核转录因子-κB-圈套抑制血管内皮细胞核转录因子-κB激活机制的探讨

目的:观察核转录因子(NF)-κB圈套(decoy)对脂多糖(LPS)刺激后人脐静脉内皮细胞NF-κB激活的抑制作用,并就其作用机制进行探讨。方法:获取和培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),平均分成4组。NF-κB-圈套组和错配-圈套组分别预先以NF-κB-圈套-Lipofectamine2000复合物和错配-圈套-Lipofectamine2000复合物(对照组)处理,LPS组和对照组分别加入同体积的培养液,观察荧光标记DNA转染细胞情况。用10μg/mlLPS刺激2h激活NF-κB,收集细胞,分别提取细胞核蛋白,检测不同组NF-κB活性以及P65和P50亚基蛋白质含量。结果:转染5h后大于90%细胞核内可观察到绿色荧光。NF-κB-圈套组NF-κBP65亚基活性显著低于错配-圈套组和LPS组,但P65和P50亚基蛋白质含量两组之间无显著差异。结论:NF-κB-圈套能抑制细胞核内NF-κB的DNA结合活性,这一作用可能是NF-κB-圈套转入细胞核后占据转录因子核定位区的结果。     

核因子-κB圈套对Kupper细胞活化的抑制作用及其机制

目的探讨核因子-κB（NF-κB）圈套对大鼠Kupper细胞（KCs）活化的抑制作用及其机制。方法分离大鼠KCs并随机分为3组：正常对照组、内毒素（LPS）刺激组及NF-κB圈套组，后者KCs在LPS刺激前转染NF-κB圈套。除对照组外，两个实验组培养液中加入终浓度为1mg／L的LPS。于LPS刺激6h后，凝胶电迁移率改变分析法（EMSA）检测NF-κB蛋白结合活性，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测KCs膜表面CD80mRNA表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-6表达情况。结果转染NF-出圈套可以高效抑制KCs激活。EMSA结果显示NF-κB活性仅为LPS组的0．53，RT—PCR结果显示KCs CD80 mRNA表达仅为LPS组的0．46，ELISA结果显示培养上清TNF-α表达量仅为LPS组的0、37，IL-6仅为LPS组的0．60。结论NF-κB圈套可以高效抑制NF—κB的转录活性，降低KCs膜表面共刺激分子和细胞因子的产生，为活体内应用NF—κB圈套提供了可靠的实验依据。     

9型重组腺相关病毒介导抗核转录因子-κB核酶基因体外转染大鼠心肌细胞及对核转录因子-κB活性的影响

目的 观察9型重组腺相关病毒(rAAV9)介导抗核转录因子-κB(NF-κB)核酶基因(rAAV9-ECFP-R65)对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对NF-κB活性的影响.方法 rAAV9-EGFP-R65按转染复数(MOI)1×106v.g./cell转染H9C2细胞,在倒置荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性表达,采用流式细胞仪检测转染效率.Alamar Blue法检测rAAV9-EGFP-R65对H9C2细胞增殖影响.肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、rAAV9-EGFP-R65及PDTC处理H9C2细胞,凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测NF-κB活性.结果 转染后第1天EGFP开始表达,表达强度随着时间延长而逐渐增强,第5天达到高峰,此时流式细胞仪检测转染率为(32.27±3.19)%.Alamar Blue法检测表明转染组细胞增殖末受影响.常态下H9C2细胞NF-κB有一定活性,TNF-α刺激后NF-κB活性明显增高,而rAAV9-EGFP-R65、PDTC抑制NF-κB活性.结论 rAAV9-ECFP-R65能够有效地转染H9C2细胞,对细胞增殖无明显抑制,并能显著抑制H9C2细胞NF-κB活性.     

