荧光探针杂交聚合酶链反应检测沙门菌

近来,国内外文献中报道了一种新的荧光标记探针杂交与聚合酶链反应(ＰＣＲ)扩增相结合的检测方法[14],该方法快速、敏感、特异,并能自动化操作,但由于试剂盒和配套自动荧光ＰＣＲ检测仪价格昂贵,使之不能被很好的应用。鉴此,我们在参考文献的基础上,改进方法,在国内现有仪器设备上,建立了荧光探针杂交ＰＣＲ同步检测方法,报告如下。一、材料和方法1菌种:13株致病性沙门菌及7株非沙门菌为临床分离株。2主要试剂和试验器材:ＴａｑＭａｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ…     

聚合酶链反应结合探针杂交检测幽门螺杆菌

建立特异，灵敏的聚合酶链反应结合长臂光敏生物素探针杂交检测幽门螺杆菌的方法。用ＰＣＲ产物直接克隆并测序，以含ＨＰ ＤＮＡ序列的重组质粒外源片段为探针。用细菌培养，单纯ＰＣＲ和ＰＣＲ结合杂交检测经胃镜诊断为慢性炎，胃溃疡，十二指肠球部溃疡的胃活检组织，唾液和粪便标本中的ＨＰ。     

聚合酶链反应结合探针杂交检测幽门螺杆菌

目的建立特异、灵敏的聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合长臂光敏生物素探针杂交检测幽门螺杆菌（ＨＰ）的方法。方法用ＰＣＲ产物直接克隆并测序，以含ＨＰＤＮＡ序列的重组质粒外源片段为探针。用细菌培养、单纯ＰＣＲ和ＰＣＲ结合杂交（ＰＣＲ－Ｓｂ）检测经胃镜诊断为慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠球部炎症、十二指肠溃疡的胃活检组织、唾液和粪便标本中的ＨＰ。结果检测胃活检标本７９份，ＰＣＲ－Ｓｂ阳性率为９９％，单纯ＰＣＲ及细菌培养的阳性率分别为９５％和６５％，ＰＣＲ－Ｓｂ的灵敏度达到１ｆｇ。唾液标本的检测阳性率为３５％，粪便标本的检测结果均为阴性。结论测序证实了ＰＣＲ扩增的正确性。ＰＣＲ结合长臂光敏生物素探针杂交是特异、灵敏、简便和对人体无害的检测ＨＰ的方法。     

荧光探针杂交—聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的：建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交－聚合酶链反应（PCR）方法，方法：利用Taq DNA聚合酶的5‘-3‘核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针，导致荧光强度的改变，通过检测荧光强度分析PCR扩增产物。结果：选用13株常见致病性沙门菌和7株非沙门菌进行特异性分析，所有沙门菌的荧光ΔRQ值介于3－8之间，而所有非沙门菌的荧光ΔRQ值均小于1，在敏感性分析中,采用菌落CFU计数法，最低限度可检测到每PCR扩增体系中含2．25CFU的沙门菌，与传统细菌培养鉴定方法对照，对40份各种标本进行沙门菌的检测，结果该方法的特异性为100％，敏感性为93．1％，两种方法的符合率为95％，结论：用荧光探针杂交PCR检测沙门菌，是一种快速，敏感的方法。     

聚合酶链反应-探针杂交-酶显色用于结核分支杆菌的检测

目的　评价聚合酶链反应 探针杂交 酶显色方法 ,检测结核分支杆菌。方法　收集 131例活动性肺结核患者和 30例非结核呼吸系疾病患者的痰标本以双盲法进行痰涂片抗酸染色检查 ,结核菌培养、PCR 探针杂交 酶显色法、PCR 琼脂糖凝胶电泳技术检查对比。结果　涂片法、培养法、PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性分别为 2 6 72 %、4 1 2 2 %、70 2 3% ,PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性显著高于培养法和涂片法 (P <0 0 1)。PCR 探针杂交 酶显色法和PCR琼脂糖凝胶电泳法的敏感性分别为 70 2 3%、70 99% ,特异性分别为 96 6 7%、86 6 7% ,前者特异性比后者高 ,且PCR 探针杂交 酶显色法只检出结核分支杆菌和牛型分支杆菌。结论　PCR 探针杂交 酶显色技术检测结核分支杆菌灵敏度高 ,特异性好 ,简便快速 ,同时能筛检非结核分支杆菌。因此 ,该技术具有很强的临床应用价值     

