矾酸钠和染料木黄酮对脑缺血/再灌注诱导海马神经元损伤的作用及分子机制

目的研究矾酸钠和染料木黄酮对脑缺血／再灌注后海马神经元损伤的作用及其分子机制。方法采用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉结扎诱导的短暂(15min)前脑缺血模型，用底物γ^-32P掺入法测定酪氨酸蛋白激酶(PIK)的活性，免疫印迹法分析NMDA受体2B亚基(NR2B)的酪氨酸磷酸化变化；采用体外孵育的大鼠海马脑片模拟缺血模型，测定海马神经元细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的漏出量作为神经元损伤的指标。结果沙土鼠缺血／再灌6h，海马突触体总PIK活性显著升高，缺血前20min腹腔注射染料木黄酮对PIK总活性有明显的降低作用，而矾酸钠对其却无明显作用；短暂前脑缺血／再灌注6h后，NR2B的酪氨酸磷酸化显著增加，矾酸钠与染料木黄酮可分别增加、减少这种磷酸化的增加，而对NR2B的蛋白表达无明显作用；大鼠海马脑片“缺血”30min／再灌1h，细胞LDH的漏出量明显增加，“缺血”前15min，在海马脑片孵育液中加入矾酸钠与染料木黄酮可分别增加、减少LDH的漏出量。结论PIK和酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)共同参与缺血性脑损伤的调节，而PIK起着更为重要的作用。     

钒酸钠对缺氧大鼠海马脑片突触体膜磷酸酪氨酸蛋白及神经元损伤的影响

目的　研究酪氨酸蛋白磷酸酶 (PTP)抑制剂钒酸钠对缺氧海马突触体膜 (synapticplasmamembranes,SPM)磷酸酪氨酸蛋白 (p -tyr-pr)含量及神经元损伤的影响。方法　采用大鼠海马脑片体外缺氧模型 ,建立了p-tyr-pr测定的ELISA法 ,观察了PTP抑制剂钒酸钠对缺氧大鼠海马脑片突触体膜中p -tyr-pr含量及脑片孵育上清液中乳酸脱氢酶 (LDH)漏出量的影响。结果　缺氧引起SPM中p -tyr -pr含量下降 ;缺氧前 15min加入钒酸钠 ,则p -tyr-pr显著增加 ,同时LDH漏出量明显升高 ,且其漏出量增加与钒酸钠浓度呈剂量依赖关系。结论　蛋白酪氨酸磷酸化的增加可能起加重缺血性脑损伤的作用。     

钒酸钠对缺氧大鼠海马脑片突触体膜磷酸酪氨酸蛋白及神经元损伤 …

目的 研究酪氨酸蛋白磷酸酶抑制剂钒酸钠对缺氧海马突触体膜磷酸酪氨酸蛋白含量及神经元损伤的影响。方法 采用大鼠海马脑片体外缺氧模型,建立了ｐ－ｔｙｒ－ｐｒ珠ＥＬＩＳＡ法,观察了ＰＴＰ抑制钒酸钠对缺氧大鼠海马脑片突触体膜肿ｐ－ｔｙｒ－ｐｒ含量及脑片孵育上清液中乳酸脱氢酶漏出量的影响。     

全脑缺血诱导海马组织信号转导与转录激活子-3的激活和DNA结合活性的调控

目的 研究全脑缺血诱导海马组织信号转导与转录激活子-3（STAT3）的激活调控。方法 采用SD雄性大鼠四动脉结扎建立的全脑缺血模型。以及腹腔注射给药的方法。运用免疫印迹和电泳迁移率改变实验检测蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸化抑制剂对海马核抽提物STAT3的磷酸化水平及DNA结合活性的影响。结果 缺血前20min腹腔注射染料大黄酮能明显抑制全脑缺血导致核内STAT3磷酸化水平及DNA结合活性的增高；而蛋白磷酸酶抑制剂矾酸钠则能明显促进两者的增加。结论 全脑缺血所致STAT3的磷酸化水平及DNA结合活性的增高可能受蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶的双重调控。     

