聚为一支。结论：ITS2序列能准确鉴别稻芽、谷芽、麦芽药材及其混伪品,该研究为保障谷物芽类药材临床准确用药提供了新的技术手段。     

基于核DNA ITS序列的细辛药材基源及分子鉴定研究

目的探讨细辛药材3个基源同等入药的遗传基础,汉城细辛和北细辛的分类位置及细辛药材分子鉴别的可能性。方法进行PCR扩增,扩增产物纯化,测序,然后结合国产其他细辛属植物的ITS序列进行分析。结果获得辽细辛、华细辛和汉城细辛的ITS和5.8SrDNA完整序列;细辛药材的3种原植物形成一个非常稳定的独立分支,其中北细辛和华细辛聚合成一个分支,汉城细辛形成另一个分支;3种细辛药材ITS序列有差异。结论细辛药材3个来源亲缘关系非常密切,它们相互替代入药是有遗传基础的,支持北细辛是库页细辛的变种,汉城细辛的分类位置未能确定,汉城细辛、北细辛和华细辛ITS序列之间的差异可用作分子鉴定的依据。     

基于ITS序列的植物类中药材鉴定研究及展望

ITS是核糖体DNA上的内转录间隔区,其序列分析已成为在分子水平上探讨科、亚科、族内关系十分有效的手段,在种内,ITS序列对于揭示异域分布或间断分布居群间的关系具有很大潜力,该片段特别适合于属、种级的系统发育和分类研究。以ITS序列为DNA条形码鉴别的标准片段,已经在植物类中药材的DNA分子鉴别中广泛应用而且必将前景广阔。     

295牛蒡的化学成分与生物活性

牛蒡是传统的药用植物，含有木脂素、多糖等化学成分，有多种药理活性。日本学者提取其活性成分进行抗肿瘤等研究，取得初步成果。对牛蒡的化学成分木脂素和多糖，及其抗肿瘤、抗氧化等生物活性研究进行综述，并就今后研发方向进行展望。     

阳春砂的ITS序列分析

目的：用ITS全序列鉴别各地产阳春砂及常见伪品。方法：从各地产阳春砂及常见伪品绿壳砂和海南砂中提取总DNA，以核基因组通用引物ITS为引物进行扩增，扩增产物经纯化后，用PCR产物直接法进行测序。结果：各样品的ITS序列总长度均为626bp，其中ITS－1序列长度为248bp,5.8S序列长度为155bp，ITS－2序列长度为223bp；6个阳春砂和绿壳砂的ITS－2序列完全一致，各样品的5．8S序列完全一致，在ITS-1可各样品却有不同的碱基位点。结论：ITS－1序列可对阳春砂的道地性作出鉴别，明显区分其伪品。     

基于ITS2 序列鉴定南北葶苈子药材及其混伪品

目的：利用ITS2 序列对多基原药材葶苈子及其混伪品进行分子鉴定,以保证药材质量及临床疗效。方法：提取46 份葶苈子药材及其混伪品的DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2 序列并双向测序,应用CodonCode Aligner v 4.25 对测序峰图进行校对拼接,并去除低质量序列及引物区,得到ITS2 序列。用MEGA 6.0 软件计算物种种内和种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,分析变异位点并构建邻接（NJ）系统聚类树,综合应用相似性搜索法、最近距离法以及NJ 系统发育树等进行鉴定分析。结果：葶苈子的基原植物播娘蒿和独行菜的种内最大K2P 遗传距离分别为0.021 和0.010,均小于其与混伪品之间的种间最小K2P 遗传距离;NJ 树结果显示播娘蒿和独行菜各自聚为一支,表现出良好的单系性,均可与混伪品明显区分开。结论：以上几种鉴定方法分析结果表明,ITS2 序列能准确鉴别南北葶苈子药材与混伪品,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。     

