干式融化箱与水浴锅复苏细胞因子诱导的杀伤细胞的比较

目的对比干式融化箱与水浴锅复苏冻存细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）的效果。方法提取10份健康志愿者外周血单个核细胞分别诱导培养CIK细胞并冻存于一80℃冰箱。1个月后从每份CIK细胞中取出相同的两个冻存管,分别采用干式融化箱和水浴锅进行复苏。记录复苏时间,检测复苏后细胞存活率及对K562细胞的杀伤作用。结果干式融化箱较水浴锅复苏时间较长[（4．33±0．19）min、（2．47±0．30）rain],差异有统计学意义（P〈0．05）。但两种方法复苏的CIK细胞存活率[（89．55＋5．36）％、（89．86±4．63）％]和对K562细胞的杀伤活性[（44．76±9．53）％、（46．97±10．17）％]差异无统计学意义（P〉0．05）。结论干式融化箱可以代替水浴锅进行冻存CIK细胞复苏。     

传统及改良纱布包裹冻存法对人血管内皮细胞保护的比较*

背景：传统的细胞冻存多采用4,-20 ℃放置的阶梯式降温方法,程序复杂且浪费时间。 目的：比较传统法与改良冻存法对血管内皮细胞的保护效果。 方法：将常规培养的人血管内皮细胞用胰酶消化后,用配置好的冻存液(10%二甲基亚砜、体积分数60%胎牛血清、30%DMEM无血清培养基)调整浓度,将细胞悬液吸入冻存管,分组干预：实验组以纱布包裹,并直接投入-80 ℃冰箱;对照组按常规冻存法,4 ℃冰箱和-20 ℃冰箱分别预冷30 min和1 h后放入-80 ℃冰箱。1个月后快速复苏冻存细胞。 结果与结论：复苏后实验组细胞存活率及生长曲线与对照组比较差异无显著性意义;复苏后实验组细胞贴壁率、形态学变化及增殖能力明显优于对照组。说明改良的纱布包裹法优于传统的细胞冻存法,且更加方便快捷。     

树突状细胞对脐血来源细胞因子诱导杀伤、自然杀伤细胞杀伤活性及CD45RO表达的影响

目的:探索同一来源脐血树突状细胞(DCs)对细胞因子诱导杀伤(CIK)、自然杀伤(NK)细胞杀伤活性和CIK细胞上CD45RO表达的影响。方法:通过细胞因子组合诱导、扩增脐血来源的DCs、CIK和NK细胞,杀伤效应细胞分为两组:A组为接受DCs共孵育6d刺激的CIK、NK细胞,B组为未接受任何刺激的CIK、NK细胞,了解DCs对相应效靶比下CIK、NK细胞杀伤K562、HL-60细胞株细胞毒活性的影响;通过流式细胞术检测两组CIK细胞上CD45RO、CD45RA的表达率。结果:随着效靶比的升高,脐血CIK、NK细胞对肿瘤细胞株的杀伤力增加。在20∶1、10∶1效靶比下,A组CIK、NK细胞对HL-60的杀伤率分别为76.77％±5.76％、55.87％±2.09％,B组为61.14％±3.72％、49.96％±1.51％,A组对HL-60的杀伤明显高于B组;在20∶1效靶比下,A组对K562的杀伤明显高于B组;而在10∶1效靶比下两组之间的杀伤活性未见显著差异;A组CIK细胞上CD45RO表达率显著高于B组。结论:DCs与CIK、NK细胞共孵育可提高CIK、NK细胞的细胞毒活性及增加CIK细胞上CD45RO的表达。     

不同细胞因子诱导脐血来源的CIK、NK细胞对K562细胞杀伤活性的研究

目的：了解不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性的差异性。方法：通过SCF、FLT3L、IL-2、IL-7及IL-15等细胞因子的不同组合扩增的脐血CIK、NK细胞，分为3组，A组（SCF＋IL-2＋IL-7＋IL-15）、B组（SCF＋FLT3L＋IL-2＋IL-7＋IL-15）和C组（IL-2＋IL-7＋IL-15，对照组）；通过MTT法检测各组CIK、NK细胞在不同效靶比下对K562的杀伤率，计算各组的总杀伤单位。结果：经过21天培养A组体系中CIK＋NK细胞的比例平均超过60％，B组CIK＋NK细胞的比例平均超过70％，而C组约为50％；各组扩增的CB-CIK／NK细胞同组间在效靶比20：1时对K562的杀伤率均显著高于10：1（P〈0．01）。在不同效靶比下A组CIK／NK细胞对K562的杀伤率显著高于B和C组（P〈0．01）；C组CIK／NK细胞对K562的杀伤率稍高于B组，但两组间对K562的杀伤率无显著性差异。A组总杀伤单位显著高于C组，与B组无显著差异。结论：不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性有差异，考虑到对效应细胞的扩增效果，B组为具有最佳杀伤活性的脐血CIK、NK细胞培养体系，其中的SCF、FLT3L对CIK／NK细胞诱导有协同效果。     

