不同敏感性鼻咽癌细胞株中Ku蛋白表达情况比较

目的　比较作为DNA双链断裂修复蛋白DNA依赖性蛋白激酶 (DNA PK)的调节亚基70 Ku、80 Ku在不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中的表达情况。方法　成克隆实验测定鼻咽癌高分化鳞癌细胞CNE1和低分化鳞癌细胞CNE2不同剂量照射后的存活分数 ,用线性二次模型拟合剂量存活曲线并求出放射生物学参数α、β、SF2、MID以评价两株细胞的放射敏感性。Westernblot检测照射前和后不同时间及不同剂量CNE1、CNE2细胞中Ku的表达 ,检测蛋白条带的吸光度值做半定量分析。结果　CNE1在各个剂量点的存活分数均比CNE2高 ,MID也大于CNE2 (2 .35∶1.11) ,SF2也大于CNE1(0 .5 4∶0 .37)。Westernblot显示两株细胞中70 Ku、80 Ku均有表达 ,蛋白条带的吸光度值测定显示70 Ku在CNE1、CNE2细胞中分别为 2 0 .0 3± 7.5 6和 19.36± 6 .0 4 ,80 Ku分别为 2 5 .98± 12 .87和 2 3.74±9.2 4 (P值均 >0 .0 5 )。蛋白表达的定量和定性分析同样显示 4Gy照射后不同时间点及 0～ 16Gy照射后 12hKu的表达无统计学差异。结论　实验验证了CNE2比CNE1对放射更敏感 ;照射前后两个细胞均有70 Ku、80 Ku蛋白表达且无差异 ;CNE1、CNE2放射敏感性的差异与Ku蛋白表达量无明显关系。     

X线照射对不同放射敏感性鼻咽癌细胞中ATM mRNA表达的影响

[目的]研究X线照射对鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中ATM mRNA表达水平的影响。[方法]采用逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）技术．以β-actin为内参照,测定10GyX线照射前后CNE1、CNE2中ATM mRNA表达水平的变化：[结果]在X线照射前,CNE1中ATM mRNA基础水平与CNE2相似：存X线照射后,CNE1中ATM mRNA水平在照射4h后明显升高。12h后恢复：CNE2中ATM mRNA水平在照射后12h内无显著变化．[结论]在具有不同放射敏感性的鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中．ATM mRNA表达的基础水平相似,在经X射线处理后,CNE1和CNE2中ATM mRNA水平变化规律不同。这种ATM mRNA表达差异可能是导致两者放射敏感性不同的原因之一．     

不同放射敏感性的鼻咽癌细胞中ATM/PI3 K区基因突变的研究

目的：探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞（CNE1、CNE2）中ATM／PI3K区基因突变的情况。方法：采用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术和荧光标记的双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP)循环测序方法，对不同放射敏感性的鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2中ATM／PI3K关键区域进行突变检测。结果：所测CNE1、CNE2中的ATM／PI3K区序列中没有发生突变。结论：鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2内在放射敏感性的差异可能由ATM／PI3K区基因突变以外的因素所决定。     

抑制ATM/PI3K功能区表达对鼻咽癌细胞CNE1辐射增敏的研究

背景与目的:共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasiamutant,ATM)与细胞辐射敏感性密切相关,已有报道,ATM蛋白(ATM基因编码产物)表达抑制可引起多种恶性肿瘤细胞辐射敏感性的改变。本研究观察ATM/PI3K区反义RNA对鼻咽癌细胞系CNE1ATM蛋白的抑制作用及辐射增敏作用。方法:构建含反义ATM/PI3K区序列逆转录病毒重组体pDOR-atm,经阳离子脂质体转染入CNE1细胞,并命名为CNE1/pDOR-atm。应用半定量RT-PCR法分析反义组和对照组细胞中ATMmRNA的水平,应用流式细胞仪检测表达ATM蛋白的阳性细胞百分率及平均荧光强度,应用集落形成实验及线性二次模型(linear-quadraticmodel,L-Q模型)检测细胞辐射敏感性的变化。结果:在反义组细胞CNE1/pDOR-atm中ATMmRNA指数(mRNAindex,RI)平均为0.23±0.02,在对照组细胞CNE1/pDOR中RI平均为0.51±0.03(P<0.05)。在反义组中ATM蛋白阳性细胞百分率平均为70.8%,ATM蛋白平均荧光强度为1.81±0.12;而对照组中分别为99.3%,4.51±0.18(P<0.01),提示反义组细胞中ATMmRNA水平及蛋白表达抑制。反义组细胞α值为0.40Gy-1,对照组为0.36Gy-1,2Gy辐射增敏比达3.0,提示反义组细胞辐射敏感性增加。结论:抑制CNE1细胞的ATM/PI3K区表达可以达到有效的辐射增敏目的。     