缺血再灌注对大鼠学习记忆及海马神经元Glu、NR1和NR2B表达的影响

目的观察脑缺血再灌注对大鼠学习记忆能力及海马神经元谷氨酸（Glu）、NR1、NR2B表达的影响，探讨脑缺血损伤与Glu兴奋性毒性的关系。方法采用PULLINSIN-4VO改良法制备血管性痴呆动物模型，MORRIS水迷宫检测其空间学习记忆能力，苏木精-伊红染色显示海马组织结构变化，免疫组织化学SABC法显示海马神经元Glu及NR1、NR2B的表达。结果缺血15min再灌注损伤48h后，海马神经元大量坏死损伤，大鼠学习记忆能力明显下降，海马内Glu、NR1和NR2B表达显著增加（F=22．063～1368．839，q=3．453～5．342，P〈0．01）。结论缺血再灌注使大鼠学习记忆能力下降，其机制与海马神经元Glu、NR1和NR2B的表达增加有关。     

鞘氨醇和佛波酯对体外培养海马脑片无氧与再灌损伤的保护作用

目的 研究无氧再灌对海马脑片的影响以及鞘氨醇和佛波酯的作用。方法 采用海马脑片体外无氧再灌模型，以孵育上清液乳酸脱氢酶漏出量为损伤指标。结果 体外培养脑片先无氧１５ｍｉｎ，再灌０￣１２０ｍｉｎ，随着无氧再灌时间的延长，ＬＤＨ漏出增加。无氧前１５ｍｉｎ，于培养液中分别加入鞘氨醇和佛波酯，则ＬＤＨ漏出量明显低于对照组。结论 无氧和再灌引起海马脑片严重损伤，鞘氨醇和佛波酯对上述损伤有明显的保护作用。     

大鼠皮质神经元缺氧缺糖/再灌注诱导NMDA受体亚基NR2A酪氨酸磷酸化

目的 研究大鼠皮质神经元缺氧缺糖（OGD）/再灌注诱导N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体NR2A酪氨酸磷酸化水平升高的可能分子机制.方法 以培养的大鼠皮质神经元OGD为模型,通过免疫沉淀（IP）及免疫印迹（IB）的方法 研究NR2A酪氨酸磷酸化.结果 OGD/再灌注后NR2A酪氨酸磷酸化水平快速并持续升高,至18 h达高峰（约为sham组的4.9倍）;于OGD前加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、地（艹卓）西平（MK-801）、尼莫地平（nimodipine）、染料木黄酮（genistein）和KN-62等,对NR2A酪氨酸磷酸化的升高均有明显的抑制作用.结论 OGD/再灌注诱导NR2A酪氨酸磷酸化水平的升高可能与胞外Ca2＋内流有关,并与NMDA受体通道和L-型电压门控钙通道（L-VGCC）的开放有关;而且,NMDA受体通道可以进行自身调控,L-VGCC对NMDA受体也有一定的调控作用.     

美金胺对缺血性脑损伤保护作用的研究

目的 观察美金胺对SD雄性大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区锥体细胞的保护作用,并研究其可能的机制.方法 采用四动脉结扎法建立大鼠全脑缺血模型,缺血15 min后分别灌注6 h或5天.大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注给药组和缺血/再灌注溶剂对照组.缺血/再灌注给药组腹腔注射20mg/kg美金胺.使用免疫印迹、免疫沉淀和焦油紫染色法等技术检测相关信号蛋白的表达、活化水平及神经元细胞的死亡.结果 大鼠缺血/再灌注5天后,缺血/再灌注给药组海马CA1区细胞的存活数量较缺血/再灌注组和缺血/再灌注溶剂对照组明显增加;缺血/再灌注6 h,缺血/再灌注给药组N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体亚基2A(NR2A)、突触后密集区蛋白95(PSD-95)、非受体型蛋白酪氨酸激酶(Src)三者间免疫沉淀的蛋白量及NR2A的酪氨酸磷酸化水平较缺血/再灌注组和缺血/再灌注溶剂对照组明显降低,而三者的表达量没有明显变化.结论 美金胺通过抑制NR2A、PSD-95、Src三者结合及Src介导的NR2A的酪氨酸磷酸化抑制了缺血后NMDA受体功能的增强,从而对大鼠缺血性脑损伤有保护作用.     

