shRNA表达载体特异性抑制人脑胶质瘤细胞BT325绿色荧光蛋白基因的表达

目的探讨绿色荧光蛋白(GFP)特异性发夹结构RNA (shRNA)对人类胶质瘤BT325细胞系GFP基因表达的抑制作用。方法设计并合成针对GFP基因的shRNA序列,与报告基因质粒pEGFP-N1共转染,选择最佳转染比例,荧光显微镜下观察GFP表达的效率和对GFP的抑制效应。结果质粒pSIREN-RetroQ-RNAi经双酶切得到6 kb和100 bp条带,结合测序验证,与实验设计的shRNA长度相符。质粒DNA与XP-1转染比例为1∶2.5时GFP表达最强。BT325细胞干扰48 h时GFP表达显著减少。结论BT325细胞系中存在RNA干扰现象,且干扰效果特异、稳定;本实验为研究基因功能提供了新的策略。     

小干扰RNA沉默RHBDF1基因抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的初步研究

目的 检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞内的表达,以及小干扰RNA沉默C6胶质瘤细胞内RHBDF1基因后是否诱导C6细胞凋亡和抑制细胞生长,为基因治疗胶质瘤寻找新的靶基因. 方法采用Western blot检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞(包括C6、U251和MGR2)的表达情况:用脂质体转染法分别将RHBDF1 siRNA或对照siRNA转染入C6细胞内,RT-PCR和Western blot方法检测siRNA转染后对C6细胞内RHBDF1基因和蛋白的影响;Tune1法检测RHBDF1基因沉默后对细胞凋亡的诱导情况,Ki-67免疫荧光染色观察RHBDF1基因沉默后对细胞生长抑制的影响.结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞内RHBDF1基因存在着过度表达.siRNA转染入C6细胞后.对照siRNA组凋亡率为2.96%±1.25%,而RHBDF1siRNA1组和RHBDF1 siRNA2的凋亡率分别为36.35%±4.85%和33.58%±4.08%:对照siRNA组细胞增殖率为95.96%±3.25%,而RHBDF1 siRNA1组和RHBDF1 siRNA2组的细胞增殖率分别为24.57%±5.53%和25.68%±4.08%;组间细胞凋亡率和增殖率比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RHBDF1基因在胶质瘤细胞内存在过度表达,沉默该基因后可以诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,RHBDF1基因可能成为基因治疗胶质瘤的一个新的靶基因.     

特异性小干扰RNA沉默Polo样激酶1基因表达对恶性胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨Polo样激酶1(PLK1)基因对胶质瘤细胞增殖的影响和可能机制. 方法 根据PLK1基因特点,设计并用化学方法合成了5个小干扰核糖核酸分子(siRNA)(P1、P2、P3、P4和P5).以这5个siRNA转染人胶质瘤TJ905细胞后.分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测PLK1 mRNA和蛋白表达水平.分别采用MTT法和Western blot方法检测癌细胞增殖和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白水平,用TRA-.ELISA方法检测胶质瘤细胞端粒酶活性. 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制胶质瘤TJ905细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好.以P4转染处理胶质瘤细胞后与脂质体对照组比较,PLK1基因mRNA水平和蛋白水平明显下调,差异有统计学意义(P均=0.000).MTT结果显示.与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制,且呈浓度依赖性(r=0.868,P=0.000).Western blot结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组PCNA蛋白水平明显下降,差异有统计学意义(F=181.36,P=0.000).TRAP-ELISA结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组胶质瘤细胞端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性(P=0.000). 结论 PLK1基因对胶质瘤细胞增殖具有重要的调控作用;以PLK1 siRNA转染处理胶质瘤细胞,可明显抑制胶质瘤细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关.     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

siRNA下调Caveolin-1表达对体外培养C6胶质瘤细胞影响

目的 观察siRNA下调Caveolin-1(Car1)表达的效果及对体外培养C6胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响.方法 构建Car1 mRNA质粒,转染体外培养c6胶质瘤细胞,利用Transwell体外侵袭实验和"划痕"实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力,采用Western blot和RT-PCR的方法检测Cav1、EGFR、Pyk2的表达情况.结果 所构建的Cav1 siRNA质粒转染体外培养C6胶质瘤细胞可明显下调Cav1的表达,干扰成功后C6胶质瘤细胞的侵袭能力和迁移能力明显下降,同时EGFR和Pyk2的表达明显减少.结论 siRNA下调Cav1可降低体外培养C6胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力.     

