人脐血CD34+细胞和贴壁细胞体外诱导树突状细胞及其鉴定

目的 从人脐血中不同的前体细胞扩增树突状细胞(DCs)，并对其进行鉴定。方法 用免疫磁珠法分离人脐血CD34^ 细胞，以GM—CSF、TNF-α、FL、SCF和IL-4诱导生成DC；用Ficoll分离脐血单个核细胞，2h贴壁后的细胞，以GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导生成DC。观察细胞形态，流式细胞仪分析表面标志(CDla、CD80、HLA-DR)，并检测其刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的细胞均具有典型的DC形态特征，表达高水平的DC分化抗原CDla，MHCⅡ类抗原递呈分子HLA—DR和CD80共刺激分子，并具有刺激同种异体T细胞增殖的能力。前者扩增DC的效率更高。结论 从人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞均可诱生出功能性DC，是DC理想的组织来源。     

A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的研究

目的 探讨用钙离子载体A23187通过钙动员机制使人急性粒细胞性白血病细胞系HL-60细胞迅速分化为树突状细胞(DCs)的方法,为今后临床用DCs进行抗白血病免疫治疗打下基础.方法 将生长良好的HL-60细胞加入不同浓度A23187(45～720 ng/mL)或联用重组人γ-干扰素(rhIFN-γ,1000 U/mL)培养20～96 h,倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征,流式细胞术检测其免疫表型,混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果 HL-60细胞加入适量A23187(180 ng/mL)或联合rhIFN-γ(1000 U/mL)诱导20 h后,即可出现细胞表面树状突起,且树突状细胞表面特异性成熟标志抗原CD83、共刺激分子CD80、CD86表达升高;培养48 h,CD83分子表达开始降低;培养72 h,可获得DC的典型形态,CD80、CD86分子表达持续升高.同种异体混合淋巴细胞反应检测经A23187或联用rhIFN-γ诱生的DCs可明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖.结论 钙离子载体可诱导HL-60细胞分化为高表达共刺激分子及具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的成熟DCs,钙动员有望成为一种快速获取DCs的有效方法.     

人外周血树突状细胞的分离培养及鉴定

目的从外周血中分离单个核细胞 ,经体外诱导培养获取高纯度的树突状细胞。方法淋巴细胞分离液分离外周血的单个核细胞 ,经贴壁 2h后加入GM CSF、IL 4诱导 7天 ,观察细胞形态 ,用流式细胞仪检测其表面标志 ,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结果经诱导生成的细胞具有典型的DCs形态特征 ,高表达CD83 、CD86和MHCⅠ、Ⅱ类分子 ,在体外能诱导强烈的同种异体淋巴细胞增殖反应。结论本研究所建立的经济、简便的从外周血获取大量成熟DCs的方法 ,为DCs的进一步研究奠定了基础。     

弱酸洗脱肽负载的树突状细胞激活T细胞的实验研究

目的采用弱酸洗脱提取人卵巢癌细胞膜表面的肿瘤抗原肽,用于负载脐血树突状细胞(DCs),观察其对混合T淋巴细胞的体外激活效应。方法以淋巴细胞分离液分离脐血中的单个核细胞(CBMNC),将其中贴壁的细胞在细胞因子重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组白介素(rhIL)-4及重组肿瘤坏死因子(rhTNF-α)的配伍作用下诱导分化为DCs。室温下以pH为3．3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液处理人卵巢癌细胞,洗脱液经Oasis HLB小柱提取纯化后负载DCs。以3H-TdR掺入法测定负载抗原的DCs对混合T淋巴细胞的体外活化效应。结果贴壁的CBMNC在细胞因子2 000 U／mL rhGM-CSF、500 U／mL rhIL-4及100 U／mL rhTNF-α的配伍作用下体外诱导分化为具有典型形态和表型的DCs。人卵巢癌细胞弱酸洗脱肽负载的DCs与混合T淋巴细胞体外共培养后,T细胞增殖加快。结论CBMNC可以在GM-CSF、IL-4和TNF-α的作用下体外诱导分化为功能性DCs。pH为3.3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液洗脱法可得到卵巢癌细胞的弱酸洗脱肽,用其负载脐血DCs,体外可激活细胞毒T淋巴细胞。     

