自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

基因诊断正常宫颈乙肝病毒的应用体会

自1964年澳大利亚学者Blumberg研究发现乙型肝炎病毒（HaplitisBVirus，HBV）以来．由于分子生物学的进展．尤其是病毒分子生物学的进展，促使其基因诊断技术逐渐成熟，1988年起，DNA体外扩增技术，又称聚合酶链式反应（PCR）技术开始用于HBV－DNA的检测，使HBV的检测灵敏度较传统的血清学方法大为提高，而目前流行的“套叠式”PCR的扩增效力和检测敏感性更高。为了探讨正常子宜颈分泌物中HBV一DNA的分布情况，对于HBV的预防具有重要价值，有关这一研究迄今尚未见报道。我们应用Net－PCR技术对子宫颈分泌物进行了HBV－DNA…     

中国株乙型肝炎病毒全基因组克隆的制备与鉴定

目的：扩增全长HBV DNA基因组，建立中国株HBV感染性克隆，阐述HBV基因组变异对其不同基因生物学特性影响。方法：TD－PCR和XL－PCR技术一次扩增HBV全长基因组，克隆，PCR、酶切和测序鉴定，结果：通过PCR、酶切，测序鉴定和真核细胞转染分析，获得全长HBV基因组克隆。结论：获得了HBV全基因组克隆，在真核细胞中可以表达HBsAg，为建立HBV感染性克隆奠定物质基础。     

低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定

目的：从乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）低拷贝的血清样本中提取病毒DNA并通过PCR扩增得到全长DNA片段。将全长片段经过环化处理后转染HuH7细胞,体外评价病毒的复制水平。方法：设计含有BspQⅠ酶切位点的HBV全长扩增引物和分段扩增引物,选择HBV低拷贝的临床病人血清样本,经抽提纯化后的病毒DNA作为模板,用巢式PCR结合分段扩增的方法扩增得到HBV全长DNA,PCR产物经BspQⅠ酶切后自连环化,将环化的HBV DNA转染HuH 7细胞,经5 d细胞培养,提取细胞中的病毒复制中间体,通过Southern blot分析病毒复制水平。结果：通过PCR扩增得到5个HBV全长DNA,经过酶切连接全长基因后转染HuH7细胞,Southern blot检测均有复制表达。结论：本实验成功构建能够有复制表达的HBV环化全长,为研究血清中低拷贝HBV病毒的不同病人复制水平与DNA序列关系打下基础。     

一种新的HBV DNA rtA181T耐药突变检测方法

目的:通过巢式PCR及特异引物,建立一种新的乙肝病毒(HBV) DNA rtA181T耐药突变的PCR直接扩增检测方法?方法:巢式PCR方法第1轮扩增HBV DNA 逆转录酶rt活性域片段,第2轮PCR上游引物3′末端碱基设计为与HBV DNA rtA181T突变碱基相同的碱基,扩增出的目的基因片段,即为突变片段?利用该方法,本文检测了43例HBV DNA rtA181T变异标本,分析该方法检测的灵敏性;并比较分析低拷贝HBV DNA水平与高拷贝HBV DNA水平下,该方法与PCR-Sanger测序法检测HBV DNA rtA181T突变的一致性?结果:产物经测序证实,突变检测引物巢式PCR法能扩增出HBV DNA rtA181T耐药突变?在HBV DNA水平为24 U/?滋L?rtA181T突变株含量低至10%时,该方法仍能较好检测出rtA181T变异片段?对43例不同拷贝水平的HBV DNA rtA181T耐药变异临床标本检测显示,该方法检测灵敏性达100%,常规PCR-Sanger测序灵敏性为74%,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:基于巢式PCR及突变引物为基础的HBV DNA rtA181T耐药突变PCR直接检测法能较好地检测HBV DNA rtA181T耐药变异发生;对HBV DNA低拷贝水平下的rtA181T耐药变异检测,该方法灵敏性优于Sanger测序法,且有较好的特异性?这对早期发现HBV DNA耐药突变?及时更改抗HBV治疗策略具有重要临床指导意义?     

慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒C基因启动子变导异的初步研究

为建立快速特异检测乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA的聚合酶链式反应（PCR）方法,产初步分析患者体内乙型肝炎病毒C基因启动子（HBV.CP）变异的情况,对PCR法扩增的HBV DNA直接测序,并应用计算机进行DNA同源性分析。结果显示：应用PCR法扩增20份慢性乙肝患者血清阳性率为95%（19/20）;选择中度、重度乙肝患者血清和pGEM.7Z-HBV质粒扩增的HBV.CP各1份分别测序,与报告基因的同源性分别为72.0%、66.5%、90.0%。研究表明,PCR法可用于HBV.CP区变异的检测,慢性乙型肝炎患者存在该区变异。     

