大鼠脊髓损伤后PLGA支架细胞髓内移植的组织学观察

目的 观察神经干细胞(NSC)、许旺细胞(SCs)和组织工程材料乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)大鼠髓内共移植后的病理形态学改变.方法 36只Wistar大鼠,随机分为PLGA移植组、NSC/PLGA组和NSC+SCs/PLGA组.体外培养、鉴定胚胎脊髓源NSC和SCs,制备和构建PLGA支架细胞复合体并移植到大鼠脊髓Tq半横断损伤部位,应用HE染色、电镜和免疫组织化学染色方法在形态结构上观察材料的组织相容性、轴突髓鞘再生及NSC在脊髓内的存活、迁移和分化情况.结果 HE染色观察损伤12周时移植材料内可见细胞生长及新生的毛细血管;扫描电镜观察随着时间的延长,PLGA逐渐降解;材料正中横断面透射电镜观察可见新牛的无髓及有髓神经纤维;脊髓标本免疫组织化学染色可见移植的NSC可以在宿主脊髓内存活、迁移并分化成类神经元样细胞和少枝胶质细胞,未分化成星形胶质细胞.结论 NSC、SCs和PLGA共移植可以在形态学上促进大鼠脊髓半横断损伤的修复.     

施万细胞和神经干细胞在PLGA支架中共培养的扫描电镜观察

目的 扫描电镜观察施万细胞和神经干细胞在生物可降解材料（乙交酯-丙交酯）共聚物（Poly（lactide-co-glycolideacid），PLGA）支架中的生长状态，探讨施万细胞、神经干细胞与PLGA取向支架的细胞亲和性。方法 体外培养大鼠神经干细胞和施万细胞，待细胞生长良好，移植接种至PLGA支架上，培养9d后行扫描电镜观察。结果 施万细胞与神经干细胞在PLGA支架表面贴附，形态正常，生长良好。迁出神经球的神经干细胞分化成多种形态的细胞紧贴PLGA表面。部分细胞形态类似神经细胞。结论 施万细胞和神经干细胞在PLGA支架中生长良好，PLGA对施万细胞及神经干细胞具有良好的细胞亲和性。     

组织工程脊髓支架材料：聚乳酸-羟基乙酸最佳孔径的筛选

背景：细胞支架是细胞生长的载体，其孔径是影响组织工程脊髓疗效的重要因素之一。 目的：通过将神经干细胞与不同孔径的聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)支架体外复合培养，筛选确立组织工程脊髓支架材料的最佳孔径。 方法：取传第1代的神经干细胞悬液50 µL(细胞数1010 L-1)，分别种植在孔径200~300 µm、400~500 µm的PLGA支架上复合培养7 d，得到两种组织工程脊髓。30只大鼠均建立脊髓损伤模型，造模后分为3组，分别在脊髓缺损处立即填塞上述两种组织工程脊髓，空白对照组在缺损处不进行材料移植。倒置相差显微镜及电镜下观察神经干细胞在PLGA支架中的生长增殖与分布，MTT检测两种组织工程脊髓所含神经干细胞的相对数量，采用BBB运动功能评分比较不同孔径的组织工程脊髓的移植疗效。 结果与结论：镜下神经干细胞在各孔径材料上均紧密贴附并增殖分化，组织相容性良好。共培养7 d后，孔径200~300 µm PLGA支架组、孔径400~500 µm PLGA支架组的吸光度值基本相似(P > 0.05)，说明PLGA支架的孔径大小对培养的神经干细胞增殖数量无明显影响。移植第4周与空白对照组比较，孔径200~300 µm PLGA支架组、孔径400~500 µm PLGA支架组大鼠的神经功能均有不同程度恢复，BBB运动功能评分均明显升高(P < 0.05)，且孔径200~300 µm的PLGA支架其移植效果更好。 关键词：脊髓；神经干细胞；聚乳酸-羟基乙酸；组织工程；支架；生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.004     

