红曲提取物对体外培养成骨细胞的作用研究

目的：研究红曲不同提取物对体外培养大鼠成骨细胞（ROB）增殖、分化的影响。方法：采用新生大鼠颅骨分离培养ROB,MTT法测定细胞增殖,碱性磷酸酶（ALP）试剂盒法测定ALP活性,观察红曲提取物对ROB增殖、分化的作用,同时考察了MTT法和ALP试剂盒法中细胞数和吸收值之间的线性关系。结果：10^-2和10^-3mg/ml的水提物能刺激ROB的增殖（P〈0.05）,10^-3mg/ml的水提物还能提高ROB的ALP活性（P〈0.05）;10^-2和10^-3mg/ml的95%乙醇提取物对ROB的增殖与分化均有明显的促进作用（P〈0.05或P〈0.01）。结论：红曲水提物和95%乙醇提取物均能促进ROB骨形成过程中增殖、分化,95%乙醇提取物作用效果显著。     

葛根素对成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白的影响

目的:探讨葛根素对成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白的影响。方法:采用血清药理学方法制备葛根素含药血清,分为葛根素组、阳性对照组和阴性对照组。从SD大鼠乳鼠颅骨获取成骨细胞,分别用含药血清培养分离得到的成骨细胞。采用CCK-8检测成骨细胞增殖、酶联免疫吸附试验检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)的表达;采用微量酶标法检测碱性磷酸酶的活性。结果药物作用24、48和72 h后,葛根素组D值显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。随着时间的增加,葛根素组和阳性对照组D值在药物作用48 h达到最高,至72 h后有下降趋势。药物作用3 d和7 d后,葛根素组BMP-2表达水平均显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。药物作用3d和7 d后,葛根素组BMP-2表达水平均显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。药物作用3 d和7 d后,葛根素组碱性磷酸酶活性均显著高于阴性对照组(P0.05),且显著低于阳性对照组(P0.05)。结论葛根素可能通过诱导BMP-2表达促进增殖,活化碱性磷酸酶活性促进生物矿化。     

葛根素注射液对高糖培养成骨细胞保护作用的研究

目的：探讨葛根素注射液对高糖培养成骨细胞的保护作用,为临床治疗糖尿病骨质疏松提供实验依据。方法：体外分离培养成骨细胞,并随机分为正常培养基组、高糖培养基组和高糖培养基添加葛根素注射液组。3组成骨细胞各自培养48小时后进行形态学观察,同时检测其碱性磷酸酶（ALP）表达的阳性率。结果：高糖培养组成骨细胞增殖分化能力减弱,细胞数量及连接减少,其碱性磷酸酶（ALP）阳性率也明显低于正常组;葛根素组上述指标均明显改善。结论：高糖可影响骨组织代谢及成骨细胞的增殖分化,葛根素对上述改变有一定的保护作用。     

葛根素对大鼠成骨细胞代谢调控机制的实验研究

目的 探讨葛根素对大鼠成骨细胞代谢调控的影响.方法 取新生SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞.应用MTT法,对硝基苯磷酸盐法(PNPP)和RT-PCR方法观察葛根素对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和OPG,RANKL mRNA表达的影响.结果 葛根素能刺激成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,增强OPG mRNA的表达(P＜0.05或P＜0.01).结论 葛根素能促进成骨细胞的增殖、分化,增加OPG mRNA的表达,对RANKL的表达无明显影响.     

