PRL-3基因沉默对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察短发夹状小干扰RNA（shRNA）沉默PRL-3基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的影响。方法：构建PRL-3基因特异性shRNA表达载体,使用脂质体法将PRL-3-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞。采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测转染后MCF-7细胞PRL-3基因mRNA和蛋白的表达;运用MTT法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：酶切鉴定和测序分析证实PRL-3-shRNA表达载体成功构建。转染成功后,PRL-3-shRNA组PRL-3基因mRNA和蛋白表达水平明显降低。MTT结果显示MCF-7细胞转染PRL-3-shRNA后细胞增殖水平降低;流式细胞仪检测显示,PRL-3-shRNA转染后,MCF-7细胞凋亡率明显增高。结论：沉默PRL-3基因表达可抑制MCF-7细胞的增殖,促进其凋亡。     

利用siRNA靶向沉默Jeko-1细胞survivin mRNA基因的实验研究

本研究旨在探讨Survivin基因在淋巴瘤细胞中的生物学作用,为将来以Survivin为靶点治疗套细胞淋巴瘤提供实验室证据。体外化学合成针对survivin mRNA基因的siRNA片段,通过DMRIE-C转染Jeko-1细胞,以无关siRNA、未转染的细胞为对照,采用RT-PCR和Western blot方法检测siRNA的抑制效果,利用流式细胞术检测细胞的凋亡率,用CCK-8法检测转染24、48、72 h对细胞增殖的影响。结果表明,与未转染的空白组相比,siRNA转染Jeko-1细胞后24、48、72 h survivin mRNA的相对表达量分别为0.49±0.03、0.38±0.02和0.17±0.02;细胞增殖抑制率分别为(31.2±2.1)%、(43.3±3.4)%和(52.6±2.5)%;细胞凋亡率分别为(6.3±0.5)%、(13.5±1.1)%和(23.6±1.6)%;survivin蛋白表达水平逐步减低。结论:靶向survivin的siRNA能在体外特异性下调目的基因survivin mRNA和蛋白的表达,表现出抑制Jeko-1细胞增殖和促使其凋亡的生物学效应,survivin基因有望成为淋巴瘤治疗的一个药物靶点。     

外源性硫化氢单独或联合131I对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨外源性硫化氢(H2S)单独或联合131I照射对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与凋亡的影响,及其在γ射线中增敏或拮抗的作用.方法:体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,1 500μmol/L硫氢化钠(NaHS)单独或联合0.3 mCi的131I作用于细胞;台盼蓝染色法检测细胞死亡率,Hoechst 33342/PI双染观察细胞形态改变,流式细胞术检测细胞周期分布的改变及细胞凋亡.结果:NaHS明显抑制MCF-7细胞增殖,使其阻滞于G0/G1期,G2/M期百分率则明显减少,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).NaHS联合131I作用于细胞96h,与131I照射组比较:照射时间≥2h时细胞凋亡率及死亡率显著增加(P＜0.05),并呈照射时间依赖性.结论:外源性H2S抑制MCF-7细胞增殖,但未能诱导明显凋亡;H2S增加MCF-7细胞对γ射线的辐射敏感性,可能与其使细胞G2/M期显著减少相关.     

siRNA沉默VDAC1对MCF-7细胞增殖、周期的影响及其作用机制

[目的]观察siRNA沉默VDAC1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响.[方法]针对人VDAC1基因设计并合成siRNA,并将VDAC1-siRNA转染MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测MCF-7细胞中VDAC1的表达水平,MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况,流式细胞术检测MCF-7细胞的周期分布,同时Western印迹法检测周期蛋白D1的表达.[结果]MCF-7细胞转染VDAC1-siRNA后能够有效抑制VDAC1的表达,显著抑制其增殖水平,促使MCF-7细胞发生G1期阻滞,同时下调Cyclin D1蛋白表达.[结论]VDAC1沉默能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,促使细胞发生G1期阻滞.VDAC1可作为乳腺癌治疗的新靶点.     

