大肠杆菌—分支杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因人白细胞…

目的 构建和鉴定大肠杆菌－分支杆菌穿梭表达质粒，检测外源基因在大肠杆菌和卡介苗（ＢＣＧ）中的稳定表达。方法 采用基因工程技术构建大肠杆菌－分支杆菌穿梭表达质粒，用电穿孔法将重组质粒ＰＺＳＩＩＩ－Ｉ转化ＢＣＧ，用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定外源基因白细胞介素－２（ＩＬ－２）在ＢＣＧ和大肠杆菌中的到达。结果 外源基因人ＩＬ－２基因能在大肠杆菌和ＢＣＧ中稳定表达，并能从Ｂ     

表达白细胞介素-2质粒DNA抗小鼠肝癌作用

目的探讨瘤内注射表达hIL-2质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用。方法构建真核表达质粒载体pDC511hIL-2;ELISA方法检测质粒载体在真核细胞中的表达;胸腺细胞增殖法(MTT法)检测hIL-2生物学活性。小鼠肝癌H22皮下移植瘤瘤内直接注射质粒DNA后,观察各组小鼠存活时间,肿瘤体积变化;检测小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。在质粒DNA注射后一月进行瘤体组织病理学观察。结果构建的质粒载体能在真核细胞内高效表达hIL-2(3087.18pg/ml.24h.106)。质粒载体表达的hIL-2体外刺激胸腺细胞增殖作用非常明显。hIL-2基因治疗组与空载体组相比,肿瘤生长明显受抑制(F=3.85,P=0.03),小鼠存活期显著延长(x2=4.10,P=0.03),并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强。pDC511hIL-2DNA瘤内注射一月后,肿瘤病灶炎性细胞浸润明显,病灶内肿瘤细胞广泛坏死。结论瘤内注射hIL-2表达质粒DNA可抑制小鼠肝癌皮下移植瘤的生长,提高荷瘤生存期。     

人白细胞介素-15克隆的构建及表达

从经脂多糖刺激的外周血单核细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增出白细胞介素-15(IL-15)成熟肽前体蛋白基因,将其插入到质粒pGEX-4T-2编码谷胱肽转移酶(G ST)的多克隆位点(M CS),构建原核表达克隆(PGEX-4T-2/IL-15);重组质粒经酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白图谱,W estern b lot鉴定表达蛋白。结果成功构建了pGEX-4T-2/IL-15原核表达克隆,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出相对分子质量(M r)为42×103D a ltons的融合蛋白,且该蛋白能与抗IL-15抗体发生特异性结合反应。本研究可为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定基础。     

白细胞介素-23和白细胞介素-12亚单位在系统性红斑狼疮中的表达研究

目的研究自身免疫性疾病系统性红斑狼疮(SLE)中白细胞介素(IL)-23和IL-12的调节作用。方法78例SLE患者[以SLE疾病活动评分(SLEDAI)进行活动性评分]和正常对照36名,分别抽提SLE患者和正常对照外周血单个核细胞(PBMC)的mRNA,并反转录成cDNA,用实时定量聚合酶链反应(PCR)的方法对IL-23特异的亚单位P19、IL-12特异的亚单位P35以及它们共有的亚单位P40作定量分析,数据采用看家基因进行标化。结果未经治疗、已经治疗的SLE患者的IL-12特异性的亚单位P35表达水平显著低于正常对照(P值分别<0.05,<0.01)。与未经治疗相比,用类固醇激素或类固醇类激素加免疫抑制剂治疗的SLE患者显著抑制P40和P19的表达(P值分别<0.01和<0.05)。活动性SLE患者(SLEDAI>10)的P19、P40、P35表达水平显著高于非活动性SLE患者(SLEDAI≤10)(P值分别<0.01,<0.01和<0.05)。结论IL-12的表达下降或IL-23的表达上调也许参与SLE的发病过程,这两种细胞因子有可能是SLE患者的治疗靶点。     