人外周血树突状细胞的体外培养及鉴定

目的在体外从人外周血中培养、鉴定树突状细胞。方法取正常健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,取贴壁细胞加入重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4,体外培养第7天,加入肿瘤坏死因子-α促进其分化成熟。用倒置显微镜观察其形态,用流式细胞仪进行表型测定。结果从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养,获得大量树突状细胞。具有典型的树突状细胞形态和免疫表型,高表达HLA-DR,CD83,CD80,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。结论用rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞且高表达HLA-DR,CD80,CD83,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。     

钙离子载体A23187诱导人外周血单个核细胞生成树突状细胞

目的:研究钙离子载体(CI)A23187诱导健康人外周血单个核细胞(PBMNCs)生成树突状细胞(DCs),探索DCs扩增的新方法。方法:分离健康人PBMNCs,分别加入GM-CSF+IL-4,A23187。体外培养72 h后,于光镜、电镜下观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞的表面标志,MTT比色法检测其对同种异体T细胞的刺激增殖作用,ELISA法检测IL-12、IFN-γ的水平。结果:健康人PBMNCs在A23187的条件下培养72 h后,就可以看到典型的DCs形态,CD40、CD86、CD83分子的表达均明显增高,但CD1α分子的表达增高不明显。具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。IL-12、IFN-γ的水平比其他组明显增高。结论:健康人PBMNCs在钙离子载体A23187作用下能更有效地诱导生成成熟DCs。     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的：探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞（DC）分离培养树突状细胞的优化方法。方法：取正常成人新鲜血液，经密度梯度离心法，利用连续贴壁的方法获得单个核细胞，采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF—α）诱导产生成熟DC，倒置显微镜观察树突状细胞结构，流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果：连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC，所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10％胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83^＋HLA—DR^＋及CD80^＋CD86^＋。结论：采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞

目的 建立在体外从健康成人外周血单核细胞(Mo)诱导培养成熟的树突状细胞(DC)的方法.方法 采用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞(PBMC),再以黏附法分离出Mo,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)体外培养12天,并于培养第6天加入重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)共同培养,于倒置显微镜下观察细胞的形态,以流式细胞仪检测培养6、9、12天DC表面CD1a、CD83、CD86和MHC-DR的表达水平,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力,进行比较分析.结果 Mo经rhGM-CSF rhIL-4诱导培养6 d后,细胞成簇,表型为CD1a 53.2%、CD83 13.6%、CD86 65.5%、MHC-DR 75.4%;TNF-α诱导后,即培养第9 d,细胞表型为CD1a 62.1%、CD83 73.5%、CD86 92.3%、MHC-DR 98.4%,激发初始T细胞增殖的能力最强.结论 rhGM-CSF rhIL-4诱导Mo 6 d,可获得大量不成熟的DC,该体系有利于DC扩增;加入TNF-α,培养第9 d,DC成熟度最高,适合于临床免疫治疗.     

胶质瘤RNA致敏的人脐血树突状细胞诱导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的:制备人脐血来源的树突状细胞(DCs),用胶质瘤RNA诱导其成熟,并观察DCs诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性.方法:以rhGM-CSF、IL-4诱导人脐血单个核细胞向DCs分化并鉴定.提取胶质瘤RNA与DCs混合,使DCs致敏,未致敏的DCs为对照组.观察细胞形态并检测致敏前后DCs的表型.将DCs与外周血T细胞共培养,以胶质瘤细胞为靶细胞,采用MTT比色法检测T细胞抗肿瘤活性差异.结果:人脐血单个核细胞于诱导第5 d呈现典型的DCs形态;经rhGM-CSF、IL-4诱导培养后,CD86、CD11c、CD54、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子表达与培养前比较均明显增高(P＜0.01).负载抗原后,MHC-Ⅰ和CD54表达与负载抗原前相比进一步增高(P＜0.05).以DCs诱导活化的T细胞与胶质瘤细胞共培养可使胶质瘤细胞的生长受到抑制,并最终导致其死亡;杀伤率与未负载抗原的对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论:人脐血单个核细胞在细胞因子的诱导下扩增并分化为DCs.经抗原致敏后,能增强淋巴细胞对相应肿瘤细胞的体外杀伤效应.     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的:探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞(DC)分离培养树突状细胞的优化方法。方法:取正常成人新鲜血液,经密度梯度离心法,利用连续贴壁的方法获得单个核细胞,采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导产生成熟DC,倒置显微镜观察树突状细胞结构,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果:连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10%胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83 HLA-DR 及CD80 CD86 。结论:采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