转录因子核因子-κB p65通过miR-17调控血管平滑肌细胞增殖的机制研究

目的研究miR-17在血管平滑肌细胞(VSCM)增殖中的作用,以及转录因子核因子(NF)-κB调控miR-17的作用机制。方法将miR-17mimics转染人VSCM,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期。生物信息学预测NF-κB p65与miR-17启动子区存在结合位点,将pcDNA3.1-p65与报告基因载体p GL3-miR-17启动子区共转染至293T细胞中,通过检测荧光素酶报告基因Luc活性分析NF-κB p65对miR-17启动子区的影响。脂多糖(LPS)刺激细胞后,检测NF-κB p65、miR-17的表达水平。结果与miR-NC组相比,转染miR-17 mimics后,VSMC增殖能力增强,差异具有统计学意义(P0.05),细胞周期G0/G1期明显减少,S与G2/M明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。与miR-17启动子区结合位点突变型(Mutant)组相比,转染miR-17启动子区野生型(Wild)组荧光素酶Luc活性增高,差异具有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,LPS刺激细胞后,NF-κB p65、miR-17表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 NF-κB通过直接结合miR-17启动子区,促进miR-17的表达从而促进VSMC的增殖。     

胃癌细胞株核因子κB组成性激活对细胞增殖的影响

目的探讨胃癌细胞株是否存在核转录因子(NF)-κB组成性激活及对胃癌细胞增殖的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR法)和蛋白免疫印迹法(Westernblot法)检测4株不同分化程度的胃癌细胞株NF-κB的mRNA和蛋白表达,比较4株胃癌细胞株中NF-κB的转录和蛋白质表达水平的差异,并利用TransAMTMNF-κBP65试剂盒比较不同胃癌细胞株中P65亚基的蛋白活性差异。采用噻唑蓝(MTT)比色法观察NF-κB活性抑制剂PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)对胃癌细胞增殖的影响。结果4株胃癌细胞株中均存在NF-κB的组成性激活,且存在蛋白表达和活性差异。活化的P65亚基在MKN28、MKN45细胞株中表达较低,在AGS、SGC-7901细胞株中表达较高。经PDTC处理的实验组胃癌细胞的增殖明显受到抑制,对照组呈正常生长。结论胃癌细胞株中存在NF-κB组成性激活及P65蛋白表达差异。抑制NF-κB的活性可明显抑制胃癌细胞的增殖。     

核转录因子-κB组成性激活对胃癌细胞增殖的影响及其机制

目的 探讨胃癌细胞株是否存在核转录因子(NF)-κB组成性激活及其对胃癌细胞增殖的影响机制。方法 采用蛋白免疫印迹法(Western blot法)检测4株不同分化程度的胃癌细胞株NF-κB蛋白表达,比较4株胃癌细胞株中NF-κB蛋白质表达水平的差异。通过Trans AM~(TM)NFκBp65试剂盒来比较不同胃癌细胞株中p65亚基的蛋白活性差异。选取活性较高细胞株,观察吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对NF-κB活性的影响;利用噻唑蓝(MTT)法,分别观察24、48、72h,PDTC对细胞增殖的影响。并采用流式细胞分析技术(FCM)检测细胞的凋亡情况。结果 4株胃癌细胞株胞核中均存在NF-κB蛋白的表达,即存在NF-κB的组成性激活,且存在表达差异。活化的p50亚基在AGS细胞株中表达较低,在MKN28、MKN45、SGC-7901细胞株中表达较高;活化的p65亚基在MKN28、MKN45细胞株中表达较低,在AGS、SGC-7901细胞株中表达较高。经PDTC处理的实验组胃癌细胞,NF-κB的活性均被抑制(P<0.01);同时细胞表现为不同程度的增长抑制(P<0.01),FCM结果显示PDTC可诱导细胞的凋亡。结论 胃癌细胞株中存在NF-κB的组成性激活,并在不同的细胞株中存在表达差异。抑制NF-κB的活性可明显抑制胃癌细胞的增殖,其机制与PDTC所诱导的细胞凋亡有关。     

061氯胺酮抑制内毒素诱导的细胞核因子κB表达

细胞核因子κB(NF-κB)是转录多种基因时所必需的诱导型转录因子,包括促炎细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及白细胞介素6和8(IL-6,IL-8)的编码。大多数细胞质(包括脑细胞)含有潜伏性NF-κB蛋白并作为一种无活性的P50蛋白和P65蛋白异源体与抑制蛋白IκB相结合而共存。细胞与TNF-α或脂多糖(LPS,内毒素)接触引起包含体(IB)降解,则许可游离B蛋白易位进入细胞核并激活DNA链成为特殊基因编码,例如TNF-α基因。接着细胞内TNF-α基因增多,引起TNF-α mRNA转录.结果导致一系列细胞过程并释放TNF-α。     