细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞的大容量扩增与杀伤活性观察

建立大容量细胞因子诱导杀伤(Cytokine-inducedkiller,CIK)细胞培养方法,观察CIK细胞回输后对患者细胞免疫功能的影响。采用1000ml培养袋大量扩增患者自体CIK细胞,用MTT法检测CIK细胞杀伤活性,比较回输前后患者外周血单个核细胞(PBMNC)对靶细胞的杀伤活性及其毒副作用。结果表明大容量培养法使自体CIK细胞扩增总量达1.6×1010以上,回输CIK细胞使患者PBMNC的杀伤活性明显增加,未出现毒副作用。因此CIK细胞大容量扩增方法在治疗肿瘤微小残留病变上有着良好的临床应用前景。     

慢性乙型肝炎患者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞的动态观察

目的:动态观察慢性乙型肝炎患者细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的增殖及杀伤活性。方法:抽取10例健康人及20例慢性乙型肝炎患者的外周血,常规分离单个核细胞(PB-MC),加IFN-γ、IL-2及抗人CD3单克隆抗体(mAb)后培养,诱导CIK细胞形成。于培养后3、6、12、24及30 d,取培养的 细胞,用流式细胞仪检测CIK细胞表面CD3、CD4和CD8以及CD4、CD25、CD3、CD56和CD95、CD28分子的表达水平、增殖及杀伤活性。结果:慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖及杀伤活性均低于正常对照组。培养不同时间乙肝患者CIK细胞的增殖倍数、杀伤活性和上述表面标志的表达水平,均较培养前明显增高,于培养后12 d达高峰。结论:慢性乙型肝炎患者CIK细胞的增殖倍数、杀伤活性均低于正常人,但明显高于培养前;这可能是导致HBV感染持续发展的原因之一。     

细胞因子诱导的杀伤细胞的生物学特性研究

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的生物学特性。方法:健康人非贴壁单个核细胞用含IFN-γ、IL-1β、IL-2、CD3单抗诱导CIK细胞。以LAK细胞作为对照。流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测细胞表型特征;乳酸脱氢酶释放法分析细胞毒活性。结果:诱导2周后,CIK细胞的增殖率达到高峰,CD3⁺细胞占95％以上;第3周细胞生长进入平台期。诱导15d时,CD3⁺CD56⁺NKT亚群占16.5％,比例在2-4周区间内无明显变化。LAK细胞增殖缓慢,显著低于同期CIK细胞增殖率(P＜0.01)。不同效:靶比例CIK细胞对肝癌细胞BeL-7402的特异性溶解率显著高于LAK细胞(P＜0.01)。免疫细胞化学染色结果显示,CIK细胞高度表达HLA-DR和CD54抗原,NKT细胞体积较CD3⁺CD56^-细胞略大,细胞表面有大量伪足。结论:CIK细胞具有高度增殖能力,其体外杀瘤活性明显优于LAK细胞。诱导14-21d,CIK细胞增殖率和CD3⁺CD56⁺阳性细胞率均达到高峰,此时期的CIK细胞适合临床应用。     

