携自杀基因微泡转染卵巢癌细胞株SKOV_3的超声参数及转染效率

目的:探究超声介导携Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv1tk)自杀基因微泡转染SKOV3细胞的超声参数及转染效率.方法:超声在不同微泡浓度与辐照时间(8,15,30,60s间隔1s)组合下辐照SKOV3细胞,MTT法筛选最适辐照时间和微泡浓度.将实验分成6组分别进行以下处理:超声辐照组,脂质体+超声辐照组,脂质体+微泡+超声辐照组,微泡+超声辐照组,裸质粒组(阴性对照),脂质体组(阳性对照).用裸质粒及脂质体处理后分别转染pcDNA3.1-EGFP/hsv1tk质粒;采用荧光显微镜、流式细胞技术分别定性和定量检测各组转染效率;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测hsv1tk基因的表达.结果:MTT检测在超声强度0.5W/cm2,频率1MHz,微泡浓度0.56×1011个/L,辐照时间8s间隔1s条件下,超声辐照微泡转染对细胞活性无明显抑制.经此条件转染后荧光显微镜下可观察到脂质体+微泡+超声辐照组的绿色荧光强度最强;流式细胞技术检测表明,微泡+超声辐照组转染效率为(11.74±0.19)%,比超声辐照组(2.19±0.22)%高,而脂质体+微泡+超声辐照组(25.62±0.08)%均高于其他各组(P<...     

超声微泡促腺病毒载体转染MDR1基因效率的体外实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在体外促进腺病毒载体介导的MDRl基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,并初步探讨其安全性.方法 根据是否加入超声微泡造影剂和超声辐照将分选的兔骨髓单个核细胞分为常规培养组(A)、腺病毒MDRl基因转染组(B)、腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(C)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染组(D)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(E).收集各组细胞,应用RT-PCR法、流式细胞技术等分别从基因、功能及细胞生物学特性等方面检测外源性MDR1基因在骨髓单个核细胞内的功能性表达及安全性.结果 收获高滴度的Ad5-MDR1腺病毒载体并成功制备腺病毒微泡造影剂;RT-PCR结果 显示,除A组外其余4组在194 bp处均观察到特异性MDR1电泳条带,证实外源性MDR1基因通过腺病毒载体整合到细胞基因组中,且E组MDR1电泳条带的光密度比值明显高于B、C、D组(P<0.05);柔红霉素排出实验证实外源性MDR1基因表达产物P-gP有药物外排泵功能,且E组P-gp阳性率最高(P<0.05),而柔红霉素阳性率显著降低;一定强度的超声辐照及微泡造影剂对骨髓单个核细胞的细胞周期无明显影响.结论 低频超声波击碎微泡造影剂,能促进以腺病毒为载体介导的外源性MDR1基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,且安全可行.     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N_1质粒转染HGFs的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡介导pEGFP-N_1质粒转染人牙龈成纤维细胞的可行性、优化转染的条件及转染效率.方法 体外原代培养HGFs.以pEGFP-N_1质粒为报告基因,微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N_1转染HGFs.实验组分为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组按不同的转染条件分成亚组.转染48 h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,MTT检测HGFs活性.结果 超声微泡介导pEGFP-N_1质粒对HGFs的转染效率明显高于其他实验组(P<0.05).优化转染条件后,频率300 KHz,声强1.5 W/cm~2,连续波,辐照时间60 s,微泡浓度10%,质粒浓度6.67 μg/ml时,转染率较高.结论 在一定条件下,超声微泡造影剂能够促进外源基因对HGFs的转染.     