表柔比星对乳腺癌细胞c-FLIP表达的影响

目的:探讨表柔比星对乳腺痛细胞中c-FLIP表达的影响.方法:以MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞株为对象分两组:处理组中加入2 mg/L的表柔比星分别作用24 h、48 h和72 h,对照组加入等量生理盐水.采用RT-PCR技术检测两组细胞株中c-FLIP的表达,漉式细胞仪检测细胞凋亡百分率.结果:MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞中有c-FLIP的表达;与对照组相比,表柔比星作用24 h,乳腺癌细胞中c-FLIP的表达明显下降,48 h时c-FLIP表达有所升高,72 h时表达最低.随着表柔比星作用时间延长,细胞凋亡率逐渐增加,72 h达到最高.结论:表柔比星通过抑制c-FLIP的表达促进乳腺癌细胞的凋亡.     

缺氧环境下shRNA下调MTDH基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨缺氧环境下MTDH表达下调对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响。方法 1利用二氯化钴模拟缺氧环境,采用RT-PCR及Western blot法检测HIF-1α及MTDH基因在缺氧环境下表达水平的改变;2缺氧环境下将加入MTDH-shRNA转染质粒的MCF-7细胞(缺氧MTDH-shRNA组)、control-shRNA转染质粒的MCF-7细胞(缺氧Control-shRNA组)及仅予单纯二氯化钴缺氧处理的MCF-7细胞(单纯缺氧组)分别转染,24 h后观察转染率,再应用RT-PCR及Western blot法检测MTDH基因在mRNA和蛋白水平上的变化;3MTT实验检测下调MTDH基因表达对单纯缺氧组、缺氧Control-shRNA组和缺氧MTDH-shRNA组MCF-7细胞增殖的影响,并采用Hoechst33258染色及流式细胞术检测3组细胞的凋亡情况;4采用RT-PCR及Western blot法观察下调MTDH基因对单纯缺氧组、缺氧Control-shRNA组和缺氧MTDH-shRNA组HIF-1α表达的影响。结果 1缺氧环境下MCF-7细胞HIF-1α基因表达无变化,HIF-1α蛋白表达在一定范围内随缺氧时间延长而升高(P0.05),MTDH基因及蛋白表达随缺氧时间延长均逐渐升高(P0.05);2MCF-7细胞转染率约60%,与单纯缺氧组和缺氧Control-shRNA组相比,缺氧MTDH-shRNA组MTDH基因及蛋白表达均减低(P0.05);3下调MTDH基因表达后,与单纯缺氧组及缺氧Control-shRNA组比较,缺氧MTDH-shRNA组MCF-7细胞增殖抑制率减弱(P0.05),凋亡细胞数量增加(P0.05);4下调MTDH基因表达后,与单纯缺氧组及缺氧Control-shRNA组比较,缺氧MTDH-shRNA组HIF-1α蛋白表达减低(P0.05)。结论缺氧环境下,下调MTDH基因可调控MCF-7细胞HIF-1α蛋白表达,同时降低MCF-7细胞增殖能力,并促进其凋亡。     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA（siRNA）对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体。以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率。实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组。转染后24、48和72h,用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率。结果与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52％。实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强。转染48h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13．6％±1．8％。结论在RNAi研究巾,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值。     

苯丁酸钠和二甲基甲酰胺对乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制及同源盒基因(HOX)A5表达影响的比较

目的:观察苯丁酸钠(PB)和二甲基甲酰胺(DMF)对乳腺癌MCF-7细胞增殖及同源盒基因(HOX)A5表达的影响.方法:应用MTT比色法,以梯度浓度的PB或DMF作用于MCF-7细胞,分别于24、48、72h对细胞增殖进行检测.HOXA5基因表达水平用基因组与β肌动蛋白(β-actin)灰度比值表示.结果:0.391～3.125mmol/LPB和0.5～8.0mmol/LDMF作用MCF-7细胞24～72h,随着PB浓度的增加或作用时间的延长,细胞生长抑制率明显增加.随着DMF浓度的增加或作用时间的延长,细胞生长抑制率也较明显地增加.RT-PCR法检测未处理乳腺癌MCF-7细胞中HOXA5基因表达0.460±0.065.应用0.781mmol/L和1.563mmol/LPB处理后,HOXA5基因表达水平分别为0.801±0.122、0.903±0.096,HOXA5基因表达明显上调,与用药前比较,差异有统计学意义(P<0.01).应用0.5mmol/L和1.0mmol/LDMF处理后,HOXA5基因表达水平分别为0.474±0.057、0.484±0.061,HOXA5基因表达无明显变化,与用药前比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论:PB和DMF可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,PB对HOXA5基因mRNA水平的表达有明显的上调作用,DMF对HOXA5基因表达无显著影响.     

