正交设计优化半夏相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系

目的 采用正交设计优化半夏SRAP - PCR的反应体系.方法 以半夏基因组DNA为模板,应用L16 (45)正交表,研究了Taq酶、Mg2+、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种SRAP反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果 优化反应体系为:25μL反应体系中含有buffer2.5μL、Taq酶1.0U、Mg2+2...     

家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化

目的:建立和优化家蝇的相关序列扩增多态性(SRAP-PCR)扩增体系.方法:以驯养家蝇为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对家蝇SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化.结果:优化后的反应体系总体积为30 μl,含50 ng模板DNA、1.5mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、0.15 μmol/L引物和0.50 U Taq DNA聚合酶.结论:家蝇SRAP-PCR扩增优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行家蝇遗传多样性分析、基因定位奠定了基础.     

大黄ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法对影响大黄ISSR-PCR反应体系的重要因素(Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、DNA模板)进行优化,通过统计软件分析和直观分析获得最佳的反应体系:DNA模板30 ng,2.5 μL 10×Taq Buffer,dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.25 μmol/L、Mg2+ 2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶1.25 U.     

金钗石斛遗传多样性研究的ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的：对影响金钗石斛ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法：通过筛选引物并设定影响金钗石斛ISSR反应诸因子的不同浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立金钗石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果：金钗石斛较适宜的ISSR-PCR反应条件为：10 lμPCR反应体系,含5～15 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg^2＋、0.20 mmol/L dNTP、0.6～0.75 U Taq DNA聚合酶、1.0μmol/L引物。较适宜的退火温度为46～62℃。结论：Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的金钗石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于金钗石斛的遗传多样性研究。     

金钗石斛及其相似种RAPD优化和DNA多态性分析

目的:以金钗石斛为材料,建立石斛的RAPD优化条件,应用于石斛相似种的DNA多态性分析.方法:分别设置模板DNA,Mg2 ,Taq DNA聚合酶,dNTPs,引物的浓度梯度,优化RAPD反应体系.结果:在25 μl总反应体系中,以上反应物的用量分别为100 ng,3.0 mmol/L,1.0 U,0.2 mmol/L,0.4 μmol/L时所获得的石斛属DNA指纹图谱谱带型清晰、重复性好.其中用S48 扩增的DNA指纹图谱具有更大的相似性,适合于石斛真伪鉴别;而S90 扩增的片段具有明显的多态性,适合于石斛遗传分化研究.结论:优化后的RAPD方法可作为研究石斛属植物的遗传多样性及真伪鉴别的有效方法.     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨夏枯草种质间遗传多样性奠定基础。方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、 Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响。结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为：在20 μL的反应体系中含模板DNA 30 ng,Mg2+2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75 μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U。在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析。     

蠕形螨ISSR-PCR的反应体系优化及引物筛选

目的以蠕形螨的DNA为模板,对蠕形螨简单重复序列锚定PCR(ISSR-PCR)反应体系优化并对ISSR引物进行筛选,为ISSR分析奠定基础。方法用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用基因组DNA提取试剂盒提取山羊蠕形螨DNA,并以此为模板,以(CA)8RG(R为1分子的嘧啶)为引物,利用正交实验法,从Mg2+浓度、引物用量、dNTPs、DNA模板用量和TaqDNA聚合酶以及退火温度对蠕形螨ISSR-PCR反应体系进行优化,并以优化的反应体系筛选ISSR-PCR的引物。结果 ISSR-PCR 25μL最佳反应体系包括:0.4 mmol/L Mg2+、30 pmol引物、30～60 ng模板DNA、2u Taq酶,最佳退火温度为49℃、循环35次。筛选出10条条带清晰、多态性好、重复性高的引物。结论筛选出蠕形螨ISSR-PCR最佳反应体系和理想的引物,为蠕形螨的分子生物学研究奠定了基础。     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系。方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素（Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度）进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测。结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系（20 μL）为：Mg²⁺ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8 ℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析。     

天麻简单重复序列反应体系的初步研究

目的: 探讨兰科药用植物天麻(Gastrodia elata Bl.)简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)PCR循环中退火温度及反应体系中各主要成分对反应的影响.方法: 根据Genebank登录的天麻微卫星序列设计引物, 并对反应体系中各影响因素进行优化.结果: 所设计引物可扩增出预期的条带,并构建了清晰稳定的SSR指纹图谱,最终建立的25 μl反应体系为:Taq DNA酶1U、Mg2 1.2～1.6 mmol/L、引物各0.4～0.6 μmol/L、模板DNA 40～60 mg/L和dNTPs 0.20 mmol/L.结论: 首次初步确立了适合天麻SSR的最佳退火温度及反应体系中各主要成分的最佳浓度,为天麻的SSR分子标记及遗传多态性分析奠定了一定基础.     

白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的：建立并优化白芨ISSR-PCR反应体系,为白芨种质资源分子评价奠定技术基础.方法：应用单因素和正交试验研究ISSR-PCR反应体系中模板DNA、Mg2、引物、dNTP、BSA及Taq DNA聚合酶等6个主要成分对扩增结果的影响,优化出ISSR-PCR最佳反应体系.结果：优化后25 μL反应体系中含100 ng DNA模板、2.0 mmol/L Mg2＋、2.5 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP浓度、3.75 g/L BSA及1.25 UTaq DNA聚合酶.结论：建立了适用于白芨的ISSR-PCR最佳反应体系.