PCR HBV S、C基因扩增试剂盒研制成功

最近,本研究所应用北京医科大学合成HBV S、C基因引物、华美公司生产耐热DNA聚合酶,进行了聚合酶链式反应(简称PCR)试验扩增HBV片断基因,并研制成试剂盒用于部分临床标本检测,获得良好效果。 PCR扩增HBV基因试验具有快速、灵敏度高、特异性强、不需用放射性同位素等特点。应用PCR扩增法60min可扩增HBV基因30个循环,能获得大     

酶切联合巢式PCR法检测外周血单个核细胞中的HBV DNA与HBVcccDNA

目的:检测慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV的存在状态.方法:采用巢式PCR法检测慢性HBV感染者PBMCs中的HBV DNA;用Hirt法、绿豆核酸酶、设计跨越单链区和三链区巢式PCR引物,以尽可能去除rcDNA的影响,检测共价闭合环状DNA(eccDNA).结果:采用酶切联合巢式PCR法在慢性HBV感染者PBMCs中可扩增出cccDNA,同时未扩增出rcDNA;120例慢性HBV感染者PB-MCs中HBV DNA,cccDNA阳性检出率分别为62.5%,45.8%,HBV DNA阳性检出率明显高于cccDNA(P<0.01);其中HBeAg阳性组PBMCs中HBV DNA检出率(80.0%)和cccDNA阳性率(45.0%)均明显高于HBeAg阴性组(61.7%,30.0%,P<0.01).结论:酶切联合巢式PCR法检测cccDNA可有效避免roDNA对cccDNA扩增的干扰;结果表明乙肝病毒不仅可感染PBMCs,并可在其中复制;HBcAg阳性者PB-MCs中HBV DNA及cccDNA检出率高.     

金纳米颗粒基因探针同步检测HBV和HCV的初步研究

目的 建立一种简单、快速同时检测HBV DNA和HCV RNA的诊断方法.方法 利用PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中HBV DNA和HCV cDNA并提取.制备Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针.在含有Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针的液相检测体系中加入HBV DNA和(或)HCV cDNA,透射电镜下观察.结果 PCR(可扩增HBV DNA和HCV cDNA.出现预期的431bp和323bp特异性条带.使用Au纳米颗粒基因探针通过透射电镜可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中提取的HBV DNA和HCV RNA.结论 通过透射电镜,使用Au纳米颗粒基因探针可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中的HBV DNA和HCV cDNA,甚至可达到无需PCR水平,此方法具有敏感性高、特异性好的特点.     

应用竞争聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的探讨竞争聚合酶链反应(C-PCR)在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义。方法根据中国人群最常见的HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,并制备内对照DNA,将适量的内对照DNA加入到常规HBV DNA PCR检测反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增。结果在20μl C-PCR反应体系中,加入约100～500拷贝内对照DNA能够有效的获得共扩增信号;在120个临床血清标本的C-PCR扩增中识别出5个不能有效扩增的标本。结论C-PCR能够有效地指示临床标本HBV DNA体外扩增的假阴性。     

耐拉米夫定乙型肝炎病毒变异株全基因组克隆及鉴定

目的:扩增并克隆耐拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)变异株全基因组DNA,为构建含双体HBV YMDDDNA质粒和HBV YMDD变异株细胞模型及研究药物筛选奠定基础。方法:从一名耐拉米夫定的慢性乙型肝炎病人血清中提取HBV病毒DNA,用错配PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)进行变异分析,然后采用PCR方法在HBV负链开环缺口处及基因组中单一酶切点(SpeⅠ)处,设计两对引物从两个方向分别扩增1.15 kb和2.05 kb的单链及双链DNA区,利用基因重组技术,将两片连接后克隆至质粒pcDNA3.1-中,再进行DNA序列测定。结果:错配PCR结合RFLP分析证实该病毒存在YVDD变异,通过两段法克隆出HBV全基因组,经序列分析所得为HBV YMDD变异株全基因组。结论:成功克隆出HBV YMDD变异株全基因组。     

Nested PCR检测HBV DNA技术的建立与应用

本研究建立一种Nested PCR技术检测HBV DNA,即采用内外两对引物分别进行连续两次扩增,使检测极限由一次PCR的10~(-2)Pg提高到10~(-5)Pg;经~(32)P标记寡核苷酸探针作Southern转移杂交以及BgIⅡ作酶切分析证实两次扩增均为特异性扩增。通过抗-HBe阳性、单项抗一HBc阳性和单项抗-HBs阳性三种血清的HBV DNA的检测,表明该方法确能检出标准PCR所不能检出的极低水平的HBV感染,对提高乙型肝炎的诊断水平及更准确地评价药物疗效有重要意义。     

应用多聚酶链式反应进行血清HBV DNA的检测

聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction PCR)是近年建立的一种快速、敏感、特异的体外DNA扩增技术。最近,我们用PCR方法对HBsAg(-)/HBeAg(-)的一组人群进行了血清HBV DNA的检测,结果摘要报道如下。     