冻存复苏制备同体来源的细胞毒性T淋巴细胞

目的观察冻存复苏对淋巴细胞增殖及杀伤活性的影响,并探索小鼠同体CTL的制备。方法 5.0×106个/m L脾源性单个核细胞经CELLBANKER2小鼠淋巴细胞冻存液缓慢冻存,6 d后再采用39℃水浴快速复苏;分别取新鲜淋巴细胞和冻存复苏后(CP)淋巴细胞经体外100 ng/m L CD3ε单克隆抗体(m Ab)、10 ng/m L重组小鼠白细胞介素2(rm IL-2)刺激扩增7 d分别获取细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和CP-CIK;骨髓来源的树突状细胞(DC)分别于同系异体来源和冻存复苏后自体来源的脾源性单个核细胞混合培养制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。台盼蓝拒染法分别计数活细胞,流式细胞术检测CD3+T及调节性T细胞(Treg)比例,ELISA检测上清中γ干扰素(IFN-γ)含量、乳酸脱氢酶(LDH)释放法分析细胞毒活性。结果淋巴细胞经冻存复苏后,细胞存活率为78%,冻存前、复苏后CD3+T淋巴细胞及Treg比例无统计学差异;CP-CIK与新鲜CIK在细胞扩增、Treg比例、上清中IFN-γ水平以及细胞毒活性均无明显差异;同体CTL和异体CTL在细胞扩增、Treg比例、上清中IFN-γ水平以及细胞毒活性方面也无显著差异。结论淋巴细胞的冻存复苏有助于获取与传统CTL同等增殖活性及杀伤活性的同体来源的CTL。     

脐血CIK细胞诱导K562细胞的凋亡作用

探讨脐血CIK细胞对K562细胞的杀伤活性及诱导凋亡作用。通过第1天在脐血淋巴细胞中加入IFN-r，第2天再加入IL-2和CD3单抗进行细胞培养获得多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokines induced killer cells)即脐血CIK细胞。用MTT法测定其抗肿瘤活性，原位末端标记法进行凋亡分析，台盼蓝拒染法计数细胞。脐血CIK细胞及培养上清抗K562活性明显优于CD3AK细胞，短期培养后其增殖活性低于CD3AK细胞；但是加入G-CSF可以提高CIK细胞的增殖活性，且CIK细胞的抗K562活性仍高于CD3AK细胞。CIK细胞诱导K562细胞凋亡率大于CD3AK细胞，G-CSF能部分抑制CIK细胞诱导的K562细胞的凋亡。脐血CIK细胞是一种有效的杀伤活化细胞，脐血在多种细胞因子适当组合的诱导下可提高杀瘤活性。     

外源性IL-2在体外可恢复体内激活淋巴细胞的淋巴因子激活的杀伤细胞活性

在研究天然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)活性实验中,由于其活性受时间等因素的影响,所测结果波动较大,为了避免此种实验误差,首先将不同条件获得的淋巴细胞冻存,然后同时复苏,在相同条件下测结果。冻存和复苏可以降低淋巴细胞的细胞毒活性,但有研究显示,复苏的淋巴细胞若在37℃预先孵育18小时(称为静止作用)能够恢复NK 活性。观察了自IL-2治疗之前、之间和之后癌症病人获得的淋巴细胞,以及体外IL-2激活淋巴细胞的合适静止作用实验条件。     

TLR7激动剂增强人CIK细胞杀伤功能的研究

目的研究Toll样受体7(toll-like receptors 7,TLR7)激动剂(Tlr7a)对人细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller cell,CIK)杀瘤效果的影响。方法采集3名健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),按照常规CIK细胞培养(Control组)或day0额外添加Tlr7a(Tlr7a组)2种方案培养2周。采用细胞计数法检测细胞的增殖效率,流式细胞术检测细胞亚群的比例,CCK-8比色法检测CIK细胞对人红白血病细胞(K562细胞)的杀伤活性。结果与对照比,Tlr7a处理后,总细胞中主要效应细胞CD3+~CD56+~双阳细胞占比增加4.1%,分别为(11.9±2.9)%和(16.0±5.8)%。杀伤实验结果显示,当E∶T为20∶1时,2组细胞对K562杀伤率分别为(98.8±4.2)%和(74.4±12.3)%。相比于Control组,Tlr7a组的细胞杀伤功能明显增强(P0.05)。结论 TLR7激动剂(Tlr7a)具有增强CIK效应细胞的扩增能力,其刺激后获得的CIK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤效果更好。     

TLR7 激动剂替代IFN鄄酌诱导CIK 细胞杀伤肿瘤的研究

目的:探讨TLR7 激动剂(Toll like receptor 7 agonist,Tlr7a)替代IFN体外培养细胞因子诱导杀伤性细胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)抗肿瘤的免疫效应。方法:分离健康人外周血单个核细胞,在体外诱导CIK。分两组:CIK 组和Tlr7a-CIK 组。对各组分别进行免疫杀伤性研究,检测细胞免疫表型并分析对K562 肿瘤细胞的杀伤活性。结果:CD56+ 细胞在Tlr7a-CIK 组显著增加(P<0.05),Tlr7a-CIK 组杀伤活性较CIK 组显著增强(P<0.05)。结论:Tlr7a 可以替代IFN促进CIK 细胞杀伤肿瘤。     