乙交酯-丙交酯共聚物/神经生长因子复合支架植入大鼠损伤脊髓后的

背景：前期体外实验已经证明神经生长因子乙交酯-丙交酯共聚物与神经生长因子复合支架具有良好的细胞黏附亲和性;同时观察到其随时间推移可稳定释放神经生长因子。 目的：将生物可降解材料乙交酯-丙交酯共聚物与神经生长因子复合支架移植入大鼠脊髓半横断损伤动物模型中,观察其对脊髓损伤髓鞘再生的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2006-05/07在首都医科大学附属北京市神经外科研究所损伤修复实验室完成。 材料：乙交酯-丙交酯共聚物与神经生长因子复合支架材料,其中0.02 g乙交酯-丙交酯共聚物中含有1 μg 神经生长因子。 方法：45只成年Wistar大鼠制备T8~9脊髓半横断损伤模型,随机分为单纯支架组20只和复合支架组25只,分别移植乙交酯-丙交酯共聚物支架和掺有神经生长因子的乙交酯-丙交酯共聚物支架。 主要观察指标：于术后1,4,8和12周进行髓鞘碱性蛋白免疫组织化学及超微结构检测观察髓鞘再生的情况。 结果：复合支架组苏木精-伊红染色观察脊髓损伤程度较单纯支架组明显减轻。复合支架组髓鞘碱性蛋白免疫组织化学阳性颗粒明显多于单纯支架组。透射电镜观察复合支架组大鼠新生髓鞘明显多于单纯支架组。 结论：乙交酯-丙交酯共聚物联合神经生长因子促进髓鞘再生的效果优于单纯乙交酯-丙交酯共聚物。     

新型三维编织型生物支架的研制及体外生物相容性*☆

背景：脊髓损伤后,由于有胶质瘢痕的阻隔,使再生的轴突难以穿越损伤区域,从而影响脊髓功能的恢复。随着组织工程技术的发展,研究人员尝试利用在三维支架的空间诱导作用下,让再生的轴突和支架内部携带的细胞能够三维有序的生长,穿越瘢痕屏障,连接脊髓损伤断端。 目的：采用编织工艺研制新型以聚乙交酯-丙交酯为原料的三维支架,检测新型支架与许旺细胞的生物相容性。 设计、时间及地点：体外对比观察实验,于2007-06/2008-03在长海医院中心实验室完成。 材料：选择聚乳酸︰聚羟基乙酸为9︰1的聚合材料聚乙交酯-丙交酯,通过熔融纺丝、拉伸、编织等步骤制作聚乙交酯-丙交酯三维支架。取新生3 d SD乳鼠的坐骨神经,分离、纯化许旺细胞。 方法：实验分3组：三维支架组将许旺细胞接种在新型三维支架内培养;明胶海绵组将许旺细胞接种在胶原海绵上培养;细胞培养皿组直接接种在预涂左旋多聚赖氨酸的24孔培养板上培养。 主要观察指标：扫描电镜观察内部微管道的排列规律,测量其孔径大小、孔隙率等指标。通过倒置相差显微镜和扫描电镜观察许旺细胞在支架上生长情况,包括许旺细胞在支架上的黏附、增殖和凋亡情况等。 结果：支架外径为3 mm,微管道内径为100 μm,呈均匀平行排列,支架的孔隙率为68%。三维支架组与细胞培养皿组中的许旺细胞黏附、增殖差异无显著性意义,与明胶海绵组差异有显著性意义。三维支架组与明胶海绵组中细胞凋亡差异无显著性意义,它们均低于细胞培养皿组,差异有显著性意义。 结论：新型三维编织型支架具有良好的生物相容性。 关键词：支架;许旺细胞;组织工程;生物相容性     

携带神经干细胞肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活分化

摘要 背景：多项研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,肌基膜管具有良好的细胞、组织相容性和降解性,那么能否将二者结合起来构建一个新的神经组织工程支架？ 目的：以神经干细胞为种子细胞,以肌基膜管为支架,观察携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活与分化情况。 方法：体外分离培养大鼠神经干细胞,并进行鉴定。用化学萃取方法制作去细胞骨骼肌基膜管支架,将神经干细胞移植入肌基膜管支架培养7 d后,用免疫组织化学方法检测神经干细胞的存活及分化情况,扫描电镜观察其超微结构。 结果与结论：神经干细胞分离培养第5天,Nestin免疫荧光染色可见大量神经球。加血清诱导神经干细胞分化至7 d,进行抗NF、抗GFAP免疫荧光染色,镜下可见NF、GFAP阳性细胞,证明培养的神经干细胞具有多项分化潜能。苏木精-伊红染色法显示肌基膜管中肌细胞成分已消失,肌基膜管支架内主要是大致平行的管道。携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架免疫荧光染色证明,神经干细胞在支架内仍具有干细胞特性,并可分化为神经元和神经胶质细胞。扫描电镜显示神经干细胞可以稳固地贴附在肌基膜管内,提示制备的神经组织工程支架具有良好的生物相容性,可以进行体内移植治疗脊髓损伤等神经系统疾病。 关键词：肌基膜管;组织工程支架;神经干细胞;移植;脊髓损伤 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.003     