聚合酶链反应检测痰样品中军团病杆菌核酸

用聚合酶链反应对４０例有军团和病杆菌培养和／或血清学阳性证据，临床诊断军团菌肺炎患者急性期的痰样品中军团和菌巨噬细胞感染效基因的６３０ｂｐ片段进行ＤＮＡ扩增至诊断阳性率为８２．５％。     

荧光探针杂交-聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交-聚合酶链反应(PCR)方法.方法利用Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针,导致荧光强度的改变,通过检测荧光强度分析PCR扩增产物.结果选用13株常见致病性沙门菌和7株非沙门菌进行特异性分析,所有沙门菌的荧光△RQ值介于3～8之间,而所有非沙门菌的荧光△RQ值均小于1;在敏感性分析中,采用菌落CFU计数法,最低限度可检测到每PCR扩增体系中含2.25 CFU的沙门菌;与传统细菌培养鉴定方法对照,对40份各种标本进行沙门菌的检测,结果该方法的特异性为100%,敏感性为93.1%,两种方法的符合率为95%.结论用荧光探针杂交-PCR检测沙门菌,是一种快速、敏感的方法.     

聚合酶链反应分子灯塔法检测结核分枝杆菌

目的 评价聚合酶链反应（PCR）分子灯塔法检测临床标本中结核分枝杆菌（结核菌）的应用价值。方法 应用涂片镜检法、培养法及PCR分子灯塔法检测142份结核病患者痰标本,42份非结核呼吸系疾病患者痰标本。结果 涂片镜检法检测结核病患者临床标本中结核菌阳性率为35.2%(50/142),培养法阳性率为35.9%(51/142),PCR分子灯塔法阳性率为44.4%(63/142)。用PCR分子灯塔法检测临床标本特异性为100％。结论 PCR分子灯塔法是一种全新的PCR分子交模式,PCR扩增、荧光探针杂交、检测一体化,在单一管内完成,其简便、快速、防污染,敏感性较高、特异性强,是结核病辅助诊断的有效方法之一。     

逆转录聚合酶链反应检测风疹病毒

为了早期诊断风疹感染，应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法对８０例临床怀疑风疹感染患者的咽拭物检测风疹病毒。ＰＣＲ阳性者４３例，占５３％；同时用酶联免疫吸附法对每份血清作了ＩｇＭ检测，阳性者１２例，占１５％。统计学处理（Ｐ〈０．０１），表明两种检测方法差异有显著性。扩增产物的特异性通过地高辛标记探针的点杂交分析得到证实。该ＲＴ－ＰＣＲ方法具有快速、早期、灵敏度高和特异性强的特点，有希望发展     

注射狂犬疫苗饮酒引起过敏反应一例报告

本文建立了一个用于检测军团菌的多聚酶链反应方法。扩增参考菌株的染色体DNA(L.pneumophital-14、L.micdadei、L.dumoffii Llongbeachae、L.Jordanis、L.bozemanii)，均可检出375bp的16SrRNA基因片段。对于已经监定的5株国内分离菌株染色体DNA进行扩增，获得了相同的结果，地高辛标记16SrRNA基因探针与扩增产物杂交，结果为阳性。而扩增14株非军团菌均为阴性。采用煮沸法制备细菌染色体DNA,PCR法检测环境水军团菌敏感性为280cfu/ml水，检查临床标本军团菌为560cfu/ml支气管灌洗液。上述结果表明该法敏感、快速、简便，具有较好的特异性。     