TLR7激动剂替代IFN-γ诱导CIK细胞杀伤肿瘤的研究

目的:探讨TLR7激动剂(Toll like receptor 7 agonist,Tlr7a)替代IFN-γ体外培养细胞因子诱导杀伤性细胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)抗肿瘤的免疫效应。方法:分离健康人外周血单个核细胞,在体外诱导CIK。分两组:CIK组和Tlr7a-CIK组。对各组分别进行免疫杀伤性研究,检测细胞免疫表型并分析对K562肿瘤细胞的杀伤活性。结果:CD56+细胞在Tlr7a-CIK组显著增加(P0.05),Tlr7a-CIK组杀伤活性较CIK组显著增强(P0.05)。结论:Tlr7a可以替代IFN-γ促进CIK细胞杀伤肿瘤。     

人血淋巴细胞亚群杀伤K562细胞活性的比较及其相互作用

应用单克隆抗体盤选法,从人外周血中分离出CD4、CD8、CD19(B)和CD57(NK)四种淋巴细胞亚群,发现各群细胞对K562肿瘤细胞均有杀伤活性,其中以CD57细胞的杀伤活性最强.CD4和CD57细胞混合培养后的杀伤活性超过两者之和,而CD8、CD19分别与CD57细胞混合培养后,杀伤活性与两者单独培养之和相比无显著性差异.结果表明,人外周血杀伤K562细胞活性受到多种亚群细胞的影响,因此常规用K562作靶细胞测定外周血NK活性所反映的可能并非单纯NK细胞的杀伤活性.     

mdr1基因转染的CIK细胞耐药性及杀伤活性的研究

目的:将多药耐药基因(mdr1)转入CIK细胞,观察转染前后其对紫杉醇的耐药性及对Lewis肺癌细胞杀伤活性的影响。方法:常规方法:培养CIK细胞,在细胞对数生长期,将mdr1的重组质粒转染CIK,通过RT-PCR鉴定耐药基因表达;MTT法检测CIK细胞对紫杉醇敏感性的变化,同时检测转染前后CIK细胞对Lewis肺癌细胞的杀伤活性变化;Western blot检测细胞中mdr1编码的P-gp蛋白的表达的变化;通过计算瘤重抑制率(TWI)检测转染前后的CIK细胞对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用。结果:转染mdr1后的CIK细胞mdr1 mRNA阳性,同时P-gp的表达较转染前及转染空质粒的CIK细胞均有显著增高(P<0.05),转染后的CIK细胞对紫杉醇的耐药性有显著提高,但对Lewis肺癌细胞的杀伤活性无明显变化(P>0.05)。结论:将mdr1基因转入CIK细胞后,细胞获得了多药耐药性,同时保持了原有的对肿瘤细胞的杀伤活性。     

慢性粒细胞白血病患者DC对细胞因子诱导的杀伤细胞细胞毒作用的影响

目的 观察慢性粒细胞白血病（CGL）患者树突状细胞（DC）对自身细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞毒的影响。方法 从CGL患者和正常人末梢血中分离单个核细胞（PBMC），用细胞因子（rhGM-CSF,rhIL-4和rHTNF-α)联合定向诱导培养DC。用CGL细胞抗原致敏DC，再将致敏的DC与CIK共同培养后，检测CIK对不同靶细胞的杀伤作用。结果 CGL患者和正常人的PBMC经细胞因子联合诱导培养后，DC占20．78％－56．0％。CGL患者的CIK和经CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK，对自身白血病细胞的杀伤活性分别为56．0％和83．4％；正常人对照组则分别为30％和62％。经CGL患者CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK, K562和SGC－7901的杀伤活性较未致敏的CIK活性低，而正常人对照组则无此现象。结论 从CGL患者的PBMC中能定向诱导扩增出DC。经CGL细胞抗原致敏的DC，能明显增强CIK对自身CGL细胞的杀伤活性。     