白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗Ⅰ期临床研究

目的　评价同种异型 (HLA A2 + )白细胞介素 (IL) 2基因工程人胃癌细胞瘤苗 (HG 1/IL 2 )治疗晚期胃癌的临床安全性并观察其不良反应。方法　应用基因工程技术 ,以逆转录病毒载体介导将人IL 2cDNA转导入人胃癌细胞株MKN 4 5 ,经 10 0Gy60 Co照射灭活后 ,制备成HG 1/IL 2。对 16例晚期胃癌病人施行HG 1/IL 2瘤苗治疗。 5次接种为一疗程 ,接种时间分别在第 1、8、15、2 9和 5 8天 ,每次于一侧腹股沟和对侧腋部皮下注射。剂量分为 4级 ,由初始剂量 1× 10 7/次开始逐级增加 ,每个剂量水平 4例。每次接种后严格观察不良反应 ,并在治疗开始前 1周和治疗结束后进行临床评价 ,同时进行凝血功能、血液生化、肿瘤标记物和相关免疫指标检测。结果　除 1例因疾病属快速进展 ,在接种 3次后死于多脏器功能衰竭外 ,余 15例均完成 5次接种。低热和注射局部红肿、酸胀感是最常见的反应。治疗前后未观察到病人血液学、凝血功能、肝肾功能、血清标志物等指标明显异常。部分病人治疗后血清转铁蛋白、IgG、IgA、IgM ,IL 2等体液免疫指标和CD+ 3 、CD+ 4 、CD+ 8等细胞免疫指标有一定程度提高。结论　在密切观察的前提下 ,HG 1/IL 2基因工程化胃癌细胞瘤苗应用于晚期胃癌的辅助治疗是安全可行的 ,向Ⅱ期临床试验推荐的剂量为     

白细胞介素-37在人HepG2细胞中的表达

[目的]研究白细胞介素-37(interleukin-37,IL-37)在人肝肿瘤细胞系(HepG2)细胞中的表达,及在炎症因子刺激下,HepG2细胞中IL-37表达水平的改变。[方法]在37℃、5%CO2条件下培养人HepG2细胞,以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激细胞,分别于刺激24h、48h、72h后提取细胞,分别提取细胞总RNA、总蛋白,利用逆转录酶聚合链反应技术(RT-PCR)检测细胞中IL-37-mRNA的表达,利用Western blot技术检测细胞中IL-37蛋白的表达水平。并且在LPS刺激细胞72h后,运用免疫荧光和激光共聚焦技术检测IL-37在细胞中的表达定位。[结果]RT-PCR结果证明HepG2中存在IL-37-mRNA的表达,且随着LPS刺激时间的延长IL-37-mRNA表达增多,0h(无刺激)、24h、48h、72h灰度值分别为0.10±0.008、0.14±0.014、0.22±0.010、0.28±0.014;Western blot结果显示细胞中存在IL-37蛋白的表达,且其表达趋势与IL-37mRNA表达趋势相同,即随着刺激时间延长,HepG2中IL-37蛋白表达增多,由24h、48h、72h分别为0.54±0.16、0.87±0.04、1.51±0.18;免疫荧光共聚焦结果显示IL-37在细胞核和细胞质中均有表达,以细胞核周围表达最为丰富。[结论]人HepG2细胞中存在IL-37表达,炎症因子刺激后,IL-37mRNA及IL-37蛋白表达水平均呈升高,趋势相同;IL-37在HepG2细胞质内和细胞核内均表达,以细胞核周围表达最为丰富。     

鼠白细胞介素3真核表达质粒的构建及鉴定

利用鼠白细胞介素3（IL－3）基因构建真核表达质粒,筛选获得的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序,证明小鼠IL－3基因正确克隆到pCDNA3真核表达载体上;将获得的真核表达质粒pCDNA3IL－3转化大肠杆菌细胞,增菌培养后大量提取pCDNA3IL－3质粒,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度,用于小鼠抗生育DNA疫苗在免疫小鼠模型的免疫增强佐剂。     

IDDM患者白细胞介素2和白细胞介素6的研究

测定ＩＤＤＭ患者１６例、ＮＩＤＤＭ患者２０例和正常对照组２７例的外周血单个核细胞产生白细胞介素２（ＩＬ－２）和白细胞介素６（ＩＬ－６）的能力。结果：ＩＤＤＭ患者ＩＬ－２水平较正常对照组和ＮＩＤＤＭ患者显著降低（ｐ＜０．００１），ＩＬ－６的水平显著升高（Ｐ＜０．００１）。ＮＩＤＤＭ患者ＩＬ－２和ＩＬ－６与正常对照组差异无显著性。提示ＩＤＤＭ患者ＩＬ－２和ＩＬ－６异常改变导致免疫功能紊乱。     

