癌-睾丸抗原GAGE-1基因的重组、表达及纯化

目的 为进一步研究临床应用癌-睾丸抗原GAGE-1诱导特异性抗肿瘤免疫反应,对GAGE-1基因进行克隆、体外原核重组表达及蛋白分离纯化。方法 运用RT-PCR技术从人QGY-7701肝癌细胞株中扩增GAGE-1基因片段,插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAGE-1,并导入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达;经包涵体透析复性及GST柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析鉴定。结果 扩增得到GAGE-1基因5’端251 bp片段,与GeneBank公布的序列一致,构建的PGEX-6p-1-GAGE-1原核表达质粒经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达分子量约35.7 kD的GST-GAGE-1融合蛋白,纯化后蛋白纯度为90%以上。结论 成功构建PGEX-6p-1-GAGE-1重组表达质粒,并成功表达纯化了GST-GAGE-1融合蛋白,为进一步深入研究GAGE蛋白奠定了基础。     

HPV16E7-HSP70 融合蛋白在大肠杆菌中表达及纯化

[目的]在大肠杆菌中表达HPV16E7-HSP70融合蛋白并进行纯化和复性,为进一步研究HPV16E7-HSP70融合蛋白抗喉癌免疫活性奠定基础.[方法]用构建的原核表达质粒pET28a HPV16E7-HSP70转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达;通过超声波裂解细菌,高浓度尿素裂解包涵体和Ni2+离子金属螯合亲和层析纯化目的蛋白;并对融合蛋白进行复性;用SDS-PAGE及Western Blot进行分析鉴定.[结果]SDS-PAGE 分析显示有分子量约为90kD的融合蛋白表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量可达30％;纯化后目的蛋白的纯度达到95％;经Western Blot鉴定复性后的融合蛋白能与抗HPV 16E7抗体、抗HSP70抗体特异性结合.[结论]HPV16E7-HSP70融合蛋白能够在体外大肠杆菌中表达获得.     

白血病相关基因LRP16真核表达质粒的构建及其在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达

目的:构建白血病相关基因LRP16真核表达质粒,并检测其在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的表达。方法:从人子宫内膜癌HEC-1-B细胞中提取总RNA,应用PCR技术,扩增获得LRP16基因编码序列片段,克隆入真核表达载体EX-Y2069-M29,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至HEC-1-B细胞,采用Western blot法检测LRP16蛋白的表达。结果:酶切和测序结果证明LRP16基因真核表达质粒EX-Y2069-M29的DNA序列完全正确,将其转染HEC-1-B细胞后,LRP16蛋白表达明显增加。结论:LRP16基因重组真核表达质粒EX-Y2069-M29构建成功,并能在HEC-1-B细胞中表达,为进一步研究LRP16基因奠定了基础。     

新克隆的硝基还原酶基因NOR1的表达及其产物的纯化

背景与目的：NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤／易感基因候选者之一,本实验旨在构建NOR1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化NOR1基因所编码的蛋白。方法：抽提人鼻咽正常组织中总RNA,利用RT－PCR扩增NOR1基因全长,经BamH I、Xho I双酶切后插入同样经BamH I、Xho I双酶切后的pGEX-4T-2质粒,构建表达载体pGEX-4T-2/NOR1重组表达质粒;转化大肠杆菌Jm105,用异丙基－β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-thiogalactoside,IPTG）诱导pGEX-4T-2/NOR1/Jm105表达GST融合蛋白后,采用Western blot验证,并用GST琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。结果：酶切鉴定和测序验证成功地构建了NOR1基因原核表达载体,经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析在大肠杆菌Jm105中成功诱导表达了一分子质量约为74kDa的融合蛋白;该融合蛋白存在于细菌裂解液的上清和沉淀中,Western blot证实表达获得了成功;并利用亲和层析法获得了纯化蛋白。结论：成功获得了高效表达NOR1基因的原核表达产物,通过对该融合蛋白的纯化为它的多抗制备奠定了基础。     

PEP-1-VP3融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体pET15b-PEP-1,构建重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了分子量为17.6kD的PEP-1-VP3融合蛋白。结论:PEP-1-VP3融合蛋白原核表达质粒的构建及目的蛋白的表达、纯化,为体内应用PEP-1-VP3融合蛋白进行抗肿瘤研究提供了理论基础。     

人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究

目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物。方法以人HSP0 cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌BL21上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化。结果应用PCR方法扩增出约1900bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70kD处有蛋白表达,Western blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上。结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件。     

