人子宫内膜细胞原代体外培养方法

目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立,并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学染色法对间质细胞(endometrial stromal cell,ESC)及上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞。EEC和ESC经角蛋白单抗体和波形蛋白单抗体染色,凡是胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论成功培养了原代人子宫内膜细胞,方法经济、简单,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

原代人子宫内膜细胞分离及培养鉴定

目的：探究原代人子宫内膜细胞分离及培养的简易方法,并对其纯度及生物活性进行鉴定。方法采用胶原酶消化人子宫内膜组织,经2次筛网过滤、离心及贴壁纯化技术,分离、纯化培养人子宫内膜间质细胞（ESC ）和腺上皮细胞（EEC ）,用细胞角蛋白（cytokeratin）和波形蛋白（vimentin）免疫细胞化学染色法和免疫荧光方法对所分离的细胞进行鉴定。结果 ESC呈平行生长,细胞呈梭形或多角形,波形蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度达95％以上。EEC呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,细胞角蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度可达90％。结论应用胶原酶消化法及二次筛网过滤法成功分离并培养数量、活力和纯度高的子宫内膜细胞,可操作性强,可供具备基本细胞培养条件的实验室进行推广。     

小鼠子宫内膜基质细胞分离培养及鉴定

目的寻求一种简便有效的早孕小鼠子宫内膜基质细胞的培养方法。方法采用胰蛋白酶消化与机械振荡相结合分离小鼠子宫内膜基质细胞,接种后通过光镜观察其形态学特征,并采用免疫细胞化学进行细胞鉴定。结果接种24h后大部分细胞已贴壁,培养3d后细胞排列紧密、形态为长梭形。经过免疫细胞化学鉴定,成功获得了小鼠子宫内膜基质细胞。结论胰蛋白酶消化与机械振荡相结合可成功分离并原代培养小鼠子宫内膜基质细胞。     

人子宫内膜间质细胞原代培养及生物学行为的研究

目的探讨人子宫内膜间质细胞原代培养方法,并比较子宫内膜异位症(EMS)异位内膜间质细胞与正常子宫内膜间质细胞形态及生物学行为的差异,为EMS细胞模型的建立提供可靠依据。方法采用改良人子宫内膜间质细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜下观察细胞形态差异,采用CCK8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况。结果正常子宫内膜间质细胞及EMS异位子宫内膜间质细胞分离培养成功率分别为93.33%、86.67%。两种间质细胞在生长速度、形态及生物学行为方面均具有明显差异。子宫内膜异位症异位内膜间质细胞(ESC)比正常子宫内膜间质细胞(NSC)增殖旺盛,增殖48 h、72 h时ESC的细胞相对增殖率明显高于NSC,差异均有统计学意义(P48h0.001;P72h0.001)。24 h、48 h、96 h的NSC凋亡率明显高于ESC,差异均有统计学意义(P0.001)。72 h时,NSC、ESC凋亡率比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论采用改良原代培养方法,可以明显提高人子宫内膜间质细胞培养成功率。体外细胞模型中异位内膜间质细胞的生长特性与子宫内膜异位症的疾病特点是一致的,可以成为疾病细胞机制研究的理想模型。     

一种简便有效的小鼠子宫内膜细胞原代培养方法

由于小鼠子宫内膜细胞尚未成功建系。所以其原代培养为建立理想的小鼠胚胎着床体外模型奠定基础。本实验采用子宫内膜上皮细胞和基质细胞共同培养,通过改进方法,克服污染．提高了子宫内膜细胞的成活率。     

着床窗口小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养及形态学观察

目的探索着床窗口小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养方法，并对培养细胞进行形态学检测。方法取着床窗口(妊娠d4)小鼠双侧子宫角，用胰蛋白酶消化和机械削刮法相结合分离上皮细胞，经高密度接种及添加EGF培养后，通过光镜和透射电镜观察其形态学特征。结果接种24h后大部分细胞已贴壁，培养4d后细胞排列紧密、长成上皮细胞集落，电镜显示细胞为分泌上皮细胞，细胞纯化率在90％以上。结论采用上述方法可成功地分离、原代培养着床窗口小鼠子宫内膜上皮细胞。     

小鼠MK基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的死亡受体(Mouse killer,MK)基因干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒并在小鼠子宫基质细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MK的siRNA干扰序列,将其克隆到穿梭载体psES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MKsiRNA,在HEK293细胞中包装并扩增腺病毒颗粒.用纯化后的腺病毒混合液感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞,RT-PCR及Western Blot检测基质细胞中MK的mRNA及蛋白表达水平.结果:Adeasy-SES-HUS-MKsiRNA混合液均效价为6.8 X 10~(11)pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞48h后,MK的mRNA及蛋白水平均显著下调.结论:构建的MK干扰表达腺病毒能有效地抑制MK基因的表达,为进一步研究MK在小鼠子宫基质细胞的功能提供了有效的工具.     