趋化因子受体CXCR4在鼻咽癌细胞中的表达

背景与目的:研究表明,趋化因子受体CXCR4及其配体SDF-1(stromalcell-derivedfactor1)与肿瘤的增殖、分化和转移等恶性表现密切相关。本研究通过观察分化程度和增殖能力不同的鼻咽癌细胞中CXCR4的表达,初步了解CXCR4与鼻咽癌细胞恶性表现的关系。方法:分别以全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,RA)和端粒酶反义核酸处理鼻咽癌CNE1(高分化)和CNE2Z(低分化)细胞,原位杂交技术检测CXCR4mRNA表达,免疫组化法检测CXCR4蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,MTT法检测细胞增殖能力。结果:CXCR4mRNA和CXCR4蛋白在鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞均呈强阳性表达,且CNE2Z细胞表达强度显著高于CNE1细胞。经1×10-5mol/L和1×10-4mol/LRA作用后,与对照组比较,CNE1细胞G1期细胞明显增多,CNE2Z细胞S期细胞明显增多,同时两者的CXCR4mRNA表达水平均显著低于对照组(P<0.01),其中1×10-4mol/LRA作用较1×10-5mol/LRA作用强(P<0.01)。经端粒酶反义核酸作用后,CNE1和CNE2Z细胞增殖均明显受抑制,CXCR4蛋白表达水平均显著低于对照组(P<0.01)。结论:CXCR4在鼻咽癌细胞高表达,其表达水平与鼻咽癌细胞的分化程度和增殖能力有关。     

宫颈癌ATM的表达与放射敏感性的关系

目的:探讨宫颈癌组织中ATM(毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白,ataxia telangiectasia mutated)表达与放射敏感性的关系。方法:选择13例对放射耐受的宫颈癌患者作为实验组,同时选择34例对放射敏感的宫颈癌患者作为对照。采用免疫组织化学染色方法,对两组患者放疗前癌组织进行ATM蛋白检测。结果:癌组织ATM蛋白的表达在敏感组和耐受组分别为50.0%(17/34)和84.6%(11/13),耐受组明显高于敏感组(P=0.046)。结论:宫颈癌组织中ATM蛋白的高表达可导致肿瘤对辐射的耐受,ATM的表达状态可能作为预测宫颈癌放射敏感性的一项指标。     

干扰素α-2a对人鼻咽癌细胞株CNE-I放射敏感性的影响

目的探讨干扰素α2a对人鼻咽癌细胞株CNEI放射敏感性及其细胞周期的影响。方法用不同浓度的干扰素α2a处理CNEI细胞后用6MVX线照射,计算细胞存活率。流式细胞仪分析CNEI细胞周期动力学改变。结果0.5×106、1.0×106、1.5×106IU/L干扰素α2a干预CNEI细胞后细胞存活分数分别为0.62、0.43、0.20,放射增敏比为1.16、1.57、1.93;1×106IU/L干扰素α2a干预CNEI细胞24h后,与对照组比较细胞增殖周期G1和G2+M细胞数增多,S期细胞数减少(P<0.01)。结论干扰素α2a能抑制人鼻咽癌细胞株CNEI的生长,并具有放射增敏效应,放射增敏机制可能与其调节CNEI细胞增殖周期有关。     

ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究

目的 通过对ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究，为下一步研究打下基础。方法利用细胞集落形成实验研究肺癌细胞株A549、NCI—H446的放射敏感性差异，并结合免疫荧光实验和激光共聚焦扫描（LSCM）技术来探讨两细胞株中ATM蛋白的表达差异与放射敏感性之间的关系。结果集落形成实验中，在接受2、4、6、8Gy剂量照射时，A549和NCI—H446两肺癌细胞株的存活分数分别为81．0％、32．4％、12．0％、3．5％和52．4％、17．0％、3．2％、0．7％。ATM蛋白定位于细胞浆和胞核；利用LSCM分析两细胞株中ATM蛋白的表达差异，A549细胞ATM蛋白荧光强度（71．188＋13．379）较NCI-H446细胞（47．478±19．032）明显增强（P〈0．0001），有统计学意义。结论两肺癌细胞株A549和NCI-H446具有放射敏感性差异，ATM蛋白在两细胞株中的表达亦有差异显著性，表明其表达量可能与放射敏感性呈负相关。     