3TAT-DRBD融合蛋白的原核表达及其siRNA结合活性与穿膜功能的鉴定

目的： 构建3TAT-DRBD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其siRNA结合活性和穿膜功能进行初步验证。 方法： 采用基因合成技术获取靶基因 3TAT-DRBD, 并克隆到原核表达载体pET-44b中;用IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,凝血酶切除标签,Western blotting鉴定。凝胶迁移阻滞实验验证DRBD和siRNA的结合能力,激光共聚焦显微镜观察TAT的穿膜能力。 结果： 限制性酶切和基因测序表明重组质粒pET-44b-3TAT-DRBD构建成功;IPTG诱导后3TAT-DRBD融合蛋白（含Nus标签和S标签）在大肠杆菌中高效表达,可溶性蛋白占菌体总蛋白约80%;成功切除融合标签并纯化了无标签的融合蛋白,经Western blotting鉴定其相对分子质量约为17 000;凝胶迁移阻滞实验证明,融合蛋白3TAT-DRBD 能有效结合靶向survivin基因的siRNA（survivin-siRNA）;激光共聚焦显微镜下可见,在TAT的介导下survivin-siRNA穿透胞膜进入前列腺癌PC3细胞的效率明显增高。 结论： 成功表达并纯化了具有siRNA结合活性与穿膜功能的3TAT-DRBD融合蛋白,为进一步3TAT-DRBD的功能研究及临床应用奠定了基础。     

靶向白血病干细胞CD123的毒性融合蛋白的制备

 目的　构建靶向白血病干细胞CD123的融合蛋白,检测其表达效果及其识别白血病干细胞的活性。方法　采用PCR法扩增白细胞介素-3（IL-3）和毒素蛋白（LP）的编码DNA序列,经酶切、连接,克隆至表达载体pAYZ,转化大肠杆菌E.coli 16C9,鉴定阳性克隆菌落,经低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白IL-3-G4S-LP,用CM-FF阳离子柱和抗-Etag亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,流式细胞术测定其与红白血病细胞TF1的结合活性。结果　构建的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白表达,纯化后纯度达95 %以上,表达量约为1 mg／L,并有与白血病干细胞表面IL-3受体α亚基（CD123）特异性结合的活性。结论　构建的融合蛋白IL-3-G4S-LP具有与白血病干细胞结合的特性,可望成为复发和耐药白血病的治疗药物。     

rRTA：DS27,ricin：DS27两种免疫毒素的初步比较

目的:探索荧光蛋白作为报告基因以及His·Tag作为纯化标签在重组痘苗病毒表达系统中的应用.方法:将N-端融合His·Tag基因序列,插入痘苗病毒表达载体pSFJ2-16,并在其多克隆位点下游装入带有巨细胞病毒(CMV)启动子的突变型荧光蛋白基因(GFP),构建成N-端融合His·Tag并带有荧光蛋白报告基因的分离型痘苗病毒表达载体.再从pET-28中切出C-端融合His·Tag及多克隆位点序列,并与CMV-FP基因一同装入pSFJ2-16,构建成C-端融合His·Tag的分离型痘苗病毒表达载体.将人免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)核心蛋白(gag)p17-24基因分别插入上述载体,并筛选出重组病毒.结果:实验表明,重组病毒表达了gag蛋白.结论:将His-Tag的纯化标签加入到通用型痘苗病毒表达载体中用于纯化表达的目的蛋白,该方法是可行的.荧光蛋白基因作为一个筛选标记基因应用于痘苗病毒载体系统还有待进行进一步研究.     

新基因NBEAL1的克隆、表达、纯化及其与胶质瘤病理分级的相关性

目的：构建新基因neurobeachin like 1（NBEAL1）的表达载体,研究NBEAL1 的表达与胶质瘤病理分级的相关性。方法：提取人脑胶质瘤细胞U251的总RNA,构建pGEX-KG/NBEAL1表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导NBEAL1重组蛋白的表达,GST亲和纯化,Western blotting鉴定重组蛋白的纯度;以免疫组化法用纯化蛋白制备的单克隆抗体分析NBEAL1表达与胶质瘤病理分级的相关性。结果：NBEAL1基因片段被成功地克隆入pGEXKG表达载体,测序证实克隆片段序列正确。NBEAL1融合蛋白在大肠杆菌BL21包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度95%以上。Western blotting证明所纯化的蛋白含有GST标签与NBEAL1肽段。免疫组化法检测显示NBEAL1蛋白的表达在正常脑组织中较低,而在低级别的脑胶质瘤组织中表达明显上调,但随着恶性程度增加NBEAL1的表达程度降低,两者呈负相关。结论：成功地克隆、表达及纯化NBEAL1蛋白,NBEAL1蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达与其恶性程度呈负相关。     

EGF-Ang融合蛋白的构建、表达及活性研究

目的：构建由人表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和人血管生成素（angiogenin, Ang）组成的人源化的融合蛋白，并检测其对肿瘤细胞的靶向杀伤能力。方法：利用基因工程技术将EGF和Ang基因连接起来，克隆到高效表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pEGFAng，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白（EGFAng）。经DEAESepharose FF阴离子交换柱层析纯化后，用MTT法检测复性蛋白的细胞毒性。结果：SDSPAGE和薄层扫描分析表明外源蛋白的表达量占菌体裂解蛋白总量的18.6%。细胞活性检测表明EGFAng重组蛋白能明显地抑制Hep2细胞的生长，而不影响MA104细胞的正常生长。结论：融合蛋白EGFAng在体外对过度表达EGFR的Hep2细胞具有明显的杀伤作用。     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

人黑色素瘤抗原MAGE-3 肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A *0201 转基因小鼠CTL活性的观察