胃癌及癌周淋巴细胞核转录因子-κB激活的临床意义

目的探讨胃癌及癌周浸润淋巴细胞核转录因子(NF)-κB激活状态对胃癌预后的影响。方法采用EnVision两步法对41例胃癌标本进行NF-κB检测;应用CD31、CD20、CD4、CD8单克隆抗体分别检测其微血管密度(MVD)及淋巴细胞亚型;并结合随访资料进行预后分析。结果本组28例有NF-κB组成性激活(68.3%),NF-κB激活与临床病理分期有关。NF-κB激活组MVD明显高于NF-κB阴性组(P=0.002),且生存期短于NF-κB阴性组。24例(58.5%)有癌周淋巴细胞NF-κB激活;淋巴细胞NF-κB激活与病理组织学分型无明显关系;TNMⅢ、Ⅳ期胃癌多缺乏淋巴细胞NF-κB激活(P=0.046)。癌周淋巴细胞NF-κB激活组预后优于NF-κB阴性组(P=0.0001)。结论胃癌细胞NF-κB组成性激活可促进肿瘤内新生血管形成及浸润性生长,从而导致患者生存期缩短;而癌周淋巴细胞的NF-κB激活可使机体抗肿瘤免疫反应增强,是预后良好的标志。     

白细胞介素-1β激活核转录因子-κB介导A549细胞分泌白细胞介素-8的研究

目的研究白细胞介素-1β(IL-1β)对肺II型上皮A549细胞分泌白细胞介素-8(IL-8)的诱导作用,探讨相关的细胞内信号通道的激活和传导的机理。方法以1ng/ml终浓度的IL-1β干预经核转录因子-κB(NF-κB)的IKK2复合物抑制物(AS602868)预处理的A549细胞,Western blot检测IL-1β干预后细胞内磷酸化IκBα(p-IκBα)和IκBα蛋白的表达水平;激光扫描共焦显微镜(LSCM)检测NF-κB的p65和p50蛋白的核转移过程;ELISA检测NF-κB的p65和p50蛋白与DNA结合活性及IL-8蛋白的释放。结果IL-1β干预后细胞内p-IκBα蛋白明显升高,IκBα蛋白明显下降;LSCM扫描显示p65和p50蛋白从胞浆向胞核转移,同时p65和p50与DNA结合活性明显升高(P<0.01);IL-8的蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。细胞经AS602868的预处理,阻断了细胞内p-IκBα蛋白升高和IκBα蛋白降解;减少了p65和p50蛋白的核转移和与DNA结合活性(P<0.01);降低了IL-8蛋白的表达水平(P<0.01)。结论IL-1β通过激活NF-κB介导了A549细胞分泌IL-8,结果提示可能通过抑制NF-κB信号通道的方法,减轻呼吸机相关肺损伤(VALI)的生物性损伤。     

NF-κB P65亚基siRNA增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡作用的实验研究

目的 探讨NF-κB P65亚基siRNA(NF-κB P65 siRNA)在体内外增强吉西他宾诱导胰腺癌细胞凋亡的作用及机制.方法 培养人胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1,分为空白对照组、阴性干扰序列对照组、吉西他宾组、NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组.MTT方法检测细胞增殖情况;Western blot方法检测NF-κB P65及凋亡相关蛋白的表达水平;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测胰腺癌细胞凋亡情况;电泳凝胶迁移实验检测NF-κB的DNA结合活性.BxPC-3接种裸鼠皮下建立胰腺癌移植瘤模型.治疗后监测肿瘤体积;TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡指数.结果 转染后72 h,与其他组相比,联合治疗组显著降低了细胞活力指数(P<0.05),下调了Bel-2和proeaspase-3的表达水平,同时上调了Bax的表达水平;流式细胞仪检测结果显示,联合治疗组细胞凋亡率高于其他组(P<0.05);EMSA实验结果证实,NF-κB P65 siRNA组和联合治疗组NF-κB的DNA结合活性低于对照组(P<0.05).联合治疗能够通过诱导凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长(P<0.01).结论 NF-κB P65 siRNA可以通过抑制NF-κB的DNA结合活性,调控凋亡相关蛋白的表达水平,激活线粒体凋亡途径,从而增强吉西他宾对胰腺癌细胞的促凋亡作用.     