葛根素对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的:探讨葛根素体外对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响。方法:用改良的组织块法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,葛根素以不同浓度加入细胞培养体系,作用不同时间后,用MTT法检测成骨细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法测定细胞内碱性磷酸酶的活性,用改良的Lowry法测蛋白含量。结果:葛根素在1×10-4mol/L~1×10-8mol/L浓度范围内24h,48h促进成骨细胞增殖,在1×10-6mol/L~1×10-8mol/L范围内48h及1×10-8mol/L72h提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。结论:葛根素体外能促进成骨细胞的增殖与分化。     

补肾活血方对成骨细胞增殖等生物学特性影响的实验研究

目的:观察中药补肾活血方对体外培养SD大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化的的影响.方法:取新生的SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞.应用MTT法,对硝基苯磷酸盐法(PNPP)及茜素红染色方法观察补肾活血方对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化结节形成的影响.结果:补肾活血方具有刺激成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性及矿化结节形成的数量的作用(P＜0.01或P＜0.05).结论:补肾活血方具有促进成骨细胞的增殖、分化及矿化作用.     

巴戟天对成骨细胞生物学特性影响的实验研究

目的:观察巴戟天对体外培养成骨细胞(OB)增殖及其活性的影响,探讨巴戟天补肾壮骨作用的实质.方法:取新生SD大鼠头盖骨提取成骨细胞,进行生长曲线分析,测定巴戟天对细胞增殖及分泌ALP、BGP、TGF-β1的影响.结果:巴戟天能显著刺激OB增殖;巴戟天与密钙息均可促进分化中的OB分泌ALP和骨钙素,促进OB表达TGF-β1.结论:巴戟天具有与密钙息相同的作用,即促进OB分泌ALP和骨钙素,促进OB表达TGF-β1mRNA,从而大量分泌Ⅰ型胶原,以利钙盐沉积.     

葛根素对SD大鼠MSCs增殖及骨向分化的影响

目的:观察葛根素(Puerarin,Pue)对骨髓间充质干细胞(Marrow pluripotent stromal stem cells,MSCs)增殖和向成骨细胞(Osteoblasts,OB)分化的影响,从干细胞的角度探讨中药防治骨质疏松的可能机制和影响途径。方法:成功建立MSCs培养体系,取第三代SD大鼠MSCs,随机分为三组:空白组、不同浓度的Pue组、经典诱导组,通过MTT比色法及流式细胞仪技术,ALP染色技术观察Pue对MSCs增殖及向OB分化的影响。结果:通过对生长曲线的绘制,对多向诱导分化能力检测,及对表面抗原中CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性的检测,说明成功建立MSCs体外培养体系。经MTT比色法检测显示,10~(-7)mol/L、10~(-8)mol/L Pue与空白组对比具有促进MSCs增殖的作用,具有统计学意义。ALP染色阳性细胞表达率显示,10~(-6)mol/L Pue与空白组相比具有确定的诱导MSCs向OB分化的作用,说明Pue可以促进MSCs向OB分化。结论:葛根素具有促进体外培养MSCs增殖及向OB分化的能力。     

蛋白免疫印迹杂交法研究葛根素对于促进成骨细胞OPG/RANKL蛋白表达的影响

目的:通过蛋白免疫印迹杂交法(Western blot法)、MTT法探讨葛根素通过OPG/RANKL蛋白对于促进成骨细胞增殖、分化机制的研究.方法:通过原代细胞培养:取新生24h的SD大鼠头盖骨,使用0.1％Ⅱ型胶原酶消化法分离出成骨细胞,使用碱性磷酸酶法鉴定成骨细胞,用MTT法确定葛根素对于促进成骨细胞增殖的最佳浓度和时间,取第四代的成骨细胞进行实验,实验分成4个组:其中对照组为10％ DMEM(low glucose),其它3组浓度分别为1 mg/mL,0.1 mg/mL和0.01 mg/mL的葛根素处理组.24h后,通过Western blot方法检测OPG/RANKL蛋白的表达.结果:通过碱性磷酸酶法、MTT法,可以鉴定不同浓度葛根素处理的成骨细胞中碱性磷酸酶活性均有增高.不同浓度的葛根素处理液均可以提高OPG/RANKL蛋白的表达,其中OPG、RANKL分别与对照组比较,具有统计学差异(P＜0.05).结论:葛根素可以通过OPG/RANKL系统促进成骨细胞的增殖和分化.     