垂体瘤转化基因RNA干扰对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的 观察垂体瘤转化基因(PTTG)RNA干扰对胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响.方法 实验分4组:对照组:对胶质瘤U251细胞不进行任何处理;替莫唑胺(TMZ)组:胶质瘤U251细胞培养基中加入TMZ;PTTG shRNA转染组:PTTG shRNA片段转染胶质瘤U251细胞;PTTG shRNA联合TMZ组:TMZ作用于转染PTTG shRNA片段的胶质瘤U251细胞.MTT法检测细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 MTT结果显示吸光度值在对照组、TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组分别为0.85±0.07、0.58±0.06、0.55±0.07、0.41±0.05,TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组细胞增殖抑制率分别为(31.56±5.51)%、(35.53±4.60)%、(51.49±6.74)%;PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组抑制细胞增殖更明显,与PTTG shRNA组及TMZ组比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,48 h时对照组凋亡率为(6.29±0.78)%,TMZ组为(33.61±4.88)%,PTTG shRNA组为(39.61±4.95)%,PTTG shRNA联合TMZ组为(66.23±7.60)%,PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组的凋亡率较PTTG shRNA组及TMZ组明显增高,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PTTGRNA干扰可以增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗效果.     

DLC1基因在人脑胶质瘤组织中的表达

目的 探讨抑癌基因DLC1在人脑胶质瘤组织中的表达和功能.方法 收集广州医学院第二附属医院神经外科自2007年1月至2009年6月手术切除的胶质瘤标本39例及同期行颅脑减压术治疗的颅脑损伤患者的正常脑组织10例,实时荧光定量PCR检测DLC1 mRNA的表达;将质粒pCS2-DLC1转染体外常规培养的人胶质瘤细胞株U251,同时用空载体pCS2-MT转染作为对照组,转染后36 h应用Western blot检测DLC1表达标签蛋白Mvc,应用MTT检测U251细胞增殖能力的变化.结果实时荧光定量PCR结果显示胶质瘤组织中DLC1 mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000),且Ⅰ级胶质瘤组织DLC1 mRNA的表达水平高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,差异有统计学意义(平均秩次分别为44.20、30.23、32.25、31.0,H=18.818,P=0.001);Western blot检测结果显示DLC1标签蛋白Mvc在pCS2-DLCI转染组细胞呈过表达,在pCS2-MT转染组细胞无明显表达;MTT检测显示pCS2-DLC1转染组U251细胞吸光度值高于pCS2-MT转染组,差异有统计学意义(P=0.002).结论 高表达的DLC1可能促进胶质瘤的形成和发展.     

RNA干扰技术联合抑制AKT1和COX-2表达对U251胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制U251恶性胶质瘤细胞株AKT1和COX-2表达后,在体外对U251细胞增殖的抑制作用.方法 构建靶向AKT1和COX-2的RNAi重组腺病毒表达载体(rAd-A+C)转染至U251细胞.应用Realtime PCR检测AKT1和COX-2 mRNA水平的变化;应用Western blot检测AKT1和COX-2蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析;应用MTr法和流式细胞术评价肿瘤细胞的增殖活性.结果 rAd-A+C可显著抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达;与对照组和无义序列处理组(rAd-HK)比较,Western blot分析结果显示下游相关因子PCNA、Cyclin D1表达下降,而p53表达上调;细胞周期分析结果表明rAd-A+C处理组进入S期的细胞数较对照组减少了7.0%～7.8%,出现G0/G1期阻滞;MTT法分析显示rAd-A+C处理组细胞生长抑制率＞58%.结论 靶向AKT1和COX-2的RNAi技术可显著抑制U251细胞AKT1和COX-2表达,在体外对U251细胞增殖活性产生明显抑制作用.因此,RNAi重组腺病毒表达载体介导的基因治疗可成为胶质瘤靶向治疗的新策略.     

RNA干扰及其在胶质瘤基因治疗中的应用

RNA干扰（RNA interference。RNAi）是双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）降解特异性靶基因转录出的mRNA。从而抑制靶蛋白表达的现象。自从二十世纪九十年代发现RNAi这一现象以来，RNAi已被广泛应用于研究基因功能、信号转导通路和基因治疗等方面。随着分子生物学、分子遗传学等学科的发展．发现了许多与肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因。经过大量临床前期试验表明，针对特异性靶基因的小干扰RNA（short／small interfering RNA．siRNA）治疗胶质瘤是行之有效的。为基因治疗胶质瘤提供了新的思路。[第一段]     

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达

目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应。方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条shRNA的DNA模板,分别克隆到3个干扰载体pG1,pG2和pG3上：采用分布酶切连接的方法,分别将U6启动子以及下游的后2个shRNA模板酶切下来,依次连接到pG1对应酶切位点,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-survivin,测序鉴定：将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251,分别采用RT-PCR以及Western Bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰后效果。结果重组的干扰载体含有3条正确的shRNA模板；RT-PCR以及Western Blotting检测显示,survivin的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制。结论编码3条shRNA的干扰载体pGenesil-survivin介导的RNA干扰技术(RNAi)可以显著的靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达。     

