凋亡抑制基因Survivin的表达在肿瘤预后评估中的作用

目的：克隆、表达SW基因，并探讨其在肿瘤预后中的作用。方法：从人白血病细胞系HL60提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出SW基因片段。将SVV基因片段插入载体pGEM-T Easy中，经全自动序列分析仪测序正确后用NdeⅠ／XhoⅠ双酶切，亚克隆到原核表达载体pRSET-C中，构建重组表达载体pRSET-c-SW，并转化大肠杆菌BL2l菌株。取工程菌，经IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE鉴定并初步纯化。结果：经RT-PCR，测序和酶切鉴定，成功地克隆了人SW基因；经IPTG诱导的重组质粒pRSET-C-SW表达出相对分子质量约为16500u的蛋白，与预期的结果相符。结论：成功克隆了人肿瘤细胞的抗凋亡基因SW，并在大肠杆菌BL2l中表达出SW蛋白。该基因的高效表达为进一步探讨以SVV为基础的肿瘤的防治及预后判断提供工具。     

大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子(BDNF),探讨其原核表达BDNF的可行性。方法:大鼠BDNF进行密码子优化,人工合成BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中,将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果:PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体构建成功,IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测,其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论:经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体,具有一定的生物活性。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）基因，构建原核表达载体，并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段，插入克隆载体pMD18-T，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段；含pET28a／HXGPRT的宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物，Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别，获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因，构建pET28a／HXGPRT重组质粒，并高效表达．为进一步研究提供了条件。     

人血管内皮生长因子DNA克隆和在大肠杆菌中的表达

克隆人血管内皮生长因子165(Vascular endothelail growth factor165，VEGF165)并在大肠杆菌中诱导表达。用RT-PCR法从人白血病细胞株TF1扩增VEGF165 DNA片段，将该片段插入质粒pUCmT中并测序鉴定。将测序正确的pUCmT-VEGF165与PET20b( )均用EcoRI和SalI双酶切，回收纯化目的基因片段与表达载体，构建VEGF165的原核表达载体PET20b( )-VEGF165，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，IPTG诱导表达，表达产物用Ni-NTA Resin纯化，SDS-PAGE及Western Blot鉴定重组蛋白。结果表示：1．测序结果示扩增的VEGF165序列与文献报道相符；2．SDS-PAGE电泳示IPTG诱导后出现分子质量约23kd的重组蛋白条带；3．Western Blot分析表明重组蛋白可与兔抗人VEGF单克隆抗体特异性结合。成功克隆、表达及纯化VEGF165，为研究其功能奠定基础。     

BDNF的克隆及pTAT/HA-BDNF重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pTAT/HA-BDNF,探讨TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病的可行性。方法:从胚胎脑组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得编码人BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到含有TAT蛋白转导结构域序列的原核表达载体pTAT/HA上,将重组质粒pTAT/HA-BDNF转化大肠杆菌E.coli DH5α,筛选阳性克隆并酶切鉴定。结果:酶切鉴定及测序显示完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体的构建成功。结论:经RT-PCR扩增得到特异性BDNF基因片段并成功构建pTAT/HA-BDNF重组表达载体。     

构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体

目的：构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体，并对其进行克隆表达。方法：实验于2004—12／2005—12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成。以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板，PCR扩增Loa22基因去信号肽片段，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切、PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒克隆。经DNA测序正确后，转化大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达，通过SDS—PAGE鉴定表达产物。结果：PCR获得长516bp的片段。Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45000的融合蛋白。结论：制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体，为钩体新型疫苗的研究奠定基础。     

GST-IRS-4原核表达载体的构建、表达及抗GST-IRS4多克隆抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达胰岛素抵抗受体底物-4(insulinreceptorsubstrate4,IRS4)与谷胱甘肽-S转移酶的融合蛋白,并制备抗IRS4的多克隆抗体(pAb)。方法:从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出IRS4PTB结构域的cDNA,克隆入表达载体pGEX-Teasy中,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-IRS4蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,包涵体经变性复性后,通过亲和层吸法纯化表达的GST-IRS4融合蛋白,并以此为抗原制备pAb。Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果:酶切及测序鉴定证明,IRS4基因已正确插入到pGEX-Teasy中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为44ku的融合蛋白。用Westernblot鉴定所制备的多克隆抗体可以与IRS4特异性结合。结论:IRS4片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到多克隆抗体,为检测IRS4及其在其他组织中的表达,进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)的结构和生物学功能奠定基础。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的克隆、表达及纯化鉴定

目的构建编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区基因片段的原核表达载体,并表达、纯化及鉴定蛋白。方法从临床标本中分离鉴定MRSA,设计针对编码PBP2a转肽酶区基因片段的引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,克隆至pET28a(+)载体,双酶切鉴定并测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS株;用0.7mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,利用Ni亲和层析技术纯化目的蛋白;蛋白免疫印迹法(WB)鉴定重组蛋白。结果重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切,产物在预期大小处出现条带,测序结果显示有两个碱基突变,无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和WB鉴定,在相对分子质量38×103处可见一新生蛋白条带。结论成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体,并获得了高效表达,制备了高纯度的目的蛋白。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。