TACE在着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞中的表达及其抗体对胚泡粘附的影响

目的:通过检测肿瘤坏死因子α转换酶(Tumor necrosis factor α convening enzyme,TACE)在小鼠子宫内膜上皮细胞中的表达及其在体外着床模型中对胚泡粘附的影响,初步探讨TACE在小鼠生殖中的作用以及其与胚胎着床的关系.方法:体外培养孕4d(d4)小鼠子宫内膜上皮细胞和胚泡,构建胚泡体外着床模型;通过细胞免疫组化鉴定小鼠子宫内膜上皮细胞;运用RT-PCR和细胞免疫组化分别检测小鼠子宫内膜上皮细胞中TACE mRNA和蛋白的表达;向体外着床模型中添加不同浓度的TACE抗体,观察对胚泡体外着床的影响,并用细胞免疫化学检测抗体干预后各培养体系中TACE蛋白质的表达情况.结果:原代培养小鼠子宫内膜上皮细胞生长旺盛,鉴定结果显示:上皮细胞对角蛋白抗体有棕黄色阳性表达,对波形蛋白抗体为阴性表达.PCR结果显示TACE mRNA在共培养体系中有高表达,免疫组化结果与RT-PCR结果相一致;小鼠胚泡体外共培养具有较高的粘附率,添加TACE抗体后胚泡帖附率均显著低于对照组帖附率(P<0.05),且随着抗体浓度的降低胚泡粘附率随之升高,免疫化学检测结果也显示随着抗体浓度的降低TACE的表达量随之升高.结论:TACE可能参与了胚泡着床过程,有利于小鼠胚胎粘附、扩展,为胚胎的着床做准备.     

人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及形态学观察

目的:探讨子宫内膜异位症(endometriosis,EM)异位子宫内膜细胞原代培养方法,并比较EM在位及异位子宫内膜细胞与正常对照在位子宫内膜细胞形态的差异。方法:采用改良EM细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜及电子显微镜下观察细胞形态差异。结果:正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率分别为91.67%、93.75%和75.00%。EM异位、在位子宫内膜腺上皮细胞与正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似,但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多,核增大。EM异位子宫内膜间质细胞较EM在位及正常在位子宫内膜间质细胞小,且细胞膜表面有较多的微绒毛和胞浆突起。结论:注意取材方式,采用改良原代培养方法,可以提高EM异位子宫内膜细胞培养成功率。EM异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞超微结构与正常妇女及EM在位子宫内膜细胞有显著不同。     

人子宫内膜细胞原代培养方法的改良

目的 寻求一种简便高效的人子宫内膜上皮细胞和间质细胞分离、纯化与鉴定方法,建立稳定的子宫内膜细胞体外培养体系.方法 简化Ryan等的子宫内膜细胞原代培养方法的取材,分离和培养条件,分离出高纯度的子宫内膜上皮细胞和间质细胞进行体外培养和传代.结果 培养成功的子宫内膜上皮细胞与间质细胞均可稳定传代,体外生长10～50 d,纯度均达90%以上.结论 该方法简便高效,可建立稳定的人子宫内膜细胞体外培养体系.     

人子宫内膜腺上皮细胞原代培养方法的改进

目的改进子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法,以使其可作为功能失调性子宫出血(功血,Dysfunctional Uterine Bleeding,DUB)的体外实验模型之一.方法在取材、培养条件和细胞纯化等方面对子宫内膜腺上皮细胞原代培养的方法作了改进.结果34份标本,23份获得成功.培养时间为4～22d,无1例发生污染.接种后的5～6d为进行实验的最佳时间.结论改进后的子宫内膜腺上皮细胞原代培养法克服了污染问题,增加了可获得的细胞数.子宫内膜腺上皮细胞的分离、培养可作为功血的体外实验模型之一.     

子宫腺肌病原代内膜间质细胞培养及功能学鉴定

目的分离提纯培养子宫腺肌病(AM)内膜间质细胞(ESc),检测其细胞功能的差异,为进一步的细胞及分子水平研究奠定基础。方法选取2013年1月至2016年12月份在本院治疗的正常子宫内膜和子宫腺肌病手术病例,在严格无菌条件下,收集临床确诊的AM患者在位子宫内膜组织12例、异位子宫内膜组织41例及正常对照内膜组织13例,分别分离培养ESc,并通过免疫组织化学法对分离提纯培养的细胞进行鉴定。分别检测三种细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等细胞功能。结果正常人ESc 13例,AM患者在位12例、异位ESc原代分离41例均成功,成功率为100.00%。与正常在位ESc相比,在位、异位ESc在普通光镜下,形态观察无明显差异,但是细胞功能方面,在位ESc生长曲线显示增殖率明显升高;异位ESc的迁移、侵袭率水平升高,差异有统计学意义(P0.01),三种细胞凋亡无明显差异。结论采用间质细胞原代培养方法可以成功培养AM ESc,并保持较高的细胞培养成功率。在位ESc增殖率最高,异位ESc的迁移、侵袭率水平升高,细胞凋亡均无明显差异。     