胸苷激酶基因治疗人多形性胶质母细胞瘤BT325并诱导BT325和9L肿瘤细胞的凋亡

目的：了解转单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）前后胶质瘤细胞对更昔洛韦（ＧＣＶ）的药物敏感性；钙通道阻滞剂尼莫地平是否增强ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗的肿瘤杀伤作用，以及该治疗方法能否诱导胶质瘤细胞凋亡。方法：用带有ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因的重组逆转录病毒载体，转染人多形性胶质母细胞瘤株ＢＴ３２５。用ＭＴＴ法测定ＧＣＶ对转染ＨＳＶ－ＴＫ基因ＢＴ３２５瘤细胞的杀伤作用。结果：０．１ｕｇ／ｍｌ的ＧＣＶ对转ＨＳＶ－ＴＫ基因的ＢＴ３２５瘤细胞有杀伤作用，加入尼莫地平后，０．０１ｕｇ／ｍｌ的ＧＣＶ即有杀伤作用。同时发现该治疗方法可以引起胶质瘤细胞的凋亡。结论：ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗对胶质瘤有很强的杀伤作用，并可以引起肿瘤细胞的凋亡；尼莫地平有协同作用，这可能使尼莫地平做为一种增敏剂在脑肿瘤该治疗中使用。     

EGF抑制BT325细胞生长的相关基因分离、克隆

目的 寻找抑制胶质瘤细胞生长的新的相关基因。方法 应用mRNA差异显示技术与cDNA array反向Northern杂交相结合，分离、克隆表皮生长因子（EGF，100ng/ml)作用后生长抑制的人脑多形性胶质母细胞瘤BT325细胞与对照组（不加EGF）相比新表达或表达明显上调的基因。结果 克隆了6个BT325细胞生长抑制后表达明显增高的EST（expressed sequence tag)，其中1个为新基因序列，另5个分别与CGI－51、转醛缩酶（Transaldolase、TAL）、核糖蛋白L35a、40s核糖相关蛋白基因及BC－2蛋白mRNA有不同程度的同源性，其中功能分析提示TAL表达增加可诱导细胞凋亡。6个EST均投递GenBank，分别获得了接受号：AW408844－408848。结论 所分离、克隆的基因可能与胶质瘤的生长抑制有关。     

下调Notch-1基因表达抑制胶质母细胞瘤的增殖活性研究

目的 应用siRNA下调胶质母细胞瘤TJ-905细胞株Notch-1基因抑制肿瘤增殖活性.方法 实验设以Notch-1为基因靶点的siRNA1、siRNA2、siRNA3转染组、阴性对照组和空白对照组,采用OligofectamineTM2000二次转染方法将 siRNA转移到细胞内.实时荧光定量PCR检测siRNA对Notch-1基因表达的抑制作用,筛选出最优siRNA序列用于后续研究;四唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖活性;使用Notch-1 siRNA或阴性siRNA转染的TJ-905细胞悬液注射裸鼠腋下,观察移植瘤生长情况,比较肿瘤体积,观察3周后处死动物,切片行HE染色鉴定.结果 (Ⅰ)siRNA明显抑制Notch-1 mRNA的表达水平,空白对照组、阴性对照组、siRNA1、2、3转染组Notch-1 mRNA 表达率分别为1.00±0.07、1.04±0.05、0.11±0.02、0.12±0.01、0.77±0.03,siRNA1为最优序列.(2)siRNA1转染组细胞增殖活性显著降低.(3)接种Notch-1 siRNA1转染的TJ-905细胞裸鼠肿瘤生长速度明显低于接种阴性转染的TJ-905细胞裸鼠,裸鼠处死后观察肿瘤体积:Notch-1 siRNA1转染组为(748.3±154.3)mm3,阴性转染组为(1739.2±249.7)mm3,病理切片HE染色证明为多形性胶质母细胞瘤.结论 化学合成的靶向Notch-1基因的siRNA可以显著地下调Notch-1基因表达水平,抑制肿瘤增殖活性.为进一步进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础.

