以异种后弹力膜基质为载体培养角膜内皮细胞的研究

目的　探讨以异种后弹力膜 (DM) /基质为载体培养角膜内皮细胞的可行性 ,为培养内皮细胞的临床移植提供新的方法和供体材料。方法　取厚 10 0 μm的猪角膜后层 ,冻存解冻后置中性蛋白酶 3 7℃孵育 5min ,去除内皮细胞 ,保留DM及薄层基质 ,置纯甘油中脱水保存 6个月 ;使用前复水 ,紫外线二面灭菌 ,制备成载体 ;接种兔角膜内皮细胞于载体的DM面并体外培养 ,行细胞形态、密度、组织学、超微结构的观察。结果　兔内皮细胞在猪DM/基质载体上贴附生长 ,形成紧密连接的单层 ,形态近似六角形分布 ;细胞密度达 ( 3 62 0± 110 2 3 )个 /mm2 ,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论　角膜内皮细胞能够在异种DM/基质载体上良好生长 ,该载体有可能成为培养内皮细胞应用于临床移植的供体材料     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

羊膜载体培养标记兔角膜内皮细胞移植的研究

目的探讨以羊膜基底膜为载体培养兔角膜内皮细胞移植的可能性,为培养内皮细胞移植治疗角膜内皮失代偿疾病提供依据与方法。方法体外培养扩增兔角膜内皮细胞,采用亲脂性碳青染料(CM-DiI)对细胞进行标记,种植于去除上皮细胞的羊膜基底膜上,体外培养形成单层角膜内皮层,并进行形态学、组织学、超微结构及细胞标记情况的观察;将羊膜为载体培养的内皮层对切除后板层的兔角膜进行移植,同时以无培养内皮细胞的羊膜移植和单纯角膜后板层切除为对照,术后观察角膜透明度与厚度,对其进行组织学与细胞标记情况的检测。结果 5～7d 角膜内皮细胞即在羊膜基底膜上融合成单层,细胞为扁平多角形,排列紧密,密度可达(3202.84±347.77)个/mm~2,荧光显微镜下可见内皮细胞被 CM-DiI 标记后显现红色荧光;培养内皮层移植后角膜维持相对的透明与薄度,而无内皮细胞羊膜移植和单纯后板层切除两组对照角膜严重水肿、混浊,厚度明显超过实验组角膜;培养内皮移植后角膜形成新的内皮层,通过标记的细胞发现移植后细胞仍为培养移植的内皮细胞而非周边细胞的移行。结论羊膜基底膜是角膜内皮细胞生长和移植的良好载体,体外培养角膜内皮细胞移植有望代替供体角膜移植,具有广阔的应用前景。(中华眼科杂志,2006,42:925-929)     

家兔角膜内皮细胞的快速培养

目的:短期内体外扩增获得角膜内皮细胞。方法:采用揭膜法与消化法相结合获取原代角膜内皮细胞。并采用本实验室自行研制的角膜内皮细胞培养体系,在24孔培养板中分别以1×106,5×105,1×105,5×104,1×104,5×103细胞/孔浓度传代培养细胞,观察细胞的生长情况。结果:以1×105～5×105个细胞/孔浓度的细胞悬液并添加消化后的Descemet膜原代培养细胞,4d后细胞形成与在体细胞相似的密集单层,可以快速获取纯化的角膜内皮细胞。传代培养时,虽然不同接种浓度在4d的细胞增殖倍数差异不显著,但以1×105～5×105个细胞/孔的浓度传代,3d就可生长成密集单层并可继续传代,现已传至第10代,但传至第4代,细胞形态开始发生改变;而以5×105个细胞/孔以上的浓度传代细胞时,1d的细胞贴壁率下降;以5×104个细胞/孔以下浓度传代,需7d方可长满皿底,并且细胞开始老化,体积变大,不能继续传代培养。或者细胞不能铺满皿底就衰老死亡。结论:本实验的培养体系可在短期内获得实验用角膜内皮细胞。角膜内皮细胞体外培养的增殖能力与其培养浓度和增殖的空间有关,1×105～5×105个细胞/孔的浓度是角膜内皮细胞快速增殖的适宜培养浓度。     

角膜内皮细胞体外培养的研究进展

角膜内皮是角膜的重要组成部分,由单层的角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)组成,在维持角膜正常的透明度方面发挥着重要的作用.CEC在出生后即丧失增殖能力,一旦受损或丢失会导致不可逆性角膜疾病.但是,大量的研究表明CEC可以在体外增殖,这为体外培养人CEC用于角膜疾病的治疗提供了可行性,但至今仍没有建立一套标准的CEC体外培养方法.本文将归纳总结近年来CEC体外培养方法.以利于今后优化CEC体外培养体系.     