抑制核转录因子κB活性对SGC7901/VCR细胞mdr1表达及凋亡的影响

目的 观察突变型IκBα抑制核转录因子κB(NF-κB)活性对耐药胃癌细胞株SGC7901/VCR中多药耐药基因1(mdr1)的表达及细胞凋亡的影响.方法 突变型IκBα真核表达重组体(pCMV4-mIκBα)经脂质体介导转染至SGC7901/VCR细胞中,凝胶迁移率实验(EMSA)检测SGC7901/VCR细胞核内NF-κB活性,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测细胞内mdr1的表达,荧光分光光度法检测罗丹明123(Rh123)的胞内聚集,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 pCMV4-mIκBα瞬时转染人SGC7901/VCR细胞24 h后,可显著抑制NF-κB活性达64%,抑制mdr1的表达达75%,使Rh123在细胞内的聚集增加2.3倍.转染24 h后SGC7901/VCR细胞凋亡率为(14.15±1.52),与对照组(4.37±1.31)比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 突变型IκBα抑制NF-κB活性对耐药胃癌细胞株mdr1的表达有直接抑制作用,并促使耐药胃癌细胞凋亡.     

S100A10基因沉默对人软骨细胞内核转录因子NF-κB活性的影响

目的针对人S100A10基因设计siRNA序列并构建shRNA表达载体;重组载体转染人关节软骨(HCs)细胞,观察细胞内S100A10基因表达及其对细胞内核转录因子κB(NF-κB)活性的影响。方法登陆美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库,根据人钙结合蛋白A10(S100A10)基因信息,设计3条针对其编码区(CDS)区的小干扰RNA(siRNA)序列。根据设计的siRNA序列,设计两条互补的shRNA序列,构建shRNA重组表达载体;阳离子脂质体法转染shRNA重组表达载体到HCs细胞,转染后48 h,收集细胞,提取细胞总RNA及总蛋白,使用实时PCR(RT-PCR)及蛋白质印迹法(Western blot)的方法检测转染后细胞中S100A10 mRNA及蛋白相对含量;Western blot检测细胞内NF-κB的P65及P50亚基磷酸化。数据统计使用单因素方差分析。结果成功设计siRNA序列并成功构建了shRNA表达载体;mRNA及蛋白含量检测结果显示,三条siRNA序列对目的基因均有沉默效果,其中1号siRNA序列最为-有效,其转染后48 h,细胞内mRNA及蛋白含量相比较未转染组细胞,分别下降了74.2%和76.4%,差异均有统计学意义(t=5.21,P0.01);HCs细胞内S100A10基因沉默,能够明显抑制核转录因子NF-κB活性,与对照组比较,P65及P50亚基磷酸化明显减弱(t=3.02,P0.01)。结论 S100A10基因沉默可以有效抑制HCs细胞内NF-κB活性。     

豚鼠哮喘模型单个核细胞及嗜酸细胞与肺微血管内皮细胞粘附性的研究

目的观察哮喘豚鼠模型嗜酸细胞和淋巴细胞与肺微血管内皮细胞的粘附率,探讨肺微血管内皮细胞在哮喘模型发病中的功能变化及炎症细胞与其粘附的分子基础.方法复制豚鼠哮喘模型;分离、培养和鉴定肺微血管内皮细胞;转染核因子(NF)-κB反义寡核苷酸;分别用对照组血清和模型组血清孵育;分离外周血淋巴细胞和嗜酸细胞;采用RT-PCR法测定内皮细胞和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)及嗜酸细胞趋化因子(eotaxin)mRNA的表达强度,EMSA法测定内皮细胞NF-κB、活化蛋白(AP-1)的DNA结合活性.结果(1)肺微血管内皮细胞在模型组血清刺激下,与两组外周血淋巴细胞及仅与模型组嗜酸细胞的粘附率显著升高,内皮细胞与嗜酸细胞两者的激活,在嗜酸细胞粘附中起明显的协同作用;(2)肺微血管内皮细胞经模型组血清刺激后,VCAM-1和eotaxin mRNA表达量显著增多,NF-κB、AP-1的DNA结合活性也显著升高.结论肺微血管内皮细胞可被哮喘模型血清激活,使粘附分子、趋化因子及核转录因子的合成和分泌增多,从而显著提高其与炎症细胞的粘附率,核转录因子NF-κB和AP-1对内皮细胞合成炎症因子可能起调控作用.淋巴细胞与嗜酸细胞的粘附机制不尽相同.     