Abstract：

Objective To study the inhibitory effect of siRNA on glioblastoma (GBM) Notch-1 gene expression in addition to the growth of TJ- 905 glioblastoma.Methods Three Small interference RNAs (siRNAs) targeting Notch- 1 gene named siRNA1,siRNA2,siRNA3 were synthesized chemically in vitro with gene bank BLAST.TJ-905 cells were transfectedtwice with the siRNA by using OligofectamineTM2000.The nontransfected cells and nonspecific siRNAs transfected cells were taken as blank and nonsense controls.Down - regulation of Notch- 1 was demonstrated by real- time RT- PCR,according to the result of QRT- PCR we therefore selected the most effective siRNA for further study.Cell proliferation was measured by MTT analysis.Male Balb/C nude mice were injected subcutaneously with Notch- 1 siRNA- or nonsense siRNA- transfected TJ-905 cells,tumor sizes were measured every 4 days.HE stain was used to determine the property of tumor.Resuts(1) The expression of Notch- 1 mRNA in blank,nonsense controls,siRNA1,2,3 groups were 1.00±0.07,1.04±0.05,0.11 ±0.02,0.12 ±0.01,0.77 ±0.03 by real-time RT- PCR scan analysis,the most effective siRNA was siRNA1.(2) An inhibitory proliferation and growth can be induced in siRNA1 transfected group.(3)Nude mice xenografted with cell suspensions from the nonsense siRNA group developed tumors with a significantly increased volume (from the 18th days) as compared to mice that received the Notch- 1 siRNA1- treated cells.The final tumor volume were less in nude mice injected with Notch- 1 siRNA (748.3 ±154.3 )mm3 compared to nonsense si RNA injection (1739.2 ± 249.7 )mm3,HE stain demonstrate that tumor was multiformity glioblastoma.Conclusion The chemically synthesized siRNA targeted Notch- 1 gene could down -regulate the expression of Notch- 1.In addition,an inhibitory proliferation and growth were induced when compared with the control cells in vitro and in vivo.It was suggested that the suppression of Notch- 1 expression and the inhibition of growth provide a new way to glioma gene therapy.     

miR-21调控人脑胶质瘤细胞侵袭能力的体外研究

目的 探讨miR-21调控人脑胶质瘤细胞侵袭能力的体外机制.方法 脂质体介导反义miR-21(AS-miR-21)转染体外常规培养的U251细胞,同时设无义寡脱氧核苷酸(ODN)组和对照组.测定荧光素酶活性验证3组细胞中miR-21的表达,Matrigel基质生长实验检测U251细胞的生长情况,Transwell细胞体外迁移实验检测U251细胞的迁移能力,Western blotting检测细胞侵袭相关蛋白局部粘着斑激酶(FAK)、基质金属蛋白酶9/2(MMP-9/2)、人基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)、微管蛋白α(Tubulin-α)的表达,免疫荧光检测细胞Tubulin-α蛋白的形态. 结果 与对照组和无义ODN组比较,转染AS-miR-21组U251细胞miR-21表达水平降低,Matrigel基质生长实验显示转染AS-miR-21组U251细胞体外培养克隆平均直径较小,Transwell细胞体外迁移实验显示转染AS-miR-21组穿膜细胞数较少,Western blotting结果 显示转染AS-miR-21组U251细胞FAK、MMP-9/2表达较低,TIMP-1表达较高,差异均有统计学意义(P＜0.05).Tubulin-α的表达无明显变化,免疫荧光染色显示转染AS-miR-21组Tubulin-α蛋白形态扭曲. 结论 miR-21高表达可以促进U251胶质瘤细胞侵袭生长,提示miR-21可以作为基因治疗脑胶质瘤的候选靶点.     

姜黄素对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因下调作用的体外研究

目的 探讨姜黄素对体外培养胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因(PTTG)表达的影响.方法 体外培养胶质瘤C6细胞,给予不同浓度的姜黄素(10μmol/L、20 μmol/L、30μmol/L)作用24h后应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PTTG mKNA表达情况,Western blot方法 检测PTTG蛋白水平的变化. 结果 姜黄素作用后,C6细胞PTTG mRNA表达与PTTG蛋白水平均下降,差异有统计学意义(P<0.01),且随着浓度的增加,其下降越明显. 结论 姜黄素具有下调胶质瘤C6细胞PTTG表达的作用,并呈剂量依赖性.     

Flt-1基因对BT325细胞VEGF蛋白表达及细胞增殖的影响

目的 探讨Flt-1基因对BT325胶质瘤细胞VEGF蛋白表达及细胞增殖的影响.方法 从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Flt-1基因片段,基因重组技术将Flt-1基因片段插入真核表达载体pEGFP-C1中,双酶切及DNA测序鉴定pEGFP-C1-Flt-1重组质粒.pEGFP-C1-Flt-1重组质粒转染BT325胶质瘤细胞,转染后72hELISA法检测培养上清液中VEGF含量,MTT法检测细胞的增殖情况.结果 RT-PCR方法证实从人脐静脉血内皮细胞中成功获得1 384 bp Flt-1基因片段;经双酶切分析和DNA测序鉴定表明重组质粒pEGFP-C1-Flt-1构建成功;ELISA检测发现,BT325细胞被转染后72 h VEGF含量转染组为(56.3±41.2) pg/ml,空载体转染组为(95.5±35.3) pg/ml(P＜0.05);MTT法检测发现,转染组和空载体转染组的生存率分别为(42.6±3.7)％和(92.8±6.6)％(P＜0.05).结论 Flt-1基因可抑制BT325细胞VEGF的蛋白表达,抑制细胞增殖.