人表皮生长因子对体外培养兔角膜内皮细胞影响的实验研究

目的：明确人表皮生长因子（ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ,ｈＥＧＦ）对角膜内皮细胞的影响。方法：采用体外培养的兔角膜内皮细胞,观察接种后不同时点ｈＥＧＦ对其生长状态的影响;兔角膜片内皮损伤模型,离体培养后行Ｈ－Ｅ染色和Ｈ＾３－ＴｄＲ掺入放射自显影,观察ｈＥＧＦ对其修复的影响。结果：兔角膜内皮细胞体外培养ｈＥＧＦ组细胞数高于对照组,并使细胞形态产生纺锤形改变;角膜内皮细胞     

体外培养角膜内皮细胞移植的实验研究

目的　探讨体外培养角膜内皮细胞移植的手术方法及移植后在活体的生理功能。方法　植片 :以直径 7 5mm、厚 10 0 μm、冷冻脱水保存的猪角膜后弹力膜 (Descemet′smembrane ,DM ) /基质为载体 ,原代接种兔角膜内皮细胞 ,体外培养 7～ 10d ,用于移植。受眼 :新西兰兔 3 0只 ( 3 0眼 ) ,实验组 2 0眼 ,对照组 10眼 ,全角膜范围去除术眼内皮细胞 ,5周后施行手术 ;做直径 9mm、3 / 4角膜厚的带蒂前层角膜瓣并掀置一侧 ,再用直径 7 2 5mm的环钻钻去中央后层角膜 ,形成植床 ;将植片置于植床 ,8-0可吸收线间断缝合 ,10 -0尼龙线间断缝合前层角膜瓣 ,术后观察 1～ 12个月。结果　术后角膜持续透明 6个月 14眼 ( 14 / 18、 77% ) ,12个月 8眼 ( 8/ 14、 5 7% ) ;术后 6个月内皮细胞密度 ( 193 4± 3 0 7)个 /mm2 ,角膜厚度平均为 ( 3 92± 3 9) μm。 结论　以异种DM /基质为载体培养的兔角膜内皮细胞 ,行同种异体移植后 ,能够在活体上成活 ,并具有正常内皮细胞的生物学功能 ,维持角膜透明 ,深板层角膜内皮移植术是体外培养内皮细胞移植的一种有效术式。     

肾纤维囊为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探索以脱细胞的肾纤维囊作为载体培养角膜内皮细胞并研究角膜内皮细胞特性。方法将培养扩增的角膜内皮细胞分别接种到培养板和肾纤维囊上进行体外培养,采用倒置显微镜、免疫荧光、HE染色和扫描电镜的方法进行检测,观察角膜内皮细胞在培养板和肾纤维囊上的生长情况。结果角膜内皮细胞在肾纤维囊上快速贴壁生长并增殖,细胞形态为多角形或六边形,多次传代后细胞仍维持原有的形态和功能,细胞能长期培养。在培养板上培养的角膜内皮细胞贴壁生长和增殖情况稍差。结论角膜内皮细胞在脱细胞的肾纤维囊载体上生长良好,细胞形态结构明显。本研究为角膜内皮细胞的体外培养提供了简单和高效的方法。     

角膜内皮细胞培养的研究进展

角膜内皮功能失代偿引起的失明可通过角膜移植来治疗.人们通过体外培养角膜内皮细胞并使其增殖,进行角膜内皮细胞移植和角膜组织工程学研究.目前常用的分离角膜内皮细胞的方法是从供体上撕除后弹力层和角膜内皮层,利用酶消化作用使角膜内皮细胞分离.常用的培养基为基础培养基加各种生长因子.这些生长因子在一定程度上促进细胞增殖,但培养的角膜内皮细胞长期传代后仍难以维持正常的细胞形态和功能.基因转染技术建立了永生化角膜内皮细胞系,有关细胞周期、信号通路和离子通道的研究成果也促进了角膜内皮细胞体外培养的研究进展.本文综述了角膜内皮细胞体外培养各个环节的最近进展.     

角膜内皮细胞移植术的新进展

随着组织工程和细胞工程技术的发展，体外培养角膜内皮细胞取得成功，由此而探索出一种新手术——角膜内皮细胞移植术。这种手术是将体外培养的角膜内皮细胞或直接获取供眼健康的角膜内皮细胞，移植到受体眼已去除自身内皮细胞的角膜上，保证了受体角膜有足够健康的内皮细胞并减少了排斥反应。最新研究结果为通过-5mm宽的巩膜隧道切口，以后弹力膜作载体，把健康活性角膜内皮细胞移植到受体眼。该方法手术切口小，无缝线，移植后的内皮细胞完整无损，贴附良好，术后并发症少，已有临床成功病例的报道。角膜内皮细胞移植术将为角膜病患带来新的治疗方法。     