应用DNA条形码ITS2序列对市售药材黄柏的鉴定研究

目的：应用DNA条形码ITS2序列鉴定市售黄柏药材及其混伪品,保障药材质量及用药安全。方法：对90份药材及其基原植物样品进行DNA提取,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增ITS2序列并进行双向测序,运用CodonCode Aligner V3.7.1对测序峰图进行校对拼接,去除低质量区和引物区,得到ITS2序列,运用MEGA 6.1对序列进行比对分析,基于K2P遗传距离构建系统聚类树。结果：90份实验样品均能提取到DNA,其DNA经PCR扩增、测序,序列拼接剪切后均能得到高质量ITS2序列。川黄柏和关黄柏基原物种黄皮树和黄檗的种内最大K2P遗传距离分别为0.018和0.004,均远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离（0.051和0.056）;NJ树结果显示川黄柏和关黄柏聚为一支,其混伪品各自聚为一支。结论：基于ITS2序列的DNA条形码技术可准确、有效地鉴定市售黄柏药材及其混伪品,为其市场监管及用药安全提供了一种高效的技术方法。     

不同产地何首乌的ITS序列研究

目的研究不同产地何首乌的ITS片段遗传差异性,分析该片段在何首乌道地性的DNA分子鉴别和野生资源品种的鉴定及种质资源研究中的意义。方法从来自不同原产地的何首乌中提取总DNA,以核基因组ITS通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果各样品rDNA的ITS及5.8S rDNA完全序列,18S和26S rDNA部分序列,共约648bp,其中ITS1长度为195bp,5.8S长度为164bp,ITS2长度为189bp。序列间共有17个变异位点。结论ITS序列可对何首乌的道地性做出鉴别,对野生资源品种的鉴定具有较好的分辨性。     

响应面分析法优化牛蒡根多糖提取工艺

目的:优化牛蒡根多糖的提取工艺.方法:采用水提醇沉法提取多糖,以多糖得率为考察指标;采用响应面分析法研究影响牛蒡根多糖测定的因素,以多糖提取率为响应值作响应面和等高线.结果:牛蒡多糖提取工艺的最佳条件为料液比1∶14.43,浸提温度84.85℃,浸提时间3.81 h.此条件下,牛蒡多糖的提取率为6.16％.结论:该优选工艺稳定、可行.     

Anti-inflammatory intestinal activity of Arctium lappa L. (Asteraceae) in TNBS colitis model

Ethnopharmacological relevance

In Brazilian traditional medicine, Arctium lappa (Asteraceae), has been reported to relieve gastrointestinal symptoms.

Aim of the study

In the present study, we investigated the effects of the lactone sesquiterpene onopordopicrin enriched fraction (ONP fraction) from Arctium lappa in an experimental colitis model induced by 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid and performed experiments to elucidate the underlying action mechanisms involved in that effect.

Materials and methods

ONP fraction (25 and 50 mg/kg/day) was orally administered 48, 24 and 1 h prior to the induction of colitis and 24 h after. The inflammatory response was assessed by gross appearance, myeloperoxidase (MPO) activity, tumor necrosis factor alpha (TNF-α) levels and a histological study of the lesions. We determined cyclooxygenase (COX)-1 and -2 protein expressions by western blotting and immunohistochemistry assays.

Results

TNBS group was characterized by increased colonic wall thickness, edema, diffuse inflammatory cell infiltration, increased MPO activity and TNF-α levels. On the contrary, ONP fraction (25 and 50 mg/kg) treatment significantly reduced the macroscopic inflammation scores (p<0.05 and p<0.01, respectively) and morphological alterations associated with an increase in the mucus secretion. Similarly, the degree of neutrophil infiltration and the cytokine levels were significantly ameliorated. Moreover, COX-2 expression was up regulated in TNBS-treated rats. In contrast, ONP fraction (50 mg/kg) administration reduced COX-2 overexpression.

Conclusions

We have shown that the ONP fraction obtained from Arctium lappa exert marked protective effects in acute experimental colitis, confirming and justifying, at least in part, the popular use of this plant to treat gastrointestinal diseases.     