葛根素对于体外培养成骨细胞OPG/RANKL基因系统表达的影响

目的:探讨葛根素通过OPG/RANKL系统对于促进成骨细胞增殖、分化机制的影响.方法:通过原代细胞培养:取新生24h的SD大鼠头盖骨,使用0.1％Ⅱ型胶原酶消化法分离出成骨细胞,使用碱性磷酸酶染色法鉴定成骨细胞,取第四代的成骨细胞进行实验,实验分成4个组,其中对照组为10％ DMEM( low glucose),其它3组浓度分别为1 mg/mL,0.1 mg/mL和0.01 mg/mL的葛根素处理组.24h后,进行realtime PCR检测OPG/RANKL基因的表达.结果:通过碱性磷酸酶染色法,可以在显微镜下观察到,成骨细胞胞浆内有许多细小棕色颗粒的存在.不同浓度的葛根素处理液可以提高OPG/RANKL系统的表达,其中OPG 0.1mg/mL组与对照组比较,具有统计学意义(P＜0.05).结论:葛根素可以促进成骨细胞OPG/RANKL系统的表达.     

冰片对葛根素透过体外模拟血脑屏障的影响

目的运用小鼠脑微血管内皮细胞(b End.3)制备血脑屏障(BBB)模型,探讨冰片对葛根素透过BBB的影响并初步探讨冰片促进BBB开放的主要途径。方法 MTT实验考察不同浓度冰片和葛根素对b End.3细胞的毒性作用,筛选实验药物浓度。应用BBB体外模型,以跨内皮细胞间电阻作为紧密连接程度的主要反应指标,观察冰片对其紧密连接的开放有无直接影响以及冰片对葛根素跨BBB转运的影响。结果经MTT实验确定冰片和葛根素的实验药物浓度均为50μmol/L。各组给药前与给药24 h后跨膜电阻(TEER)未见明显改变,葛根素组、冰片+葛根素组透过率分别为(59.96±5.90)%和(106.80±2.73)%,差异显著(P0.05)。结论冰片联合葛根素用药可以一定程度上促进葛根素透过BBB,但其开窍机制还需通过细胞的相关紧密连接蛋白水平和腺苷受体信号通路进一步探讨。     

葛根素对体内外晚期糖基化终末产物形成的抑制作用

目的研究葛根素对体内外晚期糖基化终末产物(AGEs)形成的影响。方法 C57BL/6小鼠采用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素(40 mg/kg)构建糖尿病模型。造模成功后随机分为模型组,氨基胍组(100 mg/kg),葛根素低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)组,另设对照组。连续给药8周后,检测空腹血糖(FBG)、口服糖耐量(OGTT)、糖化血清蛋白(GSP)及血清AGEs水平。此外将不同浓度的葛根素(0.5、1.0、2.0 mmol/L)与丙酮醛和牛血清白蛋白共孵育144 h,建立体外非酶糖基化反应模型,用荧光光度法测定AGEs的荧光值,考察葛根素体外抑制AGEs生成的规律。结果葛根素能够显著降低糖尿病小鼠的FBG,改善OGTT,抑制GSP及血清AGEs的生成。葛根素在体外非酶糖基化反应体系中抑制AGEs的生成,并有一定的剂量依赖性。结论葛根素可以显著降低糖尿病小鼠的FBG,对体内外AGEs的形成具有明显的抑制作用。     

葛根素固体分散体的分散状态及其体外评价

目的制备葛根素缓释固体分散体,考察其分散状态。方法以乙基纤维素为载体,制备葛根素缓释固体分散体,利用X射线衍射试验、差示扫描量热法对葛根素在其中的分散状态进行研究。并对该胶囊进行体外溶出度研究。结果X射线衍射图表明葛根素在固体分散体中有一部分葛根是以分子状态分散,而另一部分可能以微晶体状态分散。差示扫描量热法试验结果表明,所制备的缓释固体分散体中不存在药物结晶。溶出度试验结果表明,该缓释胶囊具有良好的缓释效果。结论采用固体分散技术制备的葛根素缓释固体分散体完全可以使药物达到高度分散状态,制备的葛根素缓释固体分散体具有较好的缓释效果。     