超声联合微泡造影剂携p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的实验研究

目的 探讨超声联合微泡造影剂介导野生型p53(wtp53)基因转染宫颈癌HeLa细胞的可行性、效率性及作用效果.方法 以前期实验所筛选的超声辐照参数(300 kHz,0.5 W/cm~2,30 s)为实验条件,将HeLa细胞分为质粒组(A组)、质粒+超卢组(B组)、质粒+超声+微泡组(C组)、质粒+脂质体组(D组)、空白对照组(E组),分别进行处理.转染24～48 h后,收集各组细胞,荧光显微镜观察细胞基因转染效率、RT-PCR检测p53 mRNA表达,流式细胞仪检测细胞周期,M1Tr检测细胞增殖抑制情况.结果 荧光显微镜下见C、D组均有较多绿色荧光蛋白表达的细胞(转染率分别为14.15%和10.86%),B组仅有极少的荧光细胞(0.81%);A组和E组无荧光表达;RT-PCR结果 显示,C组和D组均可见特异性p53电泳条带,C组的电泳条带的光密度比值高于D组(P<0.05);流式细胞仪测细胞周期展示,转染野生型p53基因能使细胞周期出现明显的G_1期阻滞,C、D组与E组相比差异有显著性(P<0.05);MTT测定结果 显示c组细胞生长明显受抑,且随时间的延长,抑制程度逐渐增强.结论 适当浓度的微泡和优化的超声辐照条件可增强基因转染效率,野生型p53基阒能使HeLa细胞产生G_1期阻滞,抑制宫颈癌细胞生长.     

微泡造影剂结合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染大鼠移植静脉的实验研究

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导基因转染移植静脉桥的可行性.方法 建立SD大鼠颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,选择增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)为报告基因.将大鼠颈外静脉段浸泡入粘附质粒的微泡中,予超声照射,再将静脉段间置植入颈总动脉,7 d后,取出静脉段行快速冰冻切片,荧光显微镜下观察血管平滑肌内荧光表达,同时进行苏木精-伊红染色行病理观察.结果 微泡造影剂结合超声辐照组的荧光强度显著高于质粒浸泡+超声辐照组、质粒+微泡造影剂组及单纯质粒浸泡组(P<0.05).苏木精-伊红染色观察血管组织并无坏死灶出现.结论 微泡造影剂结合超声辐照可以实现基因靶向转染至大鼠移植静脉桥的血管平滑肌中.     

超声辐照携带miR-520c-3p和miR-132微泡对卵巢癌A2780/DDP细胞生物学活性影响及其机制研究

目的 探讨超声辐照携带miR-520c-3p和miR-132微泡对卵巢癌A2780/DDP细胞生物学活性影响,并进行机制研究。方法 将对数生长期的A2780/DDP细胞随机分为A组(空白对照)、B组(微泡造影剂+超声辐照)、C组(miR-520c-3p mimics+miR-132 negative control+微泡造影剂+超声辐照)、D组(miR-132 mimics+miR-520c-3p negative control+微泡造影剂+超声辐照)、E组(miR-520c-3p mimics+miR-132 mimics+微泡造影剂+超声辐照),48h后收集细胞。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)测定miR-520c-3p、miR-132表达水平以及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)信使核糖核酸(mRNA)相对表达量,蛋白免疫印迹法测定GPC3和Hippo信号通路蛋白相对表达量。MTT法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果 与A组和B组比较,C组和E组miR-520c-3p表达水平显著上调,D组和E组m...     

超声联合SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的研究

目的 探讨超声协同微泡造影剂SonoVue介导荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的方法.方法 以不同的超声辐照时间、超声机械指数和不同浓度的微泡造影剂SonoVue的参数组合,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,接种于6孔板中,以荧光显微镜观察观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率.结果 当微泡造影剂SonoVue浓度为40%、超声机械指数为1.0、辐照时间5 min时,质粒的转染率最高(28.11±1.63)%.结论 超声联合微泡造影刺SonoVue能够作为载体介孚质粒转染细胞,但需优化各项超声辐照的条件以达到最佳效果.     

超声联合微泡介导缺氧诱导因子-1α基因转染293T细胞的实验研究

目的:探讨超声联合微泡造影剂介导缺氧诱导因子(HIF)-1α基因转染人胚肾293T细胞的转染效率。方法:将6孔板中的293T细胞悬液分为3组,A组:质粒+超声辐照组,加入质粒,终浓度为15μg/孔;B组:载基因微泡+超声辐照组,加入载基因质粒微泡混合液,质粒的终浓度为15μg/孔,微泡的终浓度为200μl/孔;C组:对照组,每孔中仅加入单纯质粒DNA,终浓度15μg/孔。A组和B组均接受超声辐照,超声照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,辐照时间30s。超声辐照转染48h后,用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性定量观察各组细胞基因的转染效率。结果:转染48h后,荧光显微镜观察到转染成功的细胞内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组的基因转染效率分别为(5.6±0.5)%、(30.5±1.0)%、(0.1±0.1)%。结论:超声辐照联合微泡能够介导治疗性基因的体外细胞转染,为冠心病心肌缺血的HIF-1α基因治疗奠定基础。     