 目的 通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗，并观察其对HLA-A＊0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法 用RT-PCR的方法，从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段，分别将其插入到pcDNA3．1／v5-His真核扣pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达；将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后，采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HL-A＊0201转基因小鼠，LDH方法检测CTL活性。结果 酶切结果证实，成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体，并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达，原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫，镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后，可成功地诱导HL-A＊0201转基因小鼠CTL活性。结论 成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原，为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。     

MAGE-3 原核重组表达载体的构建和表达

 目的 构建原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E.coli）BL21中的表达。方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将其克隆至pGEM-TEasy和亚克隆至pGEX-4T-1载体,转化E.coliBL21株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果 扩增出349bp的MAGE-3目的基因并构建了原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与Gen Bank收录序列相一致;在E.coli BL21中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的蛋白。结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据。     

抗人KIAAO100蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备抗人KIAA0100蛋白多克隆抗体,为今后研究人KIAA0100蛋白的结构和功能奠定基础.方法:采用生物信息学软件对人KIAA0100蛋白第1 557～2 234位氨基酸序列进行原核密码子优化,将优化后的核苷酸序列经人工合成后克隆入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒;采用限制性酶切分析对重组质粒进行鉴定;将正确的重组质粒转化人大肠杆菌BL21(DE3)细胞,以表达羧基末端携带6×组氨酸标签的重组蛋白;使用重组蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗人KIAA0100蛋白多克隆抗体;使用蛋白质印迹分析检测该多克隆抗体对人KIAA0100蛋白的识别能力.结果:限制性酶切分析显示:重组质粒被成功构建;SDS-PAGE分析结果显示:主要以包涵体形式存在的重组蛋白被成功表达;蛋白质印迹分析证实:该多克隆抗体能够高效地识别人KIAA0100蛋白.结论:成功制备了抗人KIAA0100蛋白多克隆抗体,以上研究结果为我们将来研究人KIAA0100蛋白的结构和功能奠定了基础.     

宫颈癌组织HPV58的检测及其E7基因的克隆和表达

目的　检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒 5 8型 (HPV5 8)并克隆表达其E7基因。方法采用GP5 /GP6 引物系统扩增 5 8例宫颈癌组织 ,将荧光偏振 (FP)检测技术与模板指导的末端延伸反应 (TDI FP)结合 ,检测HPV5 8,确定HPV5 8感染阳性宫颈癌组织。用特异引物从HPV5 8阳性标本中扩增HPV5 8早期表达蛋白E7基因 ,将其连入pGEM TEasy载体 ,获得克隆重组体HPV5 8E7 pGEM T ,并测序验证。将E7基因与pRSET A融合表达载体连接 ,获得E7表达重组体pRSET 5 8E7,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,并用IPTG诱导表达。结果　 5 8例宫颈癌标本中 ,HPV5 8阳性 10例 ,占 5 2例HPV阳性标本的 19.2 %。从其中扩增到了HPV5 8E7基因并构建了其克隆和表达重组体。其表达重组体经IPTG诱导后 ,可表达Mr16× 10 3 的HPV5 8E7His6融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的 30 %。结论　欧美国家少见的高危HPV5 8在中国陕西人宫颈癌组织中并不少见。HPV5 8E7重组表达体可在大肠杆菌中高效表达 ,为HPV5 8相关肿瘤诊断试剂及疫苗的研制奠定了初步基础     

肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体的构建及蛋白表达

背景与目的肺癌细胞对化疗药物的耐受是肺癌患者生存率低的重要原因之一。我们在前期研究中发现了一条肺腺癌耐药相关的基因BC006151,本研究拟构建肺腺癌耐药相关基因的原核表达载体PGEX-4T-1-BC006151,诱导其表达及鉴定目的蛋白,从而揭示该基因与肺腺癌耐药的关系。方法以RNA为模板RT-PCR扩增,产物与质粒PGEX-4T-1用BamHI和EcoRI双酶切,用T4DNA连接酶将二者连接,连接物转化DH5α菌,重组克隆菌经测序鉴定确认。将带有目的片段的重组克隆载体转化BL21表达菌,SDS-PAGE电泳检测表达产物,Western blot检测GST融合蛋白表达。结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片段,与GenBank中公布的BC006151基因序列一致。重组克隆载体经BL21表达菌表达,获得40KD的条带(其中目的蛋白13KD,GST标签26KD)。结论成功构建了肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体,并成功诱导了目的蛋白表达,GST亲和纯化,为进一步制备该基因的多克隆、单克隆抗体奠定了基础。     

MBP-hmcm6融合蛋白的构建与表达

目的构建含微小染色体维持蛋白MBP-hmcm6的原核表达重组质粒,并进行可溶性表达与初步纯化.方法以常规克隆方法将目的片段连接至pMAL-p2x载体,获得的阳性克隆转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达.结果经Western blot鉴定,获得了分子量大小为139 KD的MBP-hMCM6p蛋白.结论成功构建了pMAL-p2x-hmcm6重组质粒和工程菌,实现了重组蛋白可溶性表达,有助于进一步研究MCM蛋白的结构与功能.