金雀黄素对离体人子宫肌瘤细胞增殖的影响

目的 :观察不同浓度金雀黄素对体外培养人子宫肌瘤细胞增殖的影响。方法 :应用MTT比色法研究金雀黄素对体外培养人子宫肌瘤细胞影响的量效关系和时效关系。结果 :低浓度的金雀黄素对子宫肌瘤细胞无抑制作用 ,达到一定浓度后才表现出抑制作用 ,并且呈浓度依赖性和时间依赖性。结论 :金雀黄素对体外培养的子宫肌瘤细胞具有抑制作用 ,可为临床应用金雀黄素提供参考依据。     

原花青素舒张家兔离体肺动脉的研究

目的:研究葡萄籽提取物原花青素(PC)对家兔离体肺动脉血管的舒张作用及机制.方法:采用家兔离体肺动脉平滑肌标本,以去甲肾上腺素(NA)预收缩后,给予PC(0.625,1.25,2.5 mg·L~(-1)),观察其舒张血管的量效关系;并分为对照组、PC组、Pc+吲哚美辛(1×10~(-5)mol.L~(-1)、PC+普萘洛尔(1×10~(-5)mol·L~(-1))、PC+左旋硝基精氨酸(1×10~(-4)mol·L~(-1))、Pc+甲烯蓝(1×10-5 mol.L~(-1))和PC+去内皮细胞7组,探讨PC舒张血管的机制;用PC(20 mg·L~(-1))温育标本后,观察Pc对NA(1 × 10~(-8)～1×10~(-5)mol·L~(-1)),KCI(6.3～100 mmol·L~(-1))和cacl:(1×10~(-5)～1×10~(-2)mol·L~(-1))量效曲线的影响.结果:PC能明显舒张肺动脉血管,并有量效关系(r=0.69,P＜0.01);去除血管内皮、L-NNA或MB可抑制PC的舒张作用,但吲哚美辛和普萘洛尔无影响;PC能压低NA,KCI和CaCl_2的量效收缩曲线,三者的pD2分别由对照的(7.57±2.41),(1.74±1.19),(3.72±1.88)降低为(6.47±1.42),(1.07±1.12),(3.17±1.55);PC也能抑制NA引起的第Ⅰ时相收缩,对CaCl_2引起的第Ⅱ时相收缩无影响.结论:PC舒张肺动脉的作用是内皮依赖性,且与NO/cGMP介导有关;也可能是拮抗ROC和PDC通道,降低胞浆Ca~(2+)而舒张血管.     

土木香内酯抗病毒作用的体内外研究

目的 探索土木香内酯体内外的抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)通路探究其抗病毒作用机制。方法 CCK-8法检测土木香内酯对A549细胞活力的影响;利用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,VSV-GFP)感染细胞模型,结合流式细胞术检测土木香内酯对病毒复制的影响;qRT-PCR检测土木香内酯对甲型流感病毒(influenza A virus,H1N1)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)复制的影响;Western blotting检测土木香内酯对VSV病毒G蛋白和H1N1病毒NP蛋白表达的影响;利用生物信息学初步分析土木香内酯的抗病毒分子机制;qRT-PCR检测药物处理后干扰素α1(interferon α1,Ifna1)、干扰素β1(interferon β1,Ifnb1)、干扰素诱导蛋白1(interferon-induced protein with tetratrico...     