快速反相杂交法检测HBV DNA

为建立一种简便快速的核酸探针杂交法检测 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ,将 Ｐ Ｃ Ｒ 上游引物用生物素标记后进行扩增;核酸探针固定于硝酸纤维素膜上,与带有生物素的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物杂交,杂交信号用链霉亲和素 酶结合物显色检测。结果表明,该法检测的敏感性为 ５ ｆｇ,杂交时间为４０ 分钟。２００ 例临床标本检测的阳性率（２７５％ ）高于琼脂糖电泳法（２４５％ ）。同时具有操作简便的特点,可作为 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的常规检测方法。     

嗜肺军团菌毒力岛基因聚合酶链反应分型鉴定

目的建立嗜肺军团菌毒力岛基因分型鉴定方法，探讨其致病特性和分布状况。方法根据GenBank公布的嗜肺军团菌核苷酸序列设计和合成嗜肺军团菌种和毒力岛基因鉴定引物，采用PCR法对25株军团菌属标准参考株，3株国内和20株广东分离嗜肺军团菌，53份临床标本和57份水样、进行嗜肺军团菌种和毒力岛基因分型鉴定。结果5株嗜肺军团菌标准株只有嗜肺军团菌1型（Philadelphia-1 ATCC 33152）12个毒力岛基因全阳性，其他4株只检出11个毒力岛基因。20株军团菌属中其他菌株，分别检出2—11个毒力岛基因；3株国内嗜肺军团菌检出11个毒力岛基因；广东地区分离的20株嗜肺军团菌，7株检出12个毒力岛基因，12株检出11个毒力岛基因，1株未检到毒力岛基因。53例病源不明性肺炎患者支气管洗液和痰液，PCR检测嗜肺军团菌DNA阳性5例（9．4％）。结论广东地区嗜肺军团菌广泛存在水源环境中，而且是医院感染性肺炎的重要病源之一。不同血清型嗜肺军团菌所含毒力岛基因不同，毒力岛基因与致病性相关。     

聚合酶链反应反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌

目的　研究以非培养为基础的快速检测与鉴定念珠菌的方法。方法　将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌种特异探针加尾后固定在硝酸纤维素膜上;用氯化苄法提取念珠菌ＤＮＡ,采用真菌特异通用引物ＰＣＲ 扩增ＤＮＡ,在扩增过程中用Ｂｉｏ１１ｄＵＴＰ 标记扩增产物,然后分别与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌特异探针杂交。结果　对１４ 种念珠菌扩增均为阳性,对３ 种常见细菌扩增均为阴性。３ 种念珠菌只与其对应探针杂交。结论　该方法简便、快速、准确,适于临床实验室快速检测与鉴定念珠菌。     

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。     

复合聚合酶链反应检测恶性疟原虫及混合感染

目的应用一种简易、快速的复合ＰＣＲ扩增系统检测恶性疟原虫及混合感染。方法以间日疟原虫（Ｐｖ）和恶性疟原虫（Ｐ．ｆ）小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）特定片段为靶基因，设计并合成引物，建立复合ＰＣＲ扩增系统。采用煮沸法快速制备ＤＮＡ模板研究本系统的敏感性和特异性，并用于临床血样的检测。结果从Ｐ．ｖ和Ｐ．ｆ感染血样中分别扩增出分子量大小为７０５ｂｐ和５７５ｂｐ的特定扩增带。而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及正常人血样均无扩增带出现。单独检测Ｐ．ｆ敏感度达到０４７×１０－６（约２虫／μｌ全血），在Ｐ．ｖ存在的情况下，检测Ｐ．ｆ敏感度为０４７×１０－５。检测１０４例疟区门诊患者冻存血标本，８４例与镜检法结果相同，并发现２４例混合感染和２例为镜检虫种鉴别失误。结论本系统敏感性高，特异性强，操作简单，并可在一次扩增中同时检出Ｐ．ｖ和Ｐ．ｆ，具有一定的推广应用价值。     