Antitubercular activity of Arctium lappa and Tussilago farfara extracts and constituents

Ethnopharmacological relevance

Arctium lappa and Tussilago farfara (Asteraceae) are two plant species used traditionally as antitubercular remedies. The aim of this study was (i) to screen Arctium lappa and Tussilago farfara extracts for activity against Mycobacterium tuberculosis and (ii) to isolate and identify the compound(s) responsible for this reputed anti-TB effect.

Materials and methods

The activity of extracts and isolated compounds was determined against Mycobacterium tuberculosis H₃₇R_v using a high throughput spot culture growth inhibition (HT-SPOTi) assay.

Results

The n-hexane extracts of both plants, the ethyl acetate extract of Tussilago farfara and the dichloromethane phase derived from the methanol extract of Arctium lappa displayed antitubercular activity (MIC 62.5 μg/mL). Further chemical investigation of Arctium lappa led to the isolation of n-nonacosane (1), taraxasterol acetate (2), taraxasterol (3), a (1:1) mixture of β sitosterol/stigmasterol (4), isololiolide (5), melitensin (6), trans-caffeic acid (7), kaempferol (8), quercetin (9), kaempferol-3-O-glucoside (10). Compounds isolated from Tussilago farfara were identified as a (1:1) mixture of β sitosterol/stigmasterol (4), trans-caffeic acid (7), kaempferol (8), quercetin (9), kaempferol-3-O-glucoside (10), loliolide (11), a (4:1) mixture of p-coumaric acid/4-hydroxybenzoic acid (12), p-coumaric acid (13). All compounds were identified following analyses of their physicochemical and spectroscopic data (MS, ¹H and ¹³C-NMR) and by comparison with published data. This is the first report of the isolation of n-nonacosane (1), isololiolide (5), melitensin (6) and kaempferol-3-O-glucoside (10) from Arctium lappa, and of loliolide (11) from Tussilago farfara. Amongst the isolated compounds, the best activity was observed for p-coumaric acid (13) (MIC 31.3 μg/mL or 190.9 μM) alone and in mixture with 4-hydroxybenzoic acid (12) (MIC 62.5 μg/mL).

Conclusions

The above results provide for the first time some scientific evidence to support, to some extent, the ethno-medicinal use of Arctium lappa and Tussilago farfara as traditional antitubercular remedies.     

云木香化学成分研究Ⅱ

目的:为了研究菊科风毛菊属植物云木香的化学成分.方法:采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20和反相RP-18柱色谱等手段进行分离纯化,并通过波谱数据鉴定结构.结果:分离鉴定了8个化合物,1β-hydroxycolartin(1),5α-hydroxy-β-costic acid(2),11α,13-dihydroxydehidrocostuslactone(3),11,13-dihydro-7,11-dehydro-13-hydroxy-3-desoxyzaluzanin C(4),8α-hydroxyl-11β-11,13-dihydrodehydrocostuslactone(5),soulangianolide A(6),丁香树酯醇(syringaresinol,7),东莨菪内酯(scopoletin,8).结论:化合物1～4,6～8为首次从该属植物中分离,化合物5为首次从该植物中分离.     

基于高通量测序技术对牛蒡子药材与伪品药材混合粉末鉴定研究

牛蒡子是我国传统中药,主要伪品为毛头牛蒡、水飞蓟、云木香、大翅蓟、紫穗槐等果实。传统鉴定方法或分子条形码技术可以对牛蒡子和其伪品进行鉴定,但是对牛蒡子与其伪品混合粉末的鉴定较困难。该文利用高通量测序技术对牛蒡子以及其5种伪品混合粉末ITS2序列进行测序,对混合粉末物种进行鉴定,为牛蒡子药材混合粉末的鉴定提供新思路。对药材混合粉末中的总DNA进行提取,并对总DNA中ITS2片段进行扩增,利用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端(paired-end)测序,利用FLASH,QIIME以及GraPhlAn等软件对序列进行整理分析。结果显示:混合样品中共得到高质量的ITS2序列39 910条,其中,样品中的物种ITS2序列共34 935。进一步的进化分析表明样品中含牛蒡子、毛头牛蒡、水飞蓟、大翅蓟、云木香和紫穗槐。利用高通量测序技术,以ITS2序列作为DNA条形码,可以检测出混合粉末中含有牛蒡子及其伪品,为牛蒡子药材质量控制、安全用药以及中药混合粉末的鉴定提供参考。     