Src、Fyn激酶对脑缺血/再灌注大鼠海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响

目的观察脑缺血再灌注后海马Src家族酪氨酸蛋白激酶（Src family of protein tyrosine kinase,SrcPTKs）成员Src、Fyn激酶对NMDA受体（N-methyl-D-aspartate receptors,NMDAR,NR）NR2A亚基磷酸化水平的影响。方法采用Pulsinelli-Brierley四动脉阻断（four-vessel occlusion,4-VO）大鼠全脑缺血模型,缺血前连续3天脑室注射Src、Fyn反义寡核苷酸（antisense oligode oxynucletides,AS-ODNs）及错义寡核苷酸组（missenseoligodeoxynucletides,MS ODNs）后缺血15 min,用免疫沉淀和免疫印迹法检测NR2A亚基酪氨酸磷酸化水平的变化。结果Fyn反义寡核苷酸使脑缺血再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平下降,而Src反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平影响更加明显。结论脑缺血/再灌注过程中NMDA受体NR2A亚基的磷酸化主要是由Src激酶介导的。     

严重烫伤大鼠海马NMDA受体活性变化的机制研究

目的 研究严重创伤对海马NMDA受体（NR）活性的影响及其相关机制，为设法调节NR的活性从而控制创伤后HPA轴的过度兴奋提供实验依据。方法 以大鼠背部30TBSAⅢ度烫伤作为严重创伤过度应激模型，利用放射配基结合法检测烫伤后海马NR活性（最大结合容量及亲和和）的变化，Western-blot 免疫共沉淀方法检测烫伤海马NR1，NR2A，NR2B酪氨酸磷酸化的改变，高效液相色谱方法检测烫伤海马谷氨酸含量的变化。结果 严重烫伤后0．1,1,2,4,8,24,48h海马NR的亲和力显著增加，尤以烫伤后2h最为明显，最大结合量从1h起亦显著增加；各时相点海马酪氨酸磷酸化NR1，磷酸化NR2A磷酸化NR2B蛋白水平皆显著增高；烫伤后0,5,1,2,4h，海马内谷氨酸释放量增加非常明显，伤后24h及48h无明显变化。结论 严重烫伤导致海马NR持续过度激活；NR酪氨酸磷酸化水平的增加是其过度激活的重要原因，氨酸释放量的变化可能不是持续激活的主要因素。     

孕酮对前脑缺血沙土鼠海马神经元的保护作用

目的 研究孕酮对沙土鼠前脑缺血海马受损神经元的保护作用。方法 采用同时夹闭双侧颈总动脉制成沙土鼠前脑缺血动物模型,测定腹腔注射孕酮后海马CA1区锥体细胞层神经元数目的变化。结果 前脑缺血组沙土鼠海马CA1区锥体细胞层神经元数目明显丢失,CA3区和齿状回相应层次的神经元数无明显变化。前脑缺血再灌注后腹腔注射孕酮可使海马CA1区锥体细胞层神经元丢失明显减少。结论 孕酮对脑缺血所引起的神经元损伤具有明显的神经保护作用。     