超声微泡破碎技术促进人MxA基因在小鼠肝脏转染的实验研究

目的:观察静脉注射基因和微泡声学造影剂,同时经皮超声辐照肝脏的方式是否能增强外源MxA基因在小鼠肝脏中的定位表达,并探讨不同辐照参数对该基因表达的影响.方法:(1)不同转染方法对转染效率的影响:采用昆明小鼠24只,随机分为4组.分别为质粒转染组、微泡+质粒组、超声+质粒组和微泡+超声+质粒组.7 d后分别取肝、心、脾、肾、肺和骨骼肌,采用间接免疫荧光法进行MxA蛋白的半定量检测.(2)不同辐照参数对基因表达的影响:采用昆明小鼠20只,随机分为4组.按转染不同超声辐照声强分为0.25 W/cm2组、0.5 W/cm2组、0.75 W/cm2组和1.0 W/cm2组.7 d后分别取肝组织,采用间接免疫荧光法进行MxA蛋白的半定量检测.结果:(1) 肝脏每高倍视野表达阳性细胞数在微泡+超声+质粒组最高,其次为超声+质粒组,再次为微泡+质粒组,表达最少的为质粒组;各组间两两比较,均有显著统计学差异(P<0.001);超声+微泡+质粒组中检测发现,脾组织偶有MxA表达阳性细胞,其余各组仅在肝组织存在MxA表达.(2)肝脏每高倍视野表达阳性细胞数0.5 W/cm2组最高,其次为0.75 W/cm2组,再次为1.0 W/cm2组,0.25 W/cm2组表达最少;各组间两两比较,均有显著统计学差异(P<0.001).结论:超声微泡破碎技术能显著增强外源MxA基因在小鼠肝脏中的靶向性表达;超声辐照频率不变的条件下,在一定范围内增加声强,能促进外源MxA基因在小鼠肝脏表达;当声强为0.5 W/cm2时,转染率最高;该技术生物安全性好,为肝脏疾病的基因治疗提供了一项高效、安全的转染技术.     

负载LMP－1基因的树突状细胞诱导CTL对鼻咽癌细胞的杀伤效应

目的：探讨超声联合微泡造影剂能否增强绿色荧光蛋白（GFP）质粒pEGFP—C3－LMP－1转染树突状细胞（Dendriticcells,DC）,进而探讨转染LMP－1基因的DC诱导细胞毒性T淋巴细胞（cTL）对鼻咽癌（NPc）细胞株的体外杀伤作用。方法：体外培养的人DC分为四组：①单纯质粒组（A组）：加入质粒;②超声照射组（B组）：质粒＋超声辐照;③微泡造影剂组（c组）;质粒＋微泡造影剂;④超声＋微泡造影剂组（D组）：质粒＋微泡造影剂＋超声辐照。荧光显微镜观察GFP质粒在DC内的表达,流式细胞仪评价GFP质粒的转染效率。另将体外培养的DC分为两组用于检测DC表面袁型的表达及体外杀伤实验：①空白对照组,单纯培养的DC;②基因转染组,具体实验方法同上述D组。流式细胞仪检测DC表面分子表型的表达。DC和T细胞混合共培养获得的CTL为效应细胞,LMP－1表达阳性的NPC细胞株C666—1为靶细胞,按效靶比10：1的比例混合培养24h后,MTT法检测CTL对靶细胞的杀伤作用。结果：D组DC内有较多的绿色荧光表达,且转染效率最高（14．86±2．36）％,和其余各组均有显著性差异。LMP—1基因转染组DC表面标志CD80、CD83、cD86、CD40、HLA—DR的表达明显高于对照组。所诱导产生CTL对靶细胞有明显的杀伤作用,其杀伤效率为（41．72±3．53）％,明显高于空白对照组（7．62±2．36）％。结论：超声联合微泡造影剂可有效地介导GFP质粒转染DC。LMP－1基因转染组De诱导产生特异性的CTL对靶细胞有明显的杀伤作用。