人牙龈成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的：分离培养人牙龈成纤维细胞,为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。方法：用组织块法培养人牙龈成纤维细胞,并进行形态学和免疫学鉴定。结果：牙龈成纤维细胞原代培养成功并稳定传代,细胞呈长梭形或星形,免疫学鉴定抗波形丝蛋白抗体阳性,抗角蛋白抗体阴性,为中胚层来源的成纤维细胞。结论：组织块法培养的细胞符合牙龈成纤维细胞的形态学和免疫学特征,可作为体外细胞模型,为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定基础。     

乳小鼠心肌细胞体外培养方法的优化

目的探讨乳小鼠心肌细胞分离和体外培养的方法,并结合实际情况建立一种优化的体外培养乳小鼠心肌细胞的方法。方法胰酶-Ⅱ型胶原酶混合液分次消化乳小鼠心肌组织后行差速贴壁法达到心肌细胞纯化目的,并利用心肌细胞特意表达a-肌动蛋白的特性运用细胞免疫组织化学方法鉴定心肌细胞。结果差速贴壁48h后心肌细胞贴壁完全,并见大部分贴壁细胞出现搏动,但未观察到同簇搏动,经a-肌动蛋白细胞免疫组织化学鉴定,心肌细胞纯度达96.7%。结论本研究优化了原代乳小鼠心肌细胞分离和体外培养方法,为后续细胞实验打下了基础。     

机械分离并培养螺旋神经节神经元方法的建立

目的　建立机械分离并培养小鼠耳蜗螺旋神经节神经元 (SGN )细胞模型的方法。方法　对出生后1～ 6 d的小鼠耳蜗螺旋神经节组织进行机械分离和培养 ,用倒置相差显微镜对原代培养的 SGN细胞的形态学和轴突生长情况进行观察 ,并应用荧光显微镜对 SGN进行免疫细胞化学染色鉴定。结果　新生小鼠 SGN在机械分离、体外培养条件下 ,可以获得良好的细胞形态和轴突再生能力 ,其存活细胞的数量为 (78.10± 4 .33) / cm2 (5～ 7d) ,生长周期为 7～ 14 d。结论　成功建立了机械分离并培养 SGN细胞模型的方法 ,SGN存活细胞的数量和周期可以满足体外多种实验的需要。     

胎儿心肌细胞培养方法的建立

目的：建立胎儿心肌细胞原代培养和传代培养的方法。方法：用2g／L胰蛋白酶(trypsin)和1g／L胶原酶(collagenase)进行消化，用差速粘附贴壁法纯化心肌细胞，用IMDM(Iscove改良的Dulbecco medium)培养液培养，于倒置显微镜下观察，用锥虫蓝(trypan blue)染色法做心肌细胞质量评价。心肌细胞进行actin免疫组化、myoglobin荧光免疫组化和电镜分析。结果：心肌细胞存活率为99％，24h后见有95％细胞贴壁，心肌细胞达95％，形态为圆形、梭形、椭圆形、棒状、星状及分叉状等；actin和myoglobin荧光免疫组化强阳性，电镜见心肌细胞结构存在；原代培养第20天和传代培养第5天心肌细胞生长良好。结论：本方法可很好地用于胎儿心肌细胞原代培养和传代培养，为进一步建立心肌病理模型打好基础。     

人卵巢上皮癌细胞原代培养及细胞系BUPH:OVSC-1的建立

目的:为人卵巢上皮癌的研究提供更多体外研究模型,确立卵巢上皮癌原代培养的条件,建立细胞系.方法: 将25例卵巢上皮癌手术切除的肿瘤组织或腹水标本进行体外培养,比较不同组织培养方法的效果.对所建卵巢癌细胞系的形态学、染色体核型、生长增殖及裸鼠种植情况进行观察.结果: 建立一套人卵巢上皮癌原代培养方法,使其体外培养传代数扩展至10～15代.经原代培养得到一株人卵巢癌细胞系BUPH:OVSC-1,其形态学、染色体核型分析、接种致瘤性的观察结果表明,该细胞系符合人体恶性细胞特征.裸鼠种植瘤病理切片该细胞呈肉瘤样细胞形态,电镜及角蛋白免疫组化证实其为上皮起源.结论:应用改良的卵巢上皮癌原代培养方法能改善细胞的体外生存期.BUPH:OVSC-1是一株特殊的人卵巢癌细胞系,符合人卵巢肉瘤样癌细胞系的特征,可作为卵巢肉瘤样癌研究的实验模型.     

高纯度子宫内膜腺上皮细胞的体外分离和培养

目的:在体外建立子宫内膜腺上皮细胞原代分离和培养的方法,以获得高纯度子宫内膜腺上皮细胞。方法:选择正常子宫内膜组织,通过消化、过滤、选择性贴壁和二次消化等技术进行体外培养。结果:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法成功实现子宫内膜腺上皮细胞的高纯度分离和原代培养。结论:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。