缺血预处理减轻沙土鼠脑缺血再灌注损伤与海马CA1区p-p38MAPK表达的关系

目的:研究脑缺血预处理减轻沙土鼠脑缺血再灌注损伤与海马CA1区磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)含量之间的关系?方法:采用双侧颈总动脉夹闭造成前脑缺血的动物模型?动物随机分为假手术组(SH组)?预缺血组(IA组,前脑缺血3 min)?缺血再灌注组(IR组)?预处理组(IP组)?后3组末次缺血后再分为再灌注15 min?2 h?6 h?1 天和5 天时间点,每时间点8只动物?前4亚组用免疫组化法测定海马CA1区p-p38MAPK含量?再灌注1 天?5 天2亚组观察行为学变化和海马CA1区形态学存活细胞数目?结果:IA组?IR组?IP组沙土鼠海马CA1区再灌注15 min?2 h?6 h和1 天 p-p38MAPK表达均多于SH组,差异有统计学意义(P < 0.01 );IR组沙土鼠海马CA1区再灌注15 min?2 h?6 h和1 天 p-p38MAPK表达均多于IA组,差异有统计学意义(P < 0.01 );IP组沙土鼠海马CA1区再灌注15 min和2 h p-p38MAPK表达多于IA组,差异有统计学意义(P < 0.05),再灌注2 h?6 h和1天 p-p38MAPK表达较IR组下降,差异有统计学意义(P﹤0.05)?IA组与SH组沙土鼠行为学改变无统计学意义(P > 0.05);IR组沙土鼠再灌注1天和5天探索活动均较IA组增多,差异有统计学意义(P < 0.01);IP组沙土鼠再灌注1天?5天探索活动均少于IR组,差异有统计学意义(P < 0.01 )?IR组沙土鼠海马CA1区再灌注1天和5天存活神经元少于IA组,差异有统计学意义(P < 0.01);IP组沙土鼠海马CA1区再灌注5天存活神经元多于IR组,差异有统计学意义(P < 0.01 )?结论:3 min预缺血可引起海马CA1/3区p-p38MAPK水平轻度升高,但能降低24 h后5 min缺血再灌注引起的海马CA1区p-p38MAPK水平的上升程度?同时缺血预处理减少海马CA1区神经元死亡,并改善沙土鼠行为学变化?     

PTEN表达下调对神经元缺氧损伤的保护及其作用机制

目的 探讨PTEN对NR2B磷酸化的调节作用及其在阻断Ca2 内流和神经元保护中的作用.方法 建立神经元缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,转染shRNAspten-GFP质粒,采用Fura 2-AM法测定胞内Ca2 浓度,用免疫沉淀法和Western blotting检测NR2B及磷酸化水平.结果 OGD后NR2B酪氨酸磷酸化水平和胞内Ca2 浓度显著升高,shRNAspten-GFP能成功转染到神经元中,并可显著下调其酪氨酸磷酸化水平(F=11.82,P＜0.05),胞内Ca2 浓度也显著低于损伤组和PshGFP阴性对照组(F=62.85,P＜0.05).结论 PTEN表达下调对缺氧诱导的NR2B酪氨酸磷酸化水平升高有拮抗作用,阻断Ca2 内流,从而达到神经元保护作用.     

MAPK家族在沙土鼠前脑缺血再灌注期间海马神经元表达的动态变化

目的:探讨MAPK家族三成员在脑缺血再灌注期间其于海马不同亚区神经元的表达及活性变化。方法:采用沙土鼠双侧颈总动脉阻断缺血再灌注损伤模型。随机分为假手术组(SH)、3min缺血组(IA)及5min缺血组(IS);各组根据再灌注15 min、2 h、4 h、6 h、1 d、3 d、5 d及7 d又分8个亚组(n=8)。在预定时间点行免疫组化法测定海马各亚区MAPK蛋白及其磷酸化水平。结果:三组海马三区ERK、JNK及p38三种蛋白的总体水平在缺血后再灌注期间未发生改变。IS组磷酸化ERK(p-ERK)在缺血后CA3/DG区颗粒细胞及神经元树突上表达,而在CA1区几无表达;磷酸化JNK(p-JNK)在缺血后再灌注7 d内CA3区神经元均有少量表达,在CA1区表达量多并有二次表达高峰(2 h和1 d);磷酸化p-38(p-p38)缺血后再灌注期间的表达区域与p-JNK相似,有一次表达高峰(2 h)。IA组三激酶磷酸化水平均较IS组明显减少(P<0.05),表达规律相同。结论:脑缺血再灌注可导致MAPK三成员在海马各亚区差异性表达,此特征可能与MAPK的作用相关。     