核转录因子-κB小干扰RNA转染对食管癌细胞化疗敏感性的影响

我们通过小分子干扰RNA(siRNA)阻断核转录因子(NF) -κB信号通路,观察其对食管鳞癌细胞增殖及化疗敏感性的影响.一、材料与方法构建NF-κB p65 siRNA载体质粒“p65 siRNA”及无义序列质粒“HK”并转染食管癌Eca109细胞,转染72 h后将细胞分为:(1)对照组:未转染Eca109细胞;(2) HK组:Eca109细胞转染HK;(3) p65siRNA组:Eca109细胞转染p65siRNA.     

核因子κB圈套策略对膀胱癌细胞侵袭力的影响

目的 探讨核因子(NF)-κB环状哑铃型圈套寡核苷酸(CD-ODN)对膀胱癌NF-κB活性和细胞侵袭能力的影响以及有关的作用机制.方法 脂质体介导法瞬时转染CD-ODN及其突变体(CD-ODN-mut)入膀胱癌BIU87细胞株,荧光素酶报告基因的方法检测不同处理组NF-κB活性的改变;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western-blot检测尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的表达水平;重建基底膜试验检测细胞侵袭能力的变化.结果 转染CD-ODN后BIU87细胞株NF-κB活性被抑制,uPA的表达水平下降,细胞侵袭能力减弱,而转染CD-ODN-mut后无此作用.结论 NF-κB组成性活化可促进uPA的表达,从而导致膀胱癌细胞的侵袭和转移.而CD-ODN能有效的阻断这一通路,降低膀胱癌的侵袭潜能.     

抑制心内直视术中核转录因子激活保护心肌研究

心肌在缺血再灌注中产生的氧自由基可激活心肌细胞核转录因子（NF-κB），后者进入细胞核启动有关基因的转录，导致合成多种炎性细胞激酶和白细胞粘连分子，从而引起白细胞黏附浸润，释放氧自由基，损伤心肌。有研究将抑制NF-κB激活的制剂用于这一病理过程，心肌损伤减轻。我们在人类体外循环（CPB）心内直视手术中研究NF-κB的激活与心肌白细胞浸润及损伤的关系，并观察氧自由基清除剂辅酶Q10对NF-κB激活的抑制作用及其对心肌的保捎傩用。     

脂质体介导NF-κB圈套寡核苷酸体外转染Kupffer细胞的实验研究

目的 研究核因子κB(NF-κB)圈套寡核苷酸(decoy oligodeoxyribonucleotide,ODN)体外借助阳离子脂质体转染大鼠Kupffer细胞(KCs)的效率,并观察其对KCs活化的抑制作用.方法 24只Wistar大鼠分为3组,每组8只.(1)对照组:分离培养正常大鼠KCs;(2)LPs组:KCs培养液中加入终浓度为1 ms/L的LPS作为刺激因素;(3)NF-κB圈套寡核苷酸组:先用阳离子脂质体(lipofectamine)将人工合成的NF-κB圈套寡核苷酸转染KCs(4μg/1×105个KCs),观察转染效果,再用1 mg/L LPS刺激,观察其对KCs活化的抑制作用,包括KCs的吞噬功能、NF-κB易位,以及膜表面分子CD4O mRNA的表达.结果 在LPS刺激下,KCs呈高度活化状态,吞噬功能增强,NF-κB向细胞核移位,细胞膜表面共刺激分子CD40 mRNA呈高表达状态,与对照组相比差异有统计学意义(t=4.01,P<0.01).在阳离子脂质体介导下,人工合成的NF-κB圈套ODN可以高效转染KCs,有效地抑制NF-κB活化,降低其下游基因的表达,与LPS组相比差异有统计学意义(t=4.89,P<0.01).结论 在脂质体介导下,NF-κB圈套寡核苷酸可以高效转染KCs,并有效抑制KCs的活化.     