急性冠状动脉综合征患者白细胞介素-10及白细胞介素-6表达

目的:通过与C反应蛋白(CRP)检测对比,探讨抗炎因子白细胞介素(IL)-10、促炎因子IL-6与急性冠状动脉综合征(ACS)的关系。方法:冠心病患者78例,其中ACS患者40例(ACS组),稳定型心绞痛(SAP组)患者38例,33例胸痛综合征(CPS组)患者作为对照。所有患者均行冠状动脉造影检查。采用ELISA法检测血浆IL-6、IL-10水平,采用免疫比浊法测定CRP值。结果:与SAP组及CPS组相比,ACS组血浆IL-10水平明显降低,IL-6、CRP水平明显升高,差异有统计学意义;SAP组IL-10水平低于CPS组,IL-6、CRP水平高于CPS组,差异无统计学意义;血浆IL-10水平与IL-6及CRP水平呈负相关,IL-6水平与CRP水平正相关。结论:血浆IL-10水平降低和IL-6、CRP值升高对患者ACS的发生有预测价值。抗炎因子和促炎因子水平的失衡是导致斑块不稳定、急性冠状动脉事件发生的重要因素。     

白细胞介素-5、可溶性白细胞介素-2受体及一氧化氮与哮喘发病的关系

目的探讨白细胞介素-5(IL-5)、可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)、一氧化氮(N())及嗜酸性粒细胞(EOS)在哮喘发病中的意义。方法对治疗前后的急性发作期、稳定期哮喘组及对照组血清II-5、sIL-2R和NO水平及EOS计数进行了研究。结果哮喘急性发作组血清IL-5、sIL-2R、NO及EOS水平均明显高于哮喘缓解期组与对照组。哮喘发作期IL-5与EOS呈显著正相关。哮喘急性发作期组治疗后sIL-2R及NO水平较治疗前显著降低,IL-5与EOS水平下降但无统计学意义。结论血清IL-5、sIL-2R、NO及EOS水平升高,与哮喘发作密切相关。     

白细胞介素-23/-17轴在小鼠急性实验性结肠炎中的表达及作用

目的 研究白细胞介素(IL)-23/IL-17轴在小鼠实验性结肠炎结肠组织中的表达和作用.方法 将64只小鼠分为对照组24只、模型组24只、抗体组8只、正常血清组8只.除对照组外,其余各组建立小鼠急性实验性结肠炎模型.对照组和模型组小鼠分别于造模后24 h、48 h、7 d处死.抗体组和正常血清组小鼠分别于造模前2 h腹腔内注射多克隆大鼠抗小鼠IL-17中和抗体和正常大鼠血清,于造模48 h后处死.检测各组小鼠组织学损伤评分、肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性;酶联免疫吸附试验检测结肠组织IL-23p19、IL-17含量;免疫组化染色检测核因子(NF)-κB p65在结肠组织中的表达;实时荧光定量(RT)PCR检测IL-23p19、IL-17、IL-12p35的mRNA表达水平.结果 模型组24 h、48 h、7 d时IL-23p19蛋白表达水平和mRNA表达水平[分别为(15.53±3.32)、(31.16±4.98)、(14.03±3.56)ng/mg蛋白和4.09±0.34、3.39±0.46、6.54±1.82]、IL-17的蛋白表达水平和mRNA表达水平[分别为(0.35±0.06)、(0.38±0.08)、(0.26±0.05)ng/mg蛋白和4.21±2.61、2.65±0.91、5.63±1.43]均显著高于正常对照组(P值均＜0.05),48 h时达高峰.IL-23与IL-17蛋白表达水平和mRNA表达水平呈正相关(r值分别为0.745和0.793,P＜0.05).抗体组IL-23p19和IL-12p35高水平表达,但NF-κB p65阳性细胞率、组织学评分及MPO活性[分别为1.86%±0.36%、0.63±0.52、(0.40±0.03)U/g]明显低于48 h模型组[分别为4.35%±0.37%、5.13±0.64、(2.29±0.40)U/g],说明中和IL-17后能明显减轻结肠炎症,抑制NF-κB活性.结论 IL-23/IL-17轴在急性实验性结肠炎早期阶段起关键作用.IL-17有望成为炎症性肠病治疗的新靶标.     

白细胞介素-10抑制人肾系膜细胞环氧化酶-2及磷脂酶A2基因及蛋白表达的实验研究

目的观察白细胞介素-10(IL-10)对IL-1β诱导的人系膜细胞(HMC)前列腺素E2(PGE2)释放和胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)及环氧化酶-2(COX-2)基因和蛋白表达的影响.方法利用体外培养的人系膜细胞(HMC),设立对照组、IL-10(25ng/L)处理组、IL-1β(10ng/L)处理组及IL-10+IL-1β处理组;采用放射免疫测定法检测各组HMC培养上清中PGE2,应用RT-PCR和WesternBlot检测各组cPLA2、COX-2mRNA和蛋白水平.结果正常情况下,HMC低水平表达cPLA2、COX-2mRNA和蛋白并释放少量的PGE2;IL-1β能显著上调HMCPGE2释放及cPLA2、COX-2mRNA和蛋白的表达(P均＜0.01);IL-10对基础状态下的HMCPGE2释放及cPLA2、COX-2mRNA和蛋白表达无明显影响(P均＞0.05),但可显著下调IL-1β诱导的PGE2释放及cPLA2、COX-2mRNA和蛋白表达(P均＜0.01).结论IL-10抑制IL-1β诱导的HMCPGE2释放及cPLA2和COX-2表达,提示IL-10对HMC具有多方面抗炎作用.     