甘肃野生秦艽rDNA ITS区序列分析

目的:比较研究甘肃不同地区4种野生秦艽rDNA ITS碱基序列的差异及其规律,寻找秦艽组药材之间的分子鉴别方法。方法:对rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序,运用Clustal X,MEGA3等软件对ITS区序列进行分析。结果:不同地区秦艽、麻花秦艽、小秦艽及黄管秦艽的ITS长度为800 bp,ITS1,5.8S和ITS2序列长度分别为290,170,340 bp。根据两者序列以邻接法建立分子系统发生树。结论:ITS序列可以作为野生秦艽分子鉴定的依据。     

云木香乙醇提取物化学成分研究

目的:为了研究菊科风毛菊属植物云木香的化学成分。方法:采用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20,反相RP-18柱色谱等手段进行分离纯化,并通过波谱数据鉴定结构。结果:分离鉴定了17个化合物:ascleposide E(1),(+)-1-hydroxypi-noresinol-4″-O-methyl ester-4’-β-D-glucopyranoside(2),(+)-1-hydroxy-pinoresinol-4″-O-β-D-glucopyranoside(3),(+)-1-hydroxypinoresinol-1-O-β-D-glucopyranoside(4),苯基-β-D-葡萄糖苷(phenyl-β-D-glucopyranoside,5),苄基-β-D-葡萄糖苷(benzyl-β-D-glucopyranoside,6),正丁基-β-D-葡萄糖苷(n-butyl-β-D-glucopyranoside,7),ilicic alcohol(8),β-cyclocostunolide(9),reynosin(10),11β,13-dihydroreynosin(11),arbusculin A(12),1β-hydroxy-arbusculin A(13),santamarin(14),脱氢木香内酯(dehydrocos-tuslactone,15),11β,13-dihydro-3-epizaluzanin C(16),木香烯内酯(costunolide,17)。结论:化合物1～2首次从该属植物中分离,化合物3,5～7为首次从该植物中分离。     

蚂蟥和水蛭种间遗传变异和系统 关系的ITS序列分析

目的:为了阐明蚂蟥Whitmania pigra,水蛭Hirudo nipponia种间遗传分化系统关系.方法:运用TTS测序分析我国不同地区蚂蟥W.pigra、水蛭H.nipponia核糖体TTS碱基序列差异,用MEGA4.0软件中的MP法构建的分子进化树.结果:蚂蟥和水蛭平均总TTS序列长度在857.2～861.2 bp,其碱基A,T,G,C的平均分别为25.12%,28.28%,17.34%,29.29%.GC含量明显高于AT含量.通过对蚂蟥、水蛭TTS基因片段遗传特征的研究发现其种内变异很小,在14个群体中有45个位点发生转换.MP系统树将14个种群蚂蟥和水蛭分为两大类群.结论:蚂蟥和水蛭的变异类型可能为种内变异为主.同时发现,基于DNA序列的蚂蟥及水蛭的系统分类结果与分类学的分类结果不完全一致,可能是由TTS序列在进化过程中发生了少量位点的变异,如碱基之间的转换、颠换和缺失等造成的.     

微波辅助提取木香有效成分的研究

目的:微波提取优选木香有效成分的最佳工艺条件。方法:采用正交试验法,通过高效液相法测定其指标成分木香烃内酯和去氢木香烃内酯,对微波提取木香有效成分的各影响因素进行考察。结果:优选木香提取工艺为微波功率400 W,以60%乙醇4倍量提取4次,每次20 min。结论:表明微波的提取时间短,能耗低,提取效率高,优于常规回流提取方法。