舒芬太尼对人脐血树突状细胞免疫功能的影响

目的探讨舒芬太尼对人脐血树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法无菌条件下采集脐带血70 ml,经密度梯度离心法获得脐血单个核细胞,然后分3组进行培养。阴性对照组(N组):只加rhGM-CSF 50 ng/ml和rhIL-4 10 ng/ml培养10 d;阳性对照组(P组):在加入rhGM-CSF、rhIL-4培养的同时加入rhTNF-α50 ng/ml培养10 d诱导成熟树突状细胞;药物组(S组):加入rhGM-CSF、rhIL-4的同时加入舒芬太尼其浓度分别为(0.2、0.5、1.0)ng/ml(S_(0.2)、S_(0.5)、S_(1.0)培养10 d。培养过程中在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态学变化;以流式细胞仪分析各组细胞免疫表型CD80、CD86、CD83、HLA-DR分子的表达;ELISA法测定其分泌IL-12的水平;MTT法检测DCs刺激混合淋巴细胞的增殖能力。结果与N组比较,S组和P组细胞具有典型的树突状细胞形态学特征,CD80、CD86、CD83和HLA-DR分子的表达增加(P<0.05),促进同种异体混合淋巴细胞增殖的能力较强(P<0.05),IL-12表达增加(P<0.05);与P组比较,S组细胞随舒芬太尼药物浓度增加树突状伪足逐渐不明显,CD80、CD86、CD83和HLA-DR分子表达以及促进混合淋巴细胞增殖能力呈不典型的剂量依赖性下降趋势(P<0.05),IL-12表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论脐血来源的单个核细胞可在舒芬太尼的刺激下诱导为成熟的树突状细胞,但舒芬太尼对树突状细胞成熟和免疫功能的影响具有剂量依赖性下降趋势。     

脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞体外培养体系的优化

目的：优化脐血CD34^＋造血干细胞（HPC）来源的树突状细胞（DCs）诱导培养方法，为体外研究CD34^＋HPC诱导产生功能性树突状细胞（DCs）的影响因素奠定基础。方法：淋巴细胞分离液（Ficoll）分离获得脐血单个核细胞，免疫磁珠阳性分选CD34^＋HPC，并用流式细胞术鉴定CD34^＋HPC纯度：比较GT（GM-CSF＋TNF—α）方案和GTI（GM—CSF＋TNF—α＋IL-4）方案及GTI方案中TNF—α．和IL-4不同时段加入对诱导培养产生的DCs成熟的影响：通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞表型及3H—TdR检测DCs激发异体T细胞增殖能力。结果：免疫磁珠阳性分选CD34＋HPC纯度可达90％以上：将CD34＋HPC按GT方案和GTI方案进行培养，均可诱导产生DCs．但经GT方案诱导的DCsCD14表达较高，CD80、CD86、CD83、CD1a表达不如经GTI方案诱导的高；而GTI方案中，以TNF—α．0h加入、IL-448h加入诱导培养的DCs各表型表达相对较佳．并具有激发异体T细胞增殖能力。结论：CD34^＋HPC经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性DCs，以GM—CSF与TNF-α 0h加入、IL-448h加入的GM—CSF＋TNF—α＋IL-4方案更为可取。     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的探索脐血CD34 细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法。方法Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34 细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定。结果体外培养14d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P<0.05)。结论体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α,能够成功诱导脐血CD34 细胞分化为大量活力好的DCs。     