MK基因特异性siRNA对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制Midkine对人乳腺癌癌细胞株MCF-7细胞凋亡的影响。方法人工合成抑制Midkine基因的siRNA片段,通过脂质体转染到MCF-7细胞内,应用RT-PCR检测bcl-2mRNA表达,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化,通过测定光密度值检测Caspase-3活性。结果转染siRNA后的MCF-7细胞,bcl-2mRNA表达显著下降、细胞线粒体膜电位明显下降和Caspase-3酶活性升高。结论MK-siRNA通过下调hcl-2基因,而改变细胞线粒体膜电位使Caspase-3酶活性升高诱导细胞的凋亡。     

DLC-3表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的探讨外源性过表达DLC-3对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及凋亡活动的影响。方法对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组细胞转染DLC-3基因过表达质粒,阴性对照组细胞转染空白质粒,空白对照组细胞仅进行换液处理。3组采用实时PCR法检测细胞DLC-3 mRNA相对表达量;转染12、24 h后,采用细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率;转染48 h后,采用CCK-8实验检测细胞增殖率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果实验组DLC-3 mRNA相对表达量(17 563.57±2 880.85)高于空白对照组(0.56±0.43)和阴性对照组(1.00±0.00)(P0.05),空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞增殖率[(31.47±5.57)%]低于阴性对照组[(36.27±3.71)%]和空白对照组[(37.90±5.70)%],但差异无统计学意义(P0.05);转染12、24 h后,实验组划痕愈合率[(32.769±4.349)%、(38.237±4.286)%]低于空白对照组[(37.506±1.836)%、(49.052±4.090)%](P0.05),阴性对照组[(35.659±3.970)%、(48.724±5.092)%]与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞凋亡率[(15.893±1.597)%]高于阴性对照组[(10.277±1.947)%]和空白对照组[(11.973±1.564)%](P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论提高MCF-7细胞中DLC-3表达可降低细胞增殖水平,抑制其迁移能力,并促进细胞凋亡。     

人乳癌细胞小球藻CvFad3基因的表达和作用

目的构建真核表达载体pEGFP-C3-n-3,检测小球藻n-3脂肪酸脱氢酶基因CvFad3在人乳癌MCF-7细胞中的表达和作用。方法通过RT-PCR法扩增得到CvFad3基因,将CvFad3基因cDNA插入到真核表达载体pEGFP-C3中,构建重组表达载体pEGFP-C3-n-3,并将其转染入MCF-7细胞中,设空载体pEGFP-C3为对照组。采用RT-PCR检测CvFad3基因的表达,MTT法分析CvFad3基因对MCF-7细胞增殖的影响,气相色谱检测CvFad3基因对MCF-7细胞n-3多不饱和脂肪酸含量的影响。结果构建的重组载体pEGFP-C3-n-3转染入乳癌MCF-7细胞48 h后可检测到CvFad3基因mRNA的条带,而转染pEGFP-C3的MCF-7细胞48 h后检测不到CvFad3基因mRNA的条带。与对照组比较,转染pEGFP-C3-n-3的细胞MTT吸光度明显降低（t=6.039,P〈0.01）;人乳癌细胞MCF-7细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量显著升高。结论重组载体pEGFP-C3-n-3构建成功,CvFad3基因能在MCF-7细胞内有效异源表达,且抑制了MCF-7细胞的增殖,增加了细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量。     

吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的探讨吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法应用MTT比色检测法测定不同浓度(0、5、10、100、250)μmol/L不同作用时间(24 h、48 h、72 h)下吉西他滨对MCF-7人乳腺癌不同时期细胞生长抑制作用,倒置显微镜观察吉西他滨对MCF-7细胞形态学的影响,流式细胞仪测定MCF-7细胞凋亡情况,应用Western blot法及免疫荧光法对Bcl-2、Bax蛋白进行定性及定量分析。结果 MTT结果显示,吉西他滨能有效抑制MCF-7细胞增殖,且呈剂量及时间依赖性。在倒置显微镜下观察吉西他滨作用MCF-7细胞后,细胞呈通透性增加,形态不规则,细胞脱落破碎等改变。MCF-7乳腺细胞培养24 h后应用流式细胞仪可观察到5μmol/L、10μmol/L吉西他滨组细胞凋亡率分别为(34.25±3.89)%、(45.89±4.32)%显著高于对照组(4.02±0.39)%,差异有统计学意义(t=5.269,7.452,P0.05)。Western blot法显示MCF-7细胞中Bax蛋白表达增多,而Bcl-2蛋白表达减少。免疫荧光法显示在细胞培养24 h后随着吉西他滨浓度增加,Bax蛋白表达强度增加,而Bcl-2蛋白表达强度减弱。结论吉西他滨能有效抑制乳腺癌细胞增殖,诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与上调Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白有关。     