DSB修复蛋白ATM DNA-PKcs与肿瘤放射敏感性关系的研究进展

放射线主要通过导致细胞DNA双链断裂(DSB)而起到杀死肿瘤细胞的作用,但细胞都有不同程度的DSB修复能力,研究证实DSB 修复水平与细胞放射敏感性关系密切.在人类细胞内有2 种DSB 修复途径:一种是以DNA 依赖蛋白激酶(DNA-PK)复合物为主的非同源末端连接(NHEJ)修复,另一种是以毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ATM)为主的同源重组(HR)修复.在人体内,NHEJ修复是最主要的修复途径,DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)是DNA-PK复合物的主要功能单位.DNA-PKcs的激酶活性是NHEJ修复所必须的,其在DSB修复中起核心作用.近年来的研究显示ATM、DNA-PKcs蛋白表达水平与肿瘤放射敏感性有关.该综述将有关ATM、DNA-PKcs的功能、在肿瘤组织中的表达及与肿瘤放射敏感性关系的研究进行简要回顾.     

DNA-PKcs、Ku80及ATM备选宫颈癌放疗增敏靶点的体外研究

背景与目的:DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)是细胞受辐射后最致命的损伤,而DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、Ku80和ATM(ataxia-telangiectasia mutated)为DSB的主要修复蛋白.宫颈癌是以放疗为主要治疗手段的肿瘤.但其肿瘤细胞对放射线的敏感性不同.本实验拟研究3种DSB修复蛋白的表达与宫颈癌细胞放射敏感性的关系.并探讨DSB修复蛋白成为宫颈癌放疗增敏靶点的可能性.方法:免疫组化法检测41例宫颈癌患者组织中DNA-PKcs、Ku80和ATM蛋白的表达情况;Western blot检测8株肿瘤细胞(包括4株宫颈癌细胞)中3种蛋白的表达,克隆形成实验检测SF2 (suivival fraction at 2 Gv)、α值,分析蛋白表达水平和SF2、α值的关系;利用靶向抑制DNA-PKcs的shRNA表达质粒和小分子抑制剂LY294002,分别抑制HeLa细胞DNA-PKcs蛋白表达和活性后,克隆形成实验和流式细胞仪检测HeLa细胞受6 MVX线照射后的SF2、α值和凋亡率变化.结果:在41例宫颈癌组织中,Ku80、DNA-PKcs和ATM的阳性率分别为70.73%、68.29%和19.51%:8株肿瘤细胞中Ku80、DNA.PKcs和ATM蛋白的相对表达量与各细胞SF2、α值各不相同,作Pearson线性相关分析后得出DNA-PKcs的表达水平与SF2之间有明显的正相关关系(r=0.72,P=0.04);靶向抑制DNA-PKcs的shRNA可以促进HeLa细胞的放射敏感性,其SF2值为0.37,显著低于对照HeLa细胞的0.53(P＜0.05);单独接受50 μmol/L LY294002作用1 h HeIa细胞的凋亡率未见明显增加,但先经LY294002处理再照射6 Gy的HeLa细胞在48 h和72 h的凋亡率比单独照射6 Gy的HeLa细胞凋亡率显著增加(48 h点:t=3.25,P=0.03;72h点:t=3.01,P=0.04).结论:DNA-PKcs在宫颈癌组织中表达较高,且其表达水平可以预示肿瘤细胞的放射敏感性:抑制DNA-PKcs的表达或活性可以促进HeLa细胞的放射敏感性.     

抑制ATM表达致鼻咽癌细胞CNE1辐射增敏的细胞周期阻滞研究

背景与目的:细胞周期调控是决定细胞辐射敏感性的决定性因素之一。共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant,ATM)功能与细胞DNA损伤修复、细胞周期检查点调控密切相关。我们前期研究通过反义RNA抑制ATM基因表达可增加鼻咽癌细胞系CNE1辐射敏感性,本研究拟探讨其辐射增敏的细胞周期阻滞调控机制。方法:ATM反义组细胞CNE1/pDOR-atm及对照组细胞CNE1/pDOR经2Gy、5GyX线照射后不同时间点(1h、4h、8h、24h、48h)收获,应用流式细胞仪(flowcytometer,FCM)检测各细胞周期百分比及凋亡率。结果:两组细胞X线照射后均未出现明显G1期阻滞和细胞凋亡,但分别在照射后1h、4h、8h出现明显S期阻滞,24h、48h出现明显G2期阻滞,其中反义组S期细胞百分率总均数水平低于对照组(P<0.05),而G2/M期细胞百分率总均数水平高于对照组(P<0.05)。结论:反义RNA抑制ATM表达致CNE1辐射增敏的细胞周期调控机制可能与减少S期细胞比例,增加G2/M期细胞比例有关,与G1期阻滞和细胞凋亡的调控无关。     