甘草酸为稳定剂的葛根素纳米乳冻干粉的制备及体外评价

目的以天然表面活性剂甘草酸为稳定剂制备葛根素纳米乳冻干粉(puerarinnanoemulsionlyophilizedpowder,Pue-NE-LP),并对其进行体外评价。方法采用高速剪切联合高压均质法制备葛根素纳米乳(Pue-NE),进一步结合冷冻干燥法制备Pue-NE-LP。以平均粒径和多分散指数(PDI)作为评价指标,通过单因素试验筛选出最优处方及工艺参数。并对制备的Pue-NE-LP进行理化性质表征和体外溶出度测定。结果以5%辛癸酸甘油酯为油相,2.0 mg/mL甘草酸为稳定剂,7%葡萄糖为冻干保护剂制得的Pue-NE-LP平均粒径为(215.1±0.7)nm,PDI为0.133±0.024。扫描电镜显示Pue-NE-LP呈不规则的小片状,大小较均匀;X射线衍射显示Pue-NE-LP呈无定型状态存在。体外释放结果表明Pue-NE-LP的溶出度明显高于物理混合物。结论以天然表面活性剂甘草酸为稳定剂制备的Pue-NE-LP,不仅制备方法简单,而且能显著改善Pue的溶解性和生物利用度,为Pue-NE制剂的多元开发提供参考。     

葛根素骨架缓释片的研制及体外释放评价

目的:研制葛根素骨架缓释片,并评价其体外释药机制。方法:以不同型号的羟丙甲基纤维素(HPMC K100M,HPMC E4M)混合物为骨架材料,采用湿法制粒压片制备葛根素骨架缓释片,以葛根素释放度为指标,采用单因素试验法对缓释片的处方进行优化;通过测定释放度,考察葛根素骨架缓释片的体外释放模型。结果:优选的处方为HPMC K100M和HPMC E4M作为复合骨架材料,质量分数分别为片剂总质量的10%,20%;乳糖为填充剂,质量分数为片剂总质量的30%。制备的葛根素骨架缓释片释放规律符合Ritger-Peppas方程曲线,释药过程为药物扩散和骨架溶蚀协同作用。结论:葛根素骨架缓释片处方合理,制备工艺可行,制备的葛根素骨架缓释片具有良好的12 h体外释药特性。     

藤黄炮制品对大鼠肠道组织病理学研究

目的:观察藤黄各制剂单次大剂量ig给药后大鼠消化系统病变情况,并比较藤黄炮制前后对大鼠肠上皮细胞株IEC-6毒性差异,探讨藤黄炮制减毒机制.方法:单次ig给予藤黄生品(200 mg· kg-1)、清水制藤黄(200 mg· kg-1)和藤黄酸(50 mg· kg-1),观察给药后大鼠的活动情况,于24 h后处死并采集大鼠心、肝、肾、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠等主要脏器,观察大鼠口服给药后消化系统病变情况.以大鼠肠上皮细胞株IEC-6为研究对象,采用MTT法检测藤黄炮制前后对IEC-6细胞增殖的影响,采用倒置显微镜观察细胞形态.结果:病理切片结果显示,给药后大鼠的肝脏、肾脏、心脏、胃和食道均未见明显的毒性反应;但十二指肠、空肠有轻度至重度的毒性作用,表现为肠绒毛水肿.3种藤黄制剂均会引起给药大鼠肠道的毒性作用,生品藤黄所致的十二指肠和空肠水肿程度最严重,其次是清水制藤黄和藤黄酸.细胞的毒性结果显示,与空白组相比,藤黄生品及炮制品均可明显降低IEC-6细胞的活性(P＜0.01)与形态,且呈一定的剂量相关性;与藤黄生品组相比,藤黄3种炮制品组对IEC-6细胞的增殖抑制作用(P＜0.01)和形态变差的趋势均显著性降低.结论:藤黄单次大剂量ig给药后大鼠的病理变化及IEC-6细胞的毒性作用结果表明,藤黄经炮制后毒性显著降低.