钙离子通道在缺氧缺糖/再灌注诱导培养皮质神经元损伤中的作用

目的 探讨钙离子通道在缺氧缺糖/再灌注诱导皮质神经元损伤中的作用.方法 采用培养的大鼠皮质神经元缺氧缺糖模型,应用DAPI染色方法,以细胞凋亡率为指标,观察缺氧缺糖诱导神经兀损伤及Ca2＋螯合剂EGTA、NMDA受体拮抗剂MK-801、L-型电压门控钙通道（L-VGCC）拮抗剂尼莫地平、蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂染料木黄酮、CaMKⅡ抑制剂NK-62对缺氧缺糖/再灌注诱导神经元损伤的作用.结果 缺氧缺糖/再灌注诱导细胞发生凋亡,至再灌注24 h凋亡率达到80%左右;加入EGTA、MK-801及尼莫地平可以抑制细胞凋亡,凋亡率从80%分别降低为33%、35%和38%;加入染料木黄酮和KN-62可以使凋亡率从80%分别降低为43%和42%.结论 减少胞外Ca2＋浓度、阻断NMDA受体和L-VGCC、抑制蛋白酪氨酸激酶和CaMKⅡ可以减少缺氧缺糖/再灌注诱导的神经元损伤.缺氧缺糖/再灌注诱导的神经元损伤可能与胞外ca2＋内流有关,并与NMDA受体和L-VGCC两类钙通道的开放有关.     

蛋白激酶B(Akt)在沙土鼠海马缺血耐受中的表达

目的：探讨沙土鼠海马缺血耐受与CAl区蛋白激酶B(Akt)表达及锥体神经元凋亡之间的关系。方法：沙土鼠16只随机分为A(2min缺血组)、B(5min缺血组)、C：(2min缺血 5min缺血组)、D(假手术组)4组，每组4只。免疫组化(SP法)检测海马CAl区Akt表达，末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测锥体细胞凋亡。结果：A、C两组表达的Akt阳性细胞数明显多于B组，D组无明显从Akt表达;B组锥体细胞凋亡较A、C两组显著，D组未见明显凋亡细胞。结论：Akt可能通过抑制锥体细胞的凋亡参与介导沙土鼠海马缺血耐受。     

神经生长因子NGF对原代培养的海马神经元缺氧反应的影响

目的 :观察不同浓度NGF对大鼠海马神经元缺氧的保护作用。方法 :采用MTT比色法测定NGF对缺氧神经细胞活性的影响 ,测定LDH漏出率 ,分光光度法检测MDA ,同时进行形态学观察。结果 :各浓度NGF均对大鼠海马神经元缺氧损伤具有保护作用 ,NGF明显减少缺氧所增加的LDH漏出率和MDA含量 ,且能减轻细胞的形态学损伤。结论 :NGF可以通过减少LDH漏出率和MDA含量 ,对大鼠海马神经元缺氧损伤具有明显的保护作用     