多孔丝素材料组织相容性的初步研究

背景：丝素蛋白支架材料被植入生物体内后会发生降解且无法完全与宿主组织分离,这类材料生物相容性的研究大多为体外实验,其体内的组织相容性和降解过程的研究结果仍不充分。 目的：初步观察多孔丝素材料的体内组织相容性。 方法：将多孔丝素支架埋藏于SD大鼠背部皮下,术后2,4,6,8周分别取材,对伤口局部及材料情况大体观察,然后材料切片苏木精-伊红染色行组织学观察。 结果与结论：动物伤口愈合良好,多孔丝素表面形成极薄的纤维包裹,周围组织反应轻微。组织切片见炎细胞浸润,以巨噬细胞为主,支架材料边缘孔隙内有成纤维细胞和毛细血管长入。8周时材料边缘部分可见支架结构崩解现象,而材料内部变化不大。结果显示组织细胞可以沿多孔丝素支架表面贴附生长,提示支架材料具有较好的组织相容性。     

组织工程脊髓移植治疗大鼠脊髓半切块状损伤

目的 研究组织工程脊髓移植治疗大鼠脊髓半切块状损伤的疗效.方法 以聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)为细胞支架,多聚赖氨酸为细胞外基质,神经十细胞(NSCs)为种子细胞,体外构建组织工程脊髓.制作大鼠T10脊髓右半切块状损伤模型,随机分成3组:实验组在损伤区移植组织工程脊髓,对照组A移植NSCs,对照组B移植PLGA.移植治疗12周,每周均行BBB评分定量评价肢体运动功能.伤后第12周辣根过氧化物酶(HRP)神经逆行示踪评价脊髓传导束的恢复程度,并取损伤处脊髓组织行免疫组织化学染色,观察移植区的形态结构修复.结果 伤后12周实验组的BBB运动功能评分较对照组明显提高,差异有统计学意义(P＜0.05).HRP神经逆行示踪显示:实验组鼠右侧大脑组织中可见大量的HRP标记阳性神经元,而两对照组仅见有少量HRP阳性神经元;免疫组织化学染色显示:实验组移植区NF阳性神经元和GAP-43阳性神经轴索数量较多,修复了缺损,而对照组极少,仍留下不同程度的缺损.结论 组织工程脊髓移植治疗促进了半切块状损伤脊髓的形态结构修复和功能恢复,疗效明显优于单纯的NSCs移植和PLGA移植.     

壳聚糖膜在大鼠脊髓组织中的降解及其生物相容性

背景：以往关于壳聚糖的生物相容性研究多局限于神经细胞的体外实验，而壳聚糖在神经系统体内尤其是在脊髓局部的相容性尚不清楚。 目的：观察壳聚糖在大鼠脊髓组织内的降解率及生物相容性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-08/2006-07在武汉协和医院泌尿外科实验室完成实验。 材料：健康成年SD大白鼠36只，随机分为壳聚糖组和对照组，每组18只。 方法：在壳聚糖组和对照组大鼠脊髓分别植入壳聚糖膜和医用丝线。 主要观察指标：于术后1，2，4周测定壳聚糖膜质量，计算降解率；观察2组大鼠植入区局部炎细胞数量变化，评估生物相容性。 结果：壳聚糖可在大鼠体内逐渐降解，术后1，2，4周降解率分别为14.8%，18.9%，25.0%。壳聚糖植入局部炎细胞计数高于对照组（P < 0.05），但同属异物炎症反应, 并无明显的全身不良反应。 结论：壳聚糖膜易于降解并与脊髓组织有良好的生物相容性，是一种可应用于脊髓损伤修复的生物材料。     

组织工程支架在犬急性脊髓损伤修复中应用的初步研究

目的探讨携带神经干细胞的聚碳酸亚丙酯[poly（propylene carbonate），PPC]可降解支架移植在犬脊髓急性损伤后修复中的作用。方法制作犬T13脊髓左侧半切损伤模型。将实验动物随机分为3组：细胞支架组在损伤后1周时将填充神经干细胞的PPC可降解支架植入损伤区．支架组只植入支架，对照组不作移植。8周后观察支架的组织反应、降解情况及神经干细胞的迁移分化和脊髓轴突再生情况。结果支架部分降解，管腔内未见瘢痕侵入。神经干细胞向支架邻近部位广泛迁移、扩散，并分化为3种神经细胞表型。神经丝蛋白（NF）及髓鞘碱性磷酯蛋白（MBP）免疫组化显示细胞支架组脊髓损伤区邻近部位的继发损害较其他组轻。结论携带神经干细胞的PPC可降解支架在犬脊髓组织中无明显组织反应．能够抵御瘢痕侵入：其携带的神经干细胞能够整合入邻近脊髓组织并起到一定保护作用。     

骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨内生长以及成骨潜能*

摘要 背景：纳米晶胶原基骨修复材料是根据仿生原理制备的纳米骨框架材料,其微结构和成分两方面都与天然骨有相似性 ,具有良好的生物相容性。 目的：研究兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞,体外培养、纯化,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养,第3,7,20天后激光共聚焦和扫描电镜观察二者复合程度。 结果与结论：骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原基骨修复材料复合良好,共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察均可见细胞生长;纳米晶胶原基骨修复材料能够作为良好的支架,它能使骨髓间充质干细胞在其内稳定生长。提示骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨修复材料内能很好的生长,并且具有成骨潜能。 关键词：纳米晶胶原基骨修复材料;骨髓间充质干细胞;支架;细胞培养;组织工程骨 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.003     

Transplantation of Nogo-66 receptor gene-silenced cells in a poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) scaffold for the treatment of spinal cord injury

Inhibition of neurite growth,which is in large part mediated by the Nogo-66 receptor,affects neural regeneration following bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.The tissue engineering scaffold poly(D,L-lactide-co-glycolic acid) has good histocompatibility and can promote the growth of regenerating nerve fibers.The present study used small interfering RNA to silence Nogo-66 receptor gene expression in bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells,which were subsequently transplanted with poly(D,L-lactide-co-glycolic acid) into the spinal cord lesion regions in rats.Simultaneously,rats treated with scaffold only were taken as the control group.Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry revealed that at 4 weeks after transplantation,rats had good motor function of the hind limb after treatment with Nogo-66 receptor gene-silenced cells plus the poly(D,L-lactide-co-glycolic acid) scaffold compared with rats treated with scaffold only,and the number of bone marrow mesenchymal stem cells and neuron-like cells was also increased.At 8 weeks after transplantation,horseradish peroxidase tracing and transmission electron microscopy showed a large number of unmyelinated and myelinated nerve fibers,as well as intact regenerating axonal myelin sheath following spinal cord hemisection injury.These experimental findings indicate that transplantation of Nogo-66 receptor gene-silenced bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells plus a poly(D,L-lactide-co-glycolic acid) scaffold can significantly enhance axonal regeneration of spinal cord neurons and improve motor function of the extremities in rats following spinal cord injury.     

5000兔骨髓基质细胞在纤维蛋白胶与异种骨复合支架中培养(英文发表）

目的 应用纤维蛋白胶、异种无机骨构建骨组织工程复合支架材料,探讨兔骨髓基质细胞在这种复合支架材料中立体培养情况。 方法 实验完成于吉林大学中日联谊医院骨科研究室、天津科技大学机械工程学院。牛松质骨经去脂去蛋白等无机化处理后与纤维蛋白胶复合制成复合骨支架材料;将兔骨髓基质细胞作为种子细胞进行传代培养,收集后再与纤维蛋白胶、异种无机骨构成的复合支架中进行立体培养,采用相差显微镜、透射电子显微镜等手段观察骨髓基质细胞在纤维蛋白胶中的生长状况。结果 相差显微镜下观察见骨髓基质细胞均匀分布于复合支架中,具有良好活性,细胞不断增殖、分化,培养4周骨髓基质细胞形成密集立体网状。透射电子显微镜下见复合支架中培养4周的基质细胞内细胞器结构完整,局部有细突起,胞质内可见线粒体,核糖体,粗面内质网。进一步证实骨髓。结论 在纤维蛋白胶与异种无机骨构建的复合支架中骨髓基质细胞具有良好活性,可迅速扩增生长,提示这种支架材料具有适合种子细胞生长的环境,具备两种支架材料的优越性,可以成为良好的骨组织工程支架材料。     