白细胞介素12调节小鼠Th1/Th2的抗结核分支杆菌感染研究

目的 观察、评价白细胞介素１２（ＩＬ－１２）对结核分支杆菌感染小鼠细胞因子的影响和疗效。方法 将ＢＡＬＢ／ｃ小鼠４２只,制成小鼠结核分支杆菌感染模型,随机分为对照组（ＰＢＳ）和ＩＬ－１２共两组（２１只）。给予ＰＢＳ或ＩＬ－１２治疗,检测血清γ干扰素（ＩＮＦ－γ）、ＩＬ－４、ＩＬ－１０水平（ＥＬＩＳＡ法）和器官菌数计数,观察治疗后生存率。结果 ＩＬ－１２组小鼠无一死亡、肺、肝、脾菌落数分别为（２２７     

白细胞介素-23在小鼠病毒性心肌炎中的表达

目的:研究小鼠病毒性心肌炎(VMC)模型中白细胞介素-23(IL-23)基因和蛋白的表达,探究其在VMC发病中的作用及其意义.方法:用柯萨奇病毒B3(CVB3)建立Balb/cVMC小鼠模型,实验组注射100 TCID 50病毒液0.1 ml;对照组注射等量磷酸盐缓冲液.在注射的第0、1、2、3、4和6周应用逆转录-聚...     

植物乳杆菌对白细胞介素-10基因敲除小鼠结肠炎的治疗作用

目的 评估植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,Lp）对白细胞介素-10基因敲除(interleukin-10 knockout,IL-10-/-)小鼠结肠炎的治疗作用,并探讨其可能的作用机制。方法 8周龄雌性IL-10-/-小鼠和WT小鼠各20只,各自平均分成2组,即WT组、WT+Lp组、IL-10-/-组和IL-10-/- +Lp组。WT和1L-10-/-组予0.5 ml PBS灌胃,WT+ Lp和IL-10-/-+ Lp组予0.02g Lp(0.5 ml)灌胃,每天摄入Lp1×109菌落形成单位(CFU),持续灌胃4周后实验结束。实验开始前（0周）及开始后每隔1周收集小鼠新鲜粪便1次,直至实验结束。实验结束后将小鼠处死,记录各组小鼠体重变化,并测量其结肠长度和湿重,切取新鲜结肠组织标本做病理切片及结肠黏膜促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素-γ(IFN-γ)检测。并对小鼠新鲜粪便作选择性细菌培养,观察Lp在正常小鼠和炎症小鼠体内的定植情况及其对肠道菌群的调节作用。结果 与WT小鼠相比,IL-10-/-小鼠腹泻较重,体重亦明显下降(P＜0.05),存在严重营养不良,而经Lp治疗后IL-10-/-小鼠腹泻得到缓解,体重亦明显增加(P＜0.05)。病理学检查显示,所有IL-10-/-小鼠皆发生肠道炎症,经Lp治疗后肠道炎症得到明显改善,黏膜溃疡、上皮增生及黏膜固有层淋巴细胞和中性粒细胞浸润明显减轻,病理学评分明显降低(P＜0.01)。IL-10-/-小鼠经Lp治疗后结肠湿重及湿重与长度比出现明显变化(P＜0.01),结肠水肿和增厚现象得到明显改善。IL-10-/-组小鼠结肠TNF-a和IFN-γ含量分别为(377.4±84.4) μg/g和（602.6±108.1）μg/g,均较WT组明显增加[（139.2±32.7）μg/g和（173.0±52.4）μg/g,P＜0.05）]。Lp干预4周后,IL-10-/- +Lp组小鼠结肠TNF-α和IFN-γ的含量分别为(207.2±65.7) μg/g和(442.1±138.4) μg/g,均较IL-10-/-组显著降低(P＜0.05)。IL-10-/-小鼠体内肠道菌群出现紊乱。结论 Lp能有效减轻IL-10-/-小鼠肠道炎症,对结肠炎起到一定的治疗作用,且这种治疗作用与Lp调节肠道菌群及抑制促炎细胞因子的表达有关。