EXPRESSION AND SUBCELLULAR LOCALIZATION OF DNA-PK IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELL LINES CNE1 AND CNE2 WITH DIFFERENT RADIOSENSITIVITY

Exploring mechanism of radioresistance and searching for some suitable radiosensitized approaches isone of the ways to improve the curative rate of nasopharyngeal carcinoma. As we know, radiosensitivity is highly correlated with the number of DNA double strand breaks (DSBs) and the extent of it’s repair[1], and the ability of DSBs repair is one of the important factors influencing radiosensitivity. In mammalian cells, the nonhomologous end joining (NHEJ) is the predominan pathway of DSB…     

EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响

背景与目的:已证实EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)编码的潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP1)能够诱导鼻咽癌细胞中基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)的表达。本实验的目的是观察EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响,探讨LMP1在鼻咽癌侵袭、转移过程中的作用。方法:用免疫组化法及Westernblot法检测CNE1-GL(转染LMP1基因的CNE1细胞)和CNE1细胞中MMP-9的表达情况;用细胞-基质粘附实验、细胞运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测LMP1对CNE1细胞粘附、运动及侵袭能力的影响。结果:免疫组化法及Westernblot法结果均显示CNE1-GL细胞中MMP-9的表达明显高于CNE1细胞(P<0.05);肿瘤细胞-基质粘附实验结果显示,CNE1-GL的粘附能力(平均吸光度值为1.2508±0.0711),高于CNE1细胞(平均吸光度值为0.9519±0.068),两者相比差异有显著性(P<0.01)。运动实验及重组基底膜侵袭实验结果均显示,穿过游离的聚乙烯吡咯烷酮膜(polyvinylpyrroli-done-free,PVP-F)的CNE1-GL细胞数明显高于CNE1细胞(P<0.01)。结论:LMP1能够诱导CNE1细胞中MMP-9的表达,且增强CNE1细胞与基底膜的粘附能力、运动能力及侵袭能力。     

EBV-LMP1上调Ezrin表达对鼻咽癌细胞转移潜能的影响

背景与目的:细胞骨架相关蛋白Ezrin的异常表达与肿瘤侵袭转移密切相关,既往研究已证实EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein1,EBV-LMP1)可促进鼻咽癌细胞的转移能力。本研究旨在进一步探讨EBV-LMP1是否通过改变Ezrin的表达来影响鼻咽癌细胞的转移能力。方法:采用免疫细胞化学和Western blot检测两种鼻咽癌细胞株-CNE1细胞(EBV阴性)和CNE1-GL细胞(稳定转染EBV-LMP1)中LMP1和Ezrin的表达;细胞-基质粘附实验检测CNE1、CNE1-GL和经Ezrin抗体预处理的CNE1-GL细胞(AntiEzrin-CNE1-GL)对细胞外基质的粘附力;Transwell小室法检测上述3种细胞的运动和对重组基底膜侵袭能力。结果:CNE1细胞中Ezrin阴性表达,而CNE1-GL细胞中Ezrin强阳性表达。CNE1-GL细胞对细胞外基质的粘附率[(89.38±6.12)%]强于CNE1细胞[(49.42±5.37)%](P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞对基质的粘附率[(56.94±4.08)%]明显下降,与CNE1-GL相比,差异有统计学意义(P<0.05)。运动实验和侵袭实验均提示CNE1-GL细胞运动、侵袭能力(107±11和179±25)强于CNE1细胞(27±3和46±6),差异均有统计学意义(P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞的运动、侵袭能力(38±4和51±5)较CNE1-GL细胞显均显著下降(P<0.001)。结论:CNE1细胞中EBV-LMP1可通过上调Ezrin表达来促进细胞转移。     

p16基因转染对CNE-2细胞放射敏感性的研究

目的 探讨外源性p１６基因转染人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ－２后对其放射敏感性的影响。方 法 通过体介导的基因转染方法将野生型p１６基因、空载全分别该基因突变的ＣＮＥ－２ 细胞中,同时设置不加任何质粒的ＣＮＥ－２细胞作为对照。３组细胞在相同的实验条件下,分别接受０,２,４,６,８Ｇｙ照射,经培养后计算细胞贴壁率再换算成存活率,按照多击单靶模型进行数学拟合,获存活曲线,求出Ｄo植等参数;利用流式细胞仪（ＦＣＭ）