大鼠海马脑片长期培养中NMDA受体亚单位NR2A和NR2B的表达变化

目的 研究在长期培养大鼠海马脑片各区中N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2A，NR2B表达的变化规律。方法 400μm厚大鼠海马脑片，体外培养1，2，3，4，5周，再作20μm厚冰冻切片，行NR2A，NR2B免疫组织化学反应和图像分析。结果 NR2A，NR2B在培养各周海马脑片各区锥体细胞和颗粒细胞体均有表达，NR2B还在CA1区锥体细胞顶树突明显着色。1周时，NR2A的表达较弱；4周时升至高峰，在CA3区，NR2B的表达1周时即达高峰；但在CA1区其表达至3周时始达高峰。结论 长期培养大鼠海马脑片各区中NR2A，NR2B的表达有时空变化，且二者的表达模式不同，提示此间NMDA受体的结构和功能可能也有改变。     

不同脑微血管内皮细胞条件培养液抗缺血及再灌神经元损伤的比较

目的:通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的检测,观察解毒通络药物干预后的脑微血管内皮细胞条件培养液(conditioned medium of cerebral microvascular endothelial cells,CMECs-CM)特征及其抗缺血及再灌皮质神经元损伤的效应,探讨脑微血管内皮细胞(cerebral microvascular endothelial cells,CMECs)调控神经元功能的机制。方法:通络救脑注射液(Tongluo Jiunao Injection,TLJNI)作用于正常、缺血和缺血再灌三种培养状态的大鼠CMECs,分别收集有药物干预及无干预的三对无血清内皮细胞条件培养液,并测定其LDH值。同步原代培养大鼠脑皮质神经元,亦分为正常、缺血、缺血再灌三组,用低(10%)、中(50%)、高(100%)三种浓度的各类CMECs-CM分别作用上述三种培养状态的神经元,测定其LDH漏出率。结果:比较TLJNI干预后的CMECs-CM与无干预的CMECs-CM中LDH漏出值,CMECs缺血组与缺血再灌组经药物干预后均明显降低(P<0.01)。对于缺血神经元,缺血内皮细胞条件培养液(conditioned medium of ischemic CMECs,Is-CM)高浓度(100%)和TLJNI干预后的缺血内皮细胞条件培养液(conditioned medium of ischemic CMECs with drug treatment,IsT-CM)高浓度(100%)作用后表现为增加LDH漏出率(P<0.01),而低浓度10%的IsT-CM则降低LDH漏出率(P<0.05);对于缺血再灌神经元,与对照组比较,各类CMECs-CM作用后均能降低神经元LDH漏出率(P<0.05或P<0.01)。比较每种条件液相邻浓度间的效应差异,均以10%或50%的CM降低损伤为佳,正常内皮细胞条件培养液(conditioned medium of normal CMECs,N-CM)及缺血再灌内皮细胞条件培养液(conditioned medium of ischemic/reperfusional CMECs,Rp-CM)组间差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);对于正常神经元,各类CMECs-CM作用后均增加了神经元LDH漏出率(P<0.05或P<0.01)。比较每种条件液相邻浓度间的效应差异,N-CM组间差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:TLJNI能够防御CMECs缺血及缺血再灌的损伤,可以通过内皮细胞介导发挥抗缺血及缺血再灌神经元损伤的效应。提示CMECs-CM及TLJNI干预后的CMECs-CM均存在着抗缺血再灌神经元损伤的活性物质。     

天麻素对缺血再灌注神经细胞膜的保护作用

用新生Wistar大鼠大脑皮层进行神经细胞培养 ,将培养 8d的神经细胞置于模拟“缺血”状态下 ,5h后神经细胞发生肿胀 ,胞内乳酸脱氢酶 (LDH)漏出增加 ,膜流动性下降、脂质过氧化(LPO)含量增加 ;将经过“缺血”损伤神经细胞置 1 8h模拟“再灌注” ,“再灌注”后细胞数目明显减少 ,LDH的漏出、膜流动性下降和LPO增加继续加重 ,说明细胞损伤进一步加重。经过天麻素孵育后的神经细胞“缺血”或“再灌注”后LDH的漏出及LPO含量明显低于损伤组 ,而膜流动性则明显高于损伤组。表明 :天麻素对体外培养神经细胞的缺血再灌注损伤有保护作用