α-干扰素对脐血来源的树突状细胞分化成熟及功能影响的体外研究

目的：在体外探讨α-干扰素（IFN-α）对人脐血来源的树突状细胞（DC）分化成熟及功能的影响。方法：取lO份脐血分离单个核细胞,常规DC诱导培养条件中加入不同剂量的IFN—α（依剂量0、100、500U／m1分为A、B、C3组）。流式细胞仪分析CD83等细胞表面标志,ELISA检测IL-12等细胞因子的表达,MTT法检测DC对同种异体T淋巴细胞的增殖能力。结亲：在常规DC诱导培养条件中加入IFN—α培养的贴壁单个核细胞,在第5天即可见B、C组细胞表面呈树突状突起．第7天B、C组诱导的细胞其DC特异性表面标志CD83、HLA—DR、CD86较A组明显升高,且随IFN-α剂量增加而增加（P〈O．05）;B、C组分泌的细胞因子IL-12、IFN-γ较A组均增高,而IL-10较A组减少（P〈O．05）;B组和C组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力显著高于A组（P〈O．05）,又以T与DC比为10：1时最明显。结论：在常规DC诱导培养基础上．再加入IFN-α能进一步促进脐血单个核细胞向具有DC典型形态及更强功能的成熟DC转化。     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 探索脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法.方法 Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34+细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3 Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14 d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定.结果 体外培养14 d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P＜0.05).结论 体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α, 能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量活力好的DCs.     

人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较

目的比较从人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导树突细胞(DC)的方法及其特性.方法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,贴壁法获得单核细胞;经GM-CSF及IL-4诱导获得DC.磁性活化细胞分选系统(MACS)分选脐血CD34+细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等细胞因子诱导获得DC.用电镜、普通显微镜观察DC形态;流式细胞仪分析DC表型;同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)观察DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-α,脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等因子作用下,可生成DC,并表达相应的DC分化抗原CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR.脐血CD34+细胞具有较强的扩增能力,经2周诱导,体系细胞数可增加173.8士26.7倍,两种来源的DC均能刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.结论外周血单核细胞与脐血CD34+细胞,在体外均可诱导成DC,并具有相应的DC分化抗原和功能.     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

人脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 采用脐血CD34+细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞.方法 应用CD34+干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+细胞,用rhGM-CSF、rhTNF-α联合诱导分化发育14 d,成为成熟DC,观察细胞形态及检测CD83分子表达.结果 50 ml脐带血可分离出CD34+细胞约1.1×106,在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下CD34+干细胞培养2周,约扩增10～20倍.CD34+干细胞培养第3 d开始出现集落,第8～9天集落最大,CD34+干细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC,表面分子CD83阳性率为81.7%.结论 体外联合运用rhGM-CSF、rhTNF-α,能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量成熟的DCs.     

人脐血不同前体细胞体外诱导分化为树突状细胞的研究

目的从人脐血不同的前体细胞体外诱导分化树突状细胞(DCs),并对生成的细胞进行鉴定,探讨脐血在DC体外大量扩增的组织来源作用.方法用免疫磁珠法分离人脐血CD34 细胞,以GM-CSF、TNF-α、FL、SCF、IL-4诱导生成DC;用Ficoll分离脐血单个核细胞,2h贴壁后的细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导生成DC.电镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型,并检测其刺激同种T细胞增殖的能力.结果人脐血CD34 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的DC均具有典型的DC 形态特征,表达高水平的DC特异性标志CDla,MHCⅡ类抗原递呈分子HLA-DR和CD80共刺激分子.两种方法获得的DC的形态、CDla表面抗原的表达没有显著的差异,两者均具有刺激同种T细胞增殖的能力,前者扩增DC的效率更高.结论从人脐血中CD34 细胞和贴壁细胞两种DC的前体细胞均可诱生出DC,脐带血是DC理想的组织来源.     

不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导

目的：体外诱导小鼠骨髓来源的不同成熟状态树突状细胞(dendritic cells，DCs)。方法：rmGM—CSF体外培养小鼠骨髓细胞，5～6d后，利用磁性细胞分离器(MACS)分离CD11C^ 细胞，部分细胞加入rmTNFα继续培养1～2d，通过流式细胞仪检测分别检测细胞表面标志，同种混合淋巴细胞反应检测细胞的体外刺激能力。结果：小鼠骨髓细胞经rmGM-CSF培养5～6d，再经过MACS分离可获得大量未成熟DCs，细胞表面出现少量短而粗的突起，低水平表达MHCI／分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CD4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较弱：加入rmTNFα继续培养可获得成熟DCs，细胞表面出现大量细长突起，细胞表面高水平表达MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CI4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较强。结论：通过rmGM-CSF或rmGM-CSF rmTNFα体外培养体系可以获得大量未成熟DCs或成熟DCs，为进一步研究DCs的生物学功能提供实验基础。