含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒DNA稳定复制细胞系的构建

目的构建含有临床病毒株聚合酶逆转录酶(RT)区的乙肝病毒(HBV)DNA稳定复制细胞系。方法采用巢式PCR从患者血清扩增HBV DNA片段,利用片段置换反应将该片段克隆到HBV DNA复制载体,并在该载体上引入新霉素抗性基因,在确认该重组DNA体外可复制后,将其转染HepG2细胞,G418筛选,采用real-time PCR结合ELISA及Southern blot检测初筛和鉴定HBV DNA稳定复制细胞系。结果从患者血清扩增出的HBV DNA片段nt55～1654被成功置换到HBV复制质粒pLL相应区域,得到质粒p11;新霉素抗性基因表达片段被克隆到p11中HBV DNA下游,获得质粒p11-neo,Southern blot检测证实p11-neo可支持体外复制;p11-neo转染HepG2后,经筛选鉴定,获得了可支持HBV DNA稳定复制的细胞系3-10。结论建立了含有临床病毒株聚合酶RT区的HBV DNA稳定复制细胞系,real-time PCR结合ELISA有助于HBV DNA稳定复制细胞系的快速初筛鉴定。     

应用PCR技术检测HBsAg携带者血清中HBV DNA

应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增38例HBsAg携带者和58例正常人血清中的HBV DNA特异性片段,通过与HBsAg滴度及HBV血清标志物进行对比分析,发现HBV DNA阳性率与HBsAg滴度呈正相关(r=0.981,P<0.005),与HBeAg减低、抗-HBe产生以及其后的e系统消失过程呈相应递减趋势。并且在单项抗-HBs阳性的血清中,HBV DNA检出率可达10％。     

聚合酶链反应检测血清HBV-DNA的临床价值

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外DNA扩增技术,本文采用PCR技术检测乙型肝炎病毒(HBV-DNA),并与乙肝病毒标志物进行对比,以探讨HBV感染状态及与乙肝标志物(HBV-M)之间的关系.     

血清中乙型肝炎病毒全基因组及X基因的克隆与鉴定

目的:建立从血清样品直接扩增乙型肝炎病毒(HBV)全长DNA的方法,构建HBV全基因组克隆.方法:用长链PCR从血清样品一次性扩增HBV全长DNA,测序鉴定后插入质粒puc19构建含HBV全基因组的重组质粒,再从重组质粒扩增X基因并进行序列分析.结果:经DNA序列测定和酶切分析,获得HBV全基因组克隆,从克隆的HBV全基因组扩增到X基因.结论:从血清中可直接扩增到HBV全基因组DNA,为整体水平研究HBV基因组的变异与其致病及宿主抗感染免疫之间的关系奠定了实验基础.     

荧光定量PCR检测HBV DNA的临床价值

目的 乙肝两对半与HBV DNA检测结果不符的一些探讨。方法 ELISAF方法检测两对半和荧光定量PCR检测HBV DNA，扩增片段为314bp。结果 大三阳HBV DNA阳性率为92％，小三阳为16．47％。结论 乙肝患者或HBV携带者做HBV DNA检测，以确定其是否有传染性及提示有HBV基因变异的可能。多次检测HBV DNA可实时观察抗病毒疗效。     

HBV C区基因克隆和PCR条件优化

目的 建立PCR优化条件和方法,探讨HBV C区基因在乙型肝炎PCR检测中的应用价值,为荧光定量PCR检测HBV摸索条件.方法 将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌,SDS碱裂解法小量提取大肠杆菌阳性构建质粒DNA,设计合适引物对HBV C区基因进行PCR扩增,对PCR条件中的退火温度、Mg2＋浓度进行了优化,并比较三种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度.结果 转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃,最佳Mg2＋浓度为1.5mM,同时确定天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶灵敏度最高,扩增到10-6.结论 确立了HBV C区PCR的优化条件,将为后期进行荧光定量PCR检测HBV感染奠定基础以及为探索更有效的检测方法提供实验依据.     

Alu-PCR检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5基因组中乙型肝炎病毒DNA的整合

目的 应用Alu-PCR方法检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的整合。 方法 提取经培养扩增的人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组DNA,根据Alu-PCR方法经过3轮PCR反应扩增潜在的HBV DNA和人基因组DNA整合片段。琼脂糖凝胶电泳观察PCR 扩增产物片段,切取并纯化整合阳性的电泳条带,对纯化产物进行核酸测序,得到整合片段的核苷酸序列。 结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,用Alu-PCR方法能够从PLC/PRF/5 细胞株中扩增得到4条HBV DNA整合序列,经测序后与比对其中3条整合序列能够定位于人染色体03p21.31、05p15.33、12q13.12~q14.1。 结论 Alu-PCR可以准确测定肝细胞中HBV DNA的整合,为研究HBV DNA在肝细胞中的整合研究提供了一个简单、经济的方法。