UbcH10基因沉默对多发性骨髓瘤U-1996细胞增殖和凋亡的作用研究

目的采用脂质体法转染siRNA的方法沉默多发性骨髓瘤U-1996细胞中的UbcH10基因,研究基因沉默后U-1996细胞增殖活性及凋亡等生物学特性的变化情况。方法根据UbcH10基因信息,设计针对UbcH10基因编码序列(CDS)区的siRNA序列。通过脂质体法转染相关siRNA序列至多发性骨髓瘤U-1996细胞。在转染siRNA后48h,采用实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹法检测U-1996细胞中UbcH10基因的mRNA和其蛋白水平。选取未转染siRNA序列的空白组和转染阴性siRNA序列组作为试验对照,采用CCK-8法检测转染siRNA序列后24、48、72hU-1996细胞的增殖情况,采用流式细胞术检测48h后U-1996细胞的凋亡情况。结果通过脂质体法成功转染构建siRNA序列至U-1996细胞。转染后的U-1996细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白表达情况较转染前均明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。和对照组相比,沉默UbcH10基因后U-1996细胞的增殖活性下降,差异有统计学意义(P0.05),细胞凋亡率上升,差异也有统计学意义(P0.05)。结论干扰UbcH10基因表达可显著抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖活性并增加细胞凋亡。     

Survivin基因沉默对恶性胶质瘤U87细胞的影响

目的探讨Survivin基因沉默对人脑胶质瘤细胞株U87体外细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用脂质体将pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞,通过western法检测干扰48h后Survivin蛋白的抑制率,通过MTT法观察转染后24 h、48 h和72 h细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染后48 h细胞凋亡和细胞周期的变化。结果pGenesil Survivin shRNA干扰质粒转染U87细胞48 h后,Survivin蛋白的抑制率约为78%;阻滞U87细胞由G1期进入S期,抑制细胞的生长,增加了细胞的凋亡。结论Survivin shRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U87细胞Sur-vivin基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖。     

hTERT基因沉默对乳腺癌细胞生物学特性及COX-2表达的影响

目的本研究探讨hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞生物学特性及环氧化酶-2(COX-2)的影响。方法设计合成特异性针对hTERT mRNA的siRNA,电转染入乳腺癌细胞,以致目的基因沉默。应用RT-PCR及Western blot法检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白的表达状况;应用流式细胞仪检测细胞周期;并通过CCK-8增殖实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力;经小室侵袭实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。利用免疫组织化学法检测COX-2蛋白的表达。结果 hTERT基因沉默48h后,hTERT转染组在沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白表达呈现明显降低(P0.05);细胞周期检测结果示乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,三组比较统计学差异明显(P0.05);CCK-8增殖实验结果表明乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞在hTERT转染组的增殖得到显著抑制(P0.05);小室侵袭实验结果表明,hTERT转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P0.05);免疫组织化学法检测结果显示,COX-2蛋白在hTERT转染组的表达明显降低,并与hTERT基因的表达相关联。结论 hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞的增值和迁移能力均有影响,并能降低COX-2蛋白的表达,从而改善乳腺癌患者预后。     