不同质量配比壳聚糖/聚乙烯醇复合材料组织工程支架的制备：结构及性能比较

背景：聚乙烯醇具有与人体组织相近的含水量、良好的生物相容性和较高的机械强度,适合作为组织工程基质材料。但如何改善其细胞亲和性,是将其作为组织再生支架材料的关键。 目的：制备壳聚糖/聚乙烯醇复合支架,探讨其作为修复人体损伤组织或器官组织工程支架材料的可行性。 方法：将固定相对分子质量和醇解度的聚乙烯醇124与固定脱乙酰度的壳聚糖按不同质量配比复合,分别用成膜法、成颗粒法、冷冻干燥法制备壳聚糖/聚乙烯醇复合支架。测定复合膜的透光率、含水率、膨胀率;测定复合颗粒和复合海绵的含水率;并用扫描电镜观察复合支架横截面的形貌。 结果与结论：通过改变复合支架中壳聚糖与聚乙烯醇和含量,制备7种不同质量配比的复合支架。成膜法制备的复合支架,其透光率为70%~80%,含水率为121.2%~162.5%,膨胀率为60.3%~133.7%;成颗粒法和冷冻干燥法制备的复合支架,其含水率分别为82.0%~461.2%和280.8%~1939.0%。聚乙烯醇与壳聚糖的质量配比为0.75/0.15时,复合支架的综合性能最好。扫描电镜观察显示,聚乙烯醇与壳聚糖的质量配比为0.75/0.15时,用冷冻干燥法制备的复合支架其内部结构规整,呈蓬松纤维状,有较好的力学性能和较高的含水率。 关键词：聚乙烯醇;壳聚糖;复合支架;组织工程;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.023     

背根神经节与聚乙醇酸联合培养的形态学观察

探索人工生物降解材料聚乙醇酸纤维与周围神经组织的生物相容性。取新生ＳＤ大鼠背根神经节与人工材料聚乙醇酸纤维联合培养３周,倒置显微镜与扫描电镜观察。神经元的突起与雪旺细胞可贴附在聚乙醇酸纤维上生长,并呈串珠状地环绕着人工聚乙醇酸纤维。体外联合培养结果提示,人工生物降解材料聚乙醇酸与大鼠周围神经组织有较好的生物相容性。     

去细胞同种异体神经支架种植许旺细胞的体外培养

摘要 背景：前期的研究中分别探讨了使用复合酶消化法及差速贴壁法对许旺细胞培养的影响以及聚氧乙烯辛烷基酚(Triton X-100)制备同种异体神经支架。 目的：通过化学萃取法制备同种异体神经支架,并将培养的许旺细胞与支架进行体外结合培养。 方法：取Wistar大鼠双侧坐骨神经,运用30 g/L三硝基甲苯和40 g/L脱氧胆酸钠分别萃取1,2和3次,在萃取神经和未萃取神经的中段取材,行苏木精-伊红染色,S-100及Laminin免疫组织化学染色及透射电镜检测。取SD胎鼠坐骨神经及臂从神经,使用复合酶消化,差速贴壁及Arab-c抑制成纤维细胞生长的培养方法获得大量高纯度的许旺细胞。再把许旺细胞注入同种异体神经支架内,并行透射电镜及扫描电镜观察。 结果与结论：用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取后,坐骨神经内细胞和髓鞘被清除,神经基底膜被保留。电镜下可见萃取后的神经由空的神经基底膜管和管之间的胶原纤维构成。萃取次数增加后,神经内残留的S-100蛋白显著减少,但反复萃取后支架结构受破坏。去细胞同种异体神经支架适合许旺细胞体外生长,并有迁移排成行的特性。结果提示,用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取2次可去除细胞而保留神经基底膜管,是制备具有仿生结构神经支架的理想方法。神经支架种植许旺细胞后可能成为一种理想的神经缺损修复材料。     

Preparation of polypyrrole-embedded electrospun poly(lactic acid) nanoifbrous scaffolds for nerve tissue engineering

Polypyrrole (PPy) is a biocompatible polymer with good conductivity. Studies combining PPy with electrospinning have been reported;however, the associated decrease in PPy conductivity has not yet been resolved. We embedded PPy into poly(lactic acid) (PLA) nanoifbers via electrospinning and fabricated a PLA/PPy nanoifbrous scaffold containing 15% PPy with sustained conductivity and aligned topog-raphy. hTere was good biocompatibility between the scaffold and human umbilical cord mesenchymal stem cells as well as Schwann cells. Additionally, the direction of cell elongation on the scaffold was parallel to the direction of ifbers. Our ifndings suggest that the aligned PLA/PPy nanoifbrous scaffold is a promising biomaterial for peripheral nerve regeneration.