医院供水系统中军团菌污染状况调查

目的对我院各病区供水系统（水嘴）进行军团菌的分离培养，了解供水受军团菌的污染状况。方法1．对我院27个病房的共52个水嘴进行采样，分离培养军团菌。2．分别用军团菌属特异性引物5srRNA和嗜肺军团菌感染力增强因子基因（mip）对分离培养出的菌株进行PCR方法鉴定。结果1．在所调查的27个病房中有9个存在军团菌污染，污染率为33．3％。在所采集的52份标本中共有12份检出军团菌，阳性率为23．1％。2．经PCR鉴定，这12株细菌为非嗜肺军团菌。结论医院病房的供水系统军团菌污染严重，有发生医院感染的潜在危险，应引起相关部门的重视。     

PCR-反向线点杂交技术鉴定慢生长分枝杆菌的方法学研究

目的建立和评价以16S-23S rDNA间隔序列（ITS）为靶基因的PCR-反向线点杂交技术（RLB）快速鉴定慢生长分枝杆菌（SGM）的方法。方法PCR—RLB检测70株分枝杆菌参考菌株、4株诺卡菌参考菌株、5株红球菌参考菌株、1株棒状杆菌参考菌株，来源于中国生物制品和药品鉴定所和悉尼大学感染性疾病和微生物中心；358株分枝杆菌临床分离株来源于深圳、广州和澳大利亚。结果所有分枝杆菌参考菌株均可扩增出200～250bp DNA片段，分枝杆菌引物可扩增4种诺卡菌和5种红球菌，但不与分枝杆菌属探针和种探针杂交。21个探针可鉴定分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、溃疡／海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌a／b和堪萨斯分枝杆菌c亚种及其他16种SGM。结论该方法能快速、简便和准确地鉴定SGM。     

喉鳞癌中HPV的免疫组化,原位杂交,PCR和间接原位PCR检测

目的 探讨ＨＰＶ与喉癌发生的关系。方法 采用免疫组化,原位杂交,ＰＣＲ和间接原位ＰＣＲ技术检测５０例喉鳞状细胞癌中的ＨＰＶ感染情况。结果 免疫组化衣壳抗原阳性６２例（１２％）,原位杂交阳性１３例（２６％）,ＰＣＲ阳性１０例（２０％）,原位ＰＣＲ阳性１７例（３４％）,综合上述方法阳性率为４２％（阳性２１例）。结论 ＨＰＶ感染与喉癌有着明显的关系,间接原位ＰＣＲ在检测ＨＰＶ感染时具有较高的敏感性,特异     

PCR结合导流杂交技术在育龄妇女α和β地中海贫血诊断中的应用

目的探讨PCR结合导流杂交技术诊断试剂盒在育龄妇女d和p地中海贫血诊断中的应用。方法以平均红细胞体积（MCV）〈80fl筛查出141表型阳性病例,凯普α-和β地中海贫血诊断试剂盒检测地贫。结果检测出80例存在α-地中海贫血,包括9种类型,常见类型为-SEA／α、α-／α-．α42／αα-,其中4例存在两种缺失;53例存在β-地中海贫血,包括11种类型,常见α-地贫基因型B4142、p654、B17、1328,其中2例存在两种突变;5例同时存在α-地贫和β-地贫;13例未检测到缺失或突变;同时还检测出5例MCV〉80fl的α-地中海贫血病例,其中1例合并β-地贫。结论本试剂盒优势为同一基因芯片上进行仅和β地贫的测定,缩短了检测时间,降低检测成本,减少复合地贫漏诊,适合基层实验室用于常见地贫的诊断。但仅能检测常见类型α-和β地贫,具有一定局限性,在出现该试剂无法检测到的地贫基因缺失或突变,而MCV〈80fl时,建议进行缺铁性贫血的筛查和地贫基因序列的检测。