细胞因子诱导杀伤细胞转MDR1基因诱导耐药研究

目的细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-induced-killer,CIK)进行临床免疫治疗能够杀伤肿瘤细胞,将MDR1基因转入CIK细胞,观察其是否产生耐药性并且保持其肿瘤杀伤活性.方法用Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞,分别加入IFN-γ,CD3Mab,IL-2,IL-1等细胞因子体外培养获得CIK细胞.在细胞呈对数生长期时,采用电穿孔方法将多药耐药基因PHAMDR质粒转入细胞.转染后72h提取细胞总RNA,RT-PCR鉴定耐药基因表达;流式细胞仪方法检测细胞膜泵蛋白P-gp.四唑蓝比色法(MTT Assay)检测转基因CIK细胞对阿霉素和秋水仙碱的耐药性,同时检测转染前后CIK细胞对人类乳腺癌细胞系(MCF7)的杀伤活性变化.结果转染后CIK细胞出现MDR1基因的转录产物mR-NA;流式细胞仪检测,转染后的CIK细胞表达耐药蛋白P-gp,阳性细胞约为21%.阿霉素对转染后CIK细胞的IC50为0.11mg/ml,转染后CIK细胞对阿霉素的耐受性较转染前CIK细胞(IC50为0.0024mg/ml)增强了45.8倍;秋水仙碱对转染后CIK细胞的IC50为1.34ng/ml,转染后耐受性较转染前CIK细胞增强了11.35倍(IC50为0.118ng/ml).比较转染前后CIK细胞对MCF7肿瘤细胞的杀伤活性无显著性差异(P＞0.05).结论用电穿孔方法可以成功地将MDR1基因转入CIK细胞,并使其表现出多药耐药性,转染前后细胞杀伤活性无变化.     

细胞因子诱导的杀伤细胞的研究进展

正常人或患者外周血、骨髓单个核细胞中定期加入IFN-γ、IL-1、IL-2、CD3mAb经2-4W的诱导可获得大量的新型肿瘤杀伤细胞—细胞因子诱导的杀伤细胞CIK,此细胞增殖旺盛杀伤活性高。CIK在体内和体外都具有非MHC限制抗肿瘤活性,在临床上已经用于治疗多种恶性肿瘤表现出强大的杀瘤活性,是一种很好的免疫治疗方法。     

抗原致敏DC与CIK共培养体外抗肾癌效应的研究

目的： 探讨肾癌(RCC)抗原致敏树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养后的DC-CIK细胞对RCC的杀伤活性。 方法： 将健康成人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC经RCC(786-0细胞株)抗原致敏后与同源CIK细胞共培养，实验分3组：RCC抗原致敏DC与CIK共培养组（A组），未致敏DC与CIK共培养组（B组），单纯CIK组（C组）。流式细胞仪检测DC及CIK免疫表型。MTT法检测3组效应细胞对786-0细胞杀伤活性。 结果： 效靶比 20∶1 时，A、B、C组对786-0细胞杀伤活性分别为（70.64±8.26）%、（53.40±7.33）%、（46.64±6.01）%，各组比较差异显著（P<0.05）；以前列腺癌PC3细胞作靶细胞对照，A组对786-0及PC3细胞的杀伤活性有显著差异（P<0.05）。 结论： RCC抗原致敏DC与CIK共培养后的DC-CIK细胞可明显提高CIK细胞对RCC的杀伤特异性和杀伤活性。     

Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步探讨

目的 探讨人B细胞淋巴瘤Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤的机制.方法 以K562细胞作为对照,应用LDH释放法检测不同效靶比时同种异体NK细胞杀伤Raji细胞的活性.并分别用PCR方法和流式细胞仪检测K562和Raji细胞MICA/B、ULBP1-3、HLA基因型和分子的表达情况.效靶比20∶1时用单抗分别阻断K562和Raji细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3和HLA-Ⅰ类分子,观察NK细胞对其杀伤活性的变化.结果 不同效靶比时NK细胞杀伤Raji细胞的活性明显低于杀伤K562细胞的活性,二者之间差异有统计学意义(P<0.05).K562细胞表达MICMB和ULBP1～3基因和分子,不表达HLA-Ⅰ类分子,Raji细胞表达ULBP1～3基因和HLA-Ⅰ类分子,不表达MICA/B和ULBP1～3分子.Raji细胞HLA基因型为A*3、3.B*71、71,Cw3、4.用单抗封闭MICMB和ULBP1～3分子后,NK细胞对K562细胞的杀伤活性明显降低,对Raji细胞的杀伤活性无明显改变.结论 Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制和Raji细胞高表达HLA-Ⅰ类分子,不表达NKG2D的配体MI-CA/B和ULBPI～3有关.