人羊膜作为载体体外培养兔角膜上皮细胞移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的观察培养生长于人羊膜的兔角膜上皮细胞使其扩增并移植治疗角膜碱烧伤的效果。为培养角膜上皮细胞移植技术及应用于临床实践提供最佳的理论和实验依据。方法新西兰白兔30只（30眼）,随机分为3组（n=10）,右眼制成碱烧伤模型。A组：角膜上皮细胞羊膜移植组;B组单纯羊膜移植组;C组为对照组（碱烧伤后不作任何移植）。术后观察角膜透明度、角膜新生血管及上皮修复情况,裂隙灯显微镜照相记录。3组均于术后1周、2周、1个月及3个月时各取1眼角膜标本行病理组织检查。结果A组除1眼移植片在第7天脱落外,所有移植片在术后3d水肿消退,角膜逐渐透明。B组移植片持续水肿,眼前段炎性反应稍重,但较碱烧伤对照组轻。C组角结膜高度水肿浑浊,烧伤后观察3个月未发现角膜恢复透明现象。病理组织检查显示：A组角膜及周边上皮细胞为多层结构,角膜新生血管消失,基质的炎性细胞浸润减退;B组覆盖上皮细胞表现为完整上皮细胞型,C组角膜浑浊,新生血管及肉芽组织形成。结论人羊膜作载体体外培养兔角膜上皮细胞移植重建角膜基底膜和角膜上皮结构治疗兔碱烧伤后的角结膜损伤是一种合理有效的方法。     

新鲜羊膜移植治疗角膜溃疡的临床分析

目的探讨新鲜羊膜移植在治疗角膜溃疡中的作用。方法真菌性角膜溃疡5例（5眼），细菌性角膜溃疡9例（9眼），病毒性角膜溃疡4例（4眼），蚕蚀性角膜溃疡2例（2眼），化学烧伤性角膜溃疡6例（8眼），热烫伤性角膜溃疡7例（10眼）。均行新鲜羊膜移植术，相应药物治疗。结果随访6～18月。感染性角膜溃疡17眼愈合，视力均有提高，其中1眼病毒性角膜溃疡愈合后形成角膜瘢痕，视力降低，3眼真菌性角膜溃疡多次新鲜羊膜移植后未愈合，最终行角膜移植；化学性和热烫伤性角膜溃疡愈合时间较长，视力部分恢复，其中4眼病情较重行羊膜移植失败，最后睑裂暂时性缝合1眼，3眼行角膜移植术。结论羊膜移植术是治疗角膜溃疡疗效较好且经济方便的方法之一。对真菌性角膜溃疡治疗效果一般，尚需角膜移植和抗真菌治疗等方法。     

新鲜多层羊膜移植治疗角膜溃疡的临床观察

目的　探讨新鲜多层羊膜移植治疗角膜溃疡的效果。方法　对 12例 (12眼 )角膜溃疡 (其中 5例角膜穿孔 )施行新鲜多层羊膜移植治疗 ,术后随访 3～ 12月。结果　 11例治愈 ,1例复发。术后短期内未见植片融解、未见急性排斥反应。 2～ 5周角膜上皮愈合。 10眼视力不同程度提高。结论　新鲜多层羊膜移植是治疗角膜溃疡的有效方法。     

角膜肉芽肿切除加羊膜移植术治疗角膜肉芽肿的临床观察

目的探讨角膜肉芽肿形成的原因、临床表现及手术预后。方法对12例角膜肉芽肿病例,均行角膜肉芽肿切除术加羊膜移植术。结果12眼术后观察60～90d,角膜面光滑,肉芽肿未见复发,视力提高。结论肉芽肿切除加羊膜移植术,对角膜肉芽肿有良好效果。     

兔舌黏膜细胞构建组织工程化角膜上皮的实验研究

目的探讨兔舌黏膜上皮细胞以去上皮羊膜为载体,体外构建组织工程角膜上皮的可行性和方法,试图为眼表重建寻求另一种来源丰富的有效组织工程化角膜移植材料。方法胰酶消化去除羊膜上皮细胞,保留基底膜作为载体,将兔舌黏膜上皮细胞种植于去上皮羊膜基底膜进行体外培养扩增。对培养获得的复合上皮片进行形态观察、常规病理切片HE染色和透射电镜观察。采用AE1/AE3单克隆抗体鉴定复合上皮片中有无角蛋白表达。结果兔舌黏膜上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面能黏附生长并增殖,体外培养2～3周左右即可在羊膜上汇合成片并分层。形成的复合上皮片由羊膜基底膜和2～3层较扁平的上皮细胞组成,细胞之间可见桥粒连接,细胞表达角蛋白。结论兔舌黏膜上皮细胞以去上皮羊膜为载体,经体外培养扩增获得的复层组织,初具角膜上皮的雏形结构。     

羊膜移植治疗深层角膜溃疡的临床观察

目的 观察羊膜移植治疗深层角膜溃疡的临床效果。方法 我们采用同种异体多层羊膜移植治疗深层角膜溃疡6例(6眼)，均为药物治疗无效的细菌性角膜溃疡结果6眼均治愈。术后未见羊膜移植片急性排斥反应，术后5—12天炎症控制，4-5周角膜上皮愈合，溃疡灶留下不同程发的瘢痕。结论羊膜移植治疗深层角膜溃疡是一种有效方法，尤其适用于角膜侈植供体缺乏、抢救药物治疗无效且病情进行性发展的深层角膜溃疡。