核因子кB诱捕物寡核苷酸对肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响

目的 研究核因子(NF)κB结合位点诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)对肾小管上皮细胞的NF-κB活性及下游炎症因子表达的影响。方法 (1)鱼精蛋白-脂质体法转染NF-κB decoyODN:将NF-κB decoy ODN与鱼精蛋白、脂质体混合,转染至TNF-α刺激培养的大鼠肾小管上皮细胞内,测定转染率。(2)凝胶电泳迟滞分析测定转染 NF-κB decoy ODN后细胞NF-κB活性。(3)RT-PCR方法检测转染NF-κB decoy ODN后细胞 ET-1、iNOS、ICAM-1、VCAM-l以及MCP-1 mRNA表达水平。结果 当+/-比例为4时,鱼精蛋白-脂质体法转染率高达93.20％;转染NF-κB decoy ODN可抑制TNF-α激活的NF-κB活性,从而进一步抑制ET-1、iNOS、ICAM-1、VCAM-I和MCP-1的mRNA表达。结论(1)鱼精蛋白-脂质体法是一种不受血清影响的高效率转染方法。(2)NF-κB decoy ODN在体外通过抑制NF-κB活性,进而影响肾小管上皮细胞炎症因子的表达。     

创伤小鼠脾细胞核因子-κB的表达及与全身炎症反应综合征发生的关系

目的探讨创伤后不同时相点脾细胞核因子-kappaB(NF-κB)的DNA结合蛋白和NF-κB P65蛋白亚型表达的动态变化.方法采用小鼠双后肢闭合性砸伤+骨折模型,于创伤后1、4、7d处死动物,分离、纯化脾细胞,提取脾细胞核蛋白.用电泳迁移率改变试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测NF-κB的DNA结合活性,用免疫蛋白印变法(Western blotting)检测NF-κB P65蛋白亚型表达.结果NF-κB的DNA结合活性在创伤后1、4、7d表达明显增加.NF-κB P65蛋白亚型在创伤后1、4、7d表达明显增高.结论创伤可明显增强脾细胞NF-κB的DNA结合活性和P65蛋白亚型的表达,在创伤后淋巴细胞活化及全身炎症反应综合征(SIRS)发生、发展过程中可能起重要作用.     

镧对内毒素/脂多糖诱导的巨噬细胞核因子KB活化的抑制作用

目的了解稀土元素镧对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)核因子κB(NF-κB)活化的影响,并探讨其机制。方法分离培养小鼠腹腔 Mφ,分为:空白对照组,无刺激因素;LPS 组,用1μg/ml LPS 刺激30 min;镧离子(La~(3 ))组,用2.5 μmol/L La~(3 )刺激30 min;La~(3 ) LPS 组,先后用2.5μmol/L La~(3 )、1μg/mI LPS 各刺激30 min;La~(3 )/LPS 组,2.5μmol/L La~(3 )刺激30 min 后,洗涤细胞,再加入1μg/ml LPS 刺激30 min。采用细胞免疫荧光染色法观察 NF-κB在各组细胞中的分布与表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法捡测胞核中 NF-κB/p65蛋白活性;蛋白质印迹法检测细胞核内 NF-κB/p65蛋白及胞质中核因子抑制蛋白α(IκBα)的表达量。ELISA 法测定各组细胞培养上清液中肿瘤坏死冈子α(TNF-α)的含量。结果 (1)免疫荧光染色显示,空白对照组、La~(3 )组、La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组 Mφ绿色荧光多分布于胞质,胞核荧光强度分别为42±7、73±30、48±11和67±19;LPS 组绿色荧光集中于胞核,荧光强度为116±14,明显高于其余4组(P<0.01)。(2)胞核 NF-κB/p65蛋白活性:LPS 组吸光度值为0.435±0.066.与空白对照组(0.048±0.027)、La~(3 )组(0.062±0.049)、La~(3 ) LPS 组(0.066±0.031)、La~(3 )/LPS 组(0.108±0.017)比较,明显偏高(P<0.01)。(3)LPS 组 Mφ胞核 NF-κB/p65蛋白表达水平明显高于其余4组,胞质 IκBα蛋白表达水平明显低于其余4组。(4)TNF-α含量:La~(3 )组培养上清液中 TNF-α含量低于试剂盒检测下限(25 pg/ml)及空白对照组(P<0.05),La~(3 ) LPS 组和 La~(3 )/LPS 组低于 LPS 组(P<0.01),但高于空白对照组。结论 LPS 可激活小鼠腹腔 MφNF-κB/p65核移位,并使胞核中 NF-κB/p65的表达量和活性升高、胞质 IκBα蛋白表达下调,导致 TNF-α分泌增多。镧可抑制上述效应。