DLL4/Notch1配体过表达抑制K562细胞生长机制研究

本研究旨在探讨Notch1信号通路的配体delta-like ligand4（DLL4）基因过表达对K562细胞增殖的影响及其可能的作用机制.采用脂质体介导将含配体DLL4基因的质粒pBudCE4.1-DLL4转染K562细胞,通过RT-PCR和Western blot检测转染48 h后DLL4基因的mRNA及蛋白表达,同样检测转染后Notch1受体胞内区（NICD）、下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达;通过Western blot检测与Notch信号通路相关的细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达水平;用CCK-8法检测转染后细胞的增殖情况;用流式细胞术检测转染质粒48 h后各组细胞的凋亡情况.结果表明,DLL4基因转染后的K562细胞中DLL4、NICD及下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达量比对照组明显增多（P＜0.05）,说明DLL4的过表达激活了Notch1信号通路;Western blot方法检测显示,DLL4的转染增加了细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达,从而抑制了K562细胞的生长,诱导细胞周期停滞于G1期及细胞凋亡的增加.结论：外源性DLL4基因过表达可有效活化K562细胞内Notch1信号通路,可能通过YY1、C-MYC及Rb等Notch信号通路相关基因的高表达诱导K562细胞的生长减慢及细胞凋亡.     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

特异性抑制Aqp1基因对K562细胞生长的抑制作用

本研究探讨靶向aqp1(aquaporin 1)基因的siRNA对K562细胞生长的抑制作用。设计siRNA,转染K562细胞,在相差显微镜观察细胞形态变化;用MTT法观察aqp1-siRNA对K562细胞活力的影响;使用流式细胞仪、DNA片段化分析K562细胞凋亡;用RT-PCR半定量检测转染前后aqp1基因表达。结果表明:苏木素-伊红染色后,细胞呈现明显的凋亡形态;转染24小时后aqp1-siRNAs对K562细胞的活性有显著抑制作用;aqp1-siRNA转染K562细胞后可见明显的凋亡峰,24、48和72小时的细胞凋亡率持续上升,分别为24.2%、36.1%和42.9%;48小时后aqp1-siRNA组出现明显的DNA凋亡"梯形电泳带";aqp1基因的表达水平在aqp1-siRNA转染后24、48和72小时,分别减少了33%、46%和57%。结论:aqp1-siRNA能够抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,可作为治疗恶性肿瘤的新靶点。     

应用RNA干扰技术沉默vegfr-2基因的实验研究

为了探讨恶性肿瘤基因治疗的新靶点,本研究以vegfr-2的mRNA为靶点,设计、构建vegfr-2 shRNA的真核表达载体,用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌A549细胞,用RT-PCR法及Western blot分别检测重组质粒对该基因mRNA和蛋白表达的抑制效果,应用CCK-8法检测细胞增殖、抑制情况,Hoechst染色法检测细胞凋亡形态学变化。结果表明:与空白对照、空质粒对照及scramble对照相比,干扰组shRNA能有效地降解vegfr-2mRNA,尤其转染pGenesil-1-vegfr-2-shRNA-1质粒组内源性vegfr-2 mRNA及蛋白减少更显著;在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低,转染后72小时抑制率最高,干扰组与空质粒组和空白对照组相比,对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(p0.01);Hoechst荧光染色显示,转染48小时后在荧光显微镜下干扰组细胞呈典型的细胞凋亡形态。结论:vegfr-2 shRNA真核表达载体可序列特异性下调A549细胞的基因转录和表达,有效抑制细胞增殖和诱导凋亡,提示VEGF/VEGFR-2信号通路可作为恶性肿瘤基因治疗和功能研究的理想靶点。     

prohibitin在乳腺癌MCF-7细胞表达抑制的鉴定

目的 利用靶向prohibitin基因的shRNA表达质粒转染乳腺癌MCF-7细胞,进而观察prohibitin 在转染组细胞的表达情况.方法 将构建的prohibitin基因shRNA表达质粒用脂质体法转染人乳腺癌MCF-7细胞,通过荧光定量PCR和Western blot 检测其在mRNA及蛋白水平的干扰效应.结果 转染Ⅰ组、转染Ⅱ组、转染Ⅲ组细胞PHB mRNA表达量分别是阴性对照组的27.2%,45.6%和29.4%;空白对照组的23.7%,39.7%和25.6%;转染Ⅰ组、转染Ⅱ组、转染Ⅲ组细胞PHB/β-actin灰度值比值分别是阴性对照组的27.4%,39.4%和30.1%;空白对照组的26.9%,38.7%和29.5%.构建的shRNA表达载体可以使MCF-7细胞中prohibitin基因的mRNA及其蛋白含量降低.结论 构建的针对prohibitin基因的shRNA表达载体,转染MCF-7细胞后可有效抑制细胞中prohibitin的表达,证实构建有效.