抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。     

抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备可用于胶体金快速检测试条的抗CP4-EPSPS(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(Ⅲ5A3,Ⅲ13A2)。其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1∶106和1∶108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上。ELISA相加实验结果显示2株mAb识别相同或相近的抗原表位。结论成功地制备出抗CP4-EPSPS的2株mAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具。     

夹心ELISA检测可溶型LAIR-1方法的建立及其应用的研究

为了探讨血清可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体 1 (sLAIR 1 )的水平与疾病的关系 ,用生物传感器鉴定了 3种抗LAIR 1分子胞膜外区mAb识别的表位 ,并应用 2种识别不同LAIR 1表位的mAb首次建立了检测sLAIR 1的夹心ELISA方法 ,其检测灵敏度达到 1 5 μg/L。以此方法检测了活化的人PBMC培养上清以及正常人和肾综合征出血热 (HFRS )患者血清中sLAIR 1的水平。在经PMA、PHA、LPS和抗CD3mAb活化的人PBMC细胞培养上清中检测到sLAIR 1。 2 4例正常人血清sLAIR 1的平均水平为 (6 2± 3 3) μg/L ,6 2例HFRS患者血清sLAIR 1的平均水平为 (4 7 2± 35 9) μg/L。证明体内和体外存在天然sLAIR 1。HFRS患者血清sLAIR 1水平明显升高。为进一步研究LAIR 1分子的免疫调节功能及其在临床免疫中的应用提供了新的手段     

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立

目的 制备和鉴定禽流感病毒(H5N1)血凝素(H5)特异性单克隆抗体(mAb),建立H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法.方法 以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb,利用血凝抑制(HI)实验筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验筛选捕获抗体和检测抗体,建立测定H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法.结果 获得16株特异性针对H5的单克隆抗体,与A型流感病毒H1、H3、H7、H9和B型流感病毒的血凝素无HI交叉反应,对H5血凝素的血凝抑制效价为1:100～1:51 200;通过配对实验,建立以单克隆抗体H5M9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA;检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位,检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性.结论 建立了一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法,可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断.     

抗大鼠Nogo分子单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备抗大鼠Nogo分子单克隆抗体(mAb)，为研究Nogo分子的组织分布和功能提供实验手段。方法：应用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠源性抗大鼠Nogo mAb。用免疫荧光组织化学技术，对Nogo分子在大鼠中枢神经系统(CNS)的分布进行鉴定。结果：获得3株分泌抗Nogo mAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA测定腹水效价达10^-6，两株mAb为IgG1(κ)亚类，另一株为IgG2b(κ)，在免疫荧光组织化学技术应用中获得较满意效果。结论：获得3株能特异性识别天然Nogo分子的mAb，为进一步研究Nogo分子的结构和功能奠定了基础。     

夹心ELISA检测N端利用物因子A(NusA)标签融合蛋白

目的创建基于夹心ELISA原理的定性和定量检测N端利用物因子A(NusA)标签融合蛋白的方法,为NusA标签融合蛋白的鉴定提供新的手段。方法以NusA标签蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性识别NusA标签蛋白的单克隆抗体(mAb),常规标记辣根过氧化物酶,方阵法筛选夹心ELISA的配对抗体。结果获得14株NusA标签蛋白特异性mAb并最终确定一对可用于夹心ELISA检测的NusA特异性mAb。以NusA No.1作为捕获抗体, NusA No.10为检测抗体。结论成功建立双抗体夹心ELISA检测NusA标签融合蛋白的方法,检测敏感度可达1.5 ng/mL。     

抗森林脑炎病毒单克隆抗体的制备及夹心ELISA的建立

目的: 制备抗森林脑炎 (TBE)病毒单克隆抗体(mAb), 建立夹心ELISA法检测森林脑炎病毒。方法: 以纯化的TBE病毒抗原加福氏佐剂, 免疫BALB/c小鼠, 制备鼠源性TBE病毒mAb。并用mAb建立夹心ELISA法测定病毒抗原的效价。结果: 获得了 6株TBE病毒mAb杂交瘤细胞株, 它们均属于Ig亚类。mAb杂交瘤细胞培养液上清的效价为 1×10-3 ~1×10-4; 腹水效价为 1×10-6 ~1×10-7。结论:获得的 6株能特异性识别TBE病毒的mAb, 可用于免疫学检测, 为进一步研究TBE病毒的生物学性状奠定了基础。     

抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F单克隆抗体制备及夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F(OprF)的单克隆抗体(mAb),并建立双mAb夹心ELISA检测方法。方法:利用分子生物学方法克隆OprF基因,诱导表达并纯化OprF。用OprF免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb,并用ELISA法测定mAb的免疫活性;建立检测铜绿假单胞菌的双mAb夹心ELISA方法,并对其敏感性、特异性进行初步评价。结果:成功地克隆OprF基因,经诱导表达获得铜绿假单胞菌的OprF。通过杂交瘤技术筛选出4株mAb:6D8F7、2H2B6、3C2F5和7B5D9,经鉴定mAb 6D8F7可作为捕获抗体,mAb 7B5D9被HRP标记后可作为检测抗体,以这2株mAb建立的双mAb夹心ELISA方法重复性好、特异性强,敏感性高达到1×103集落形成单位(CFU/mL)。检测的线性范围为1×103～108CFU/mL。与传统的细菌分离方法比较,检测临床标本的符合率高达94.7%。结论:通过杂交瘤技术制备抗铜绿假单胞菌OprF的mAb,并建立了高特异性、高敏感性检测铜绿假单胞菌抗原的双mAb夹心ELISA方法,可用于临床检测铜绿假单胞菌的感染。     

抗人RANTES分子单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗人RANTES分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定,为研究RANTES分子的组织分布和功能提供实验手段。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备小鼠源性抗人RANTESmAb。用ELISA法鉴定腹水mAb的效价。用Q FastFlow阴离子交换柱纯化mAb。用Westernblot鉴定mAb的抗原结合活性。用免疫组化染色法,对RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠移植肠组织中的分布进行鉴定。结果:获得4株分泌抗RANTESmAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6,3株mAb为IgG1亚类(κ),1株为IgG2b(κ)。Westernblot的结果显示,3株mAb与人RANTES均有良好的结合活性。用3株mAb进行免疫组化染色的结果显示,RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠小肠腺上皮细胞胞质中呈高表达。结论:获得4株能特异性识别天然RANTES分子的mAb。大鼠小肠移植后其肠上皮细胞中可高水平地表达RANTES。     

抗HIV-1 p24 单克隆抗体的制备、特性鉴定及初步应用

目的：制备抗HIV-1p24单克隆抗体（mAb）及特性鉴定。方法：采用细胞融合技术制备可稳定分泌抗HIV-1p24mAb的杂交瘤细胞。选择高效价、识别不同抗原表位的mAb纯化后，分别包被ELISA板及作为酶标记mAb，建立双mAb夹心ELISA法，检测400份正常人血浆，20份抗HIV抗体阳性（p24抗原阴性）的血浆，20份HIV-1感染的细胞培养上清及HIV-1p24抗原国家参考品，并同时用进口p24抗原检测试剂盒进行对比检测。结果：经细胞融合、筛选、克隆化，共获得10株可分泌高效价mAb的杂交瘤细胞。纯化的腹水mAb经配对试验，选A值≥2．50的2株mAb建立的双mAb夹心ELISA法，敏感性可达2．5ng／L，且与进口试剂盒检测结果的一致性良好。结论：建立了具有高度敏感性和特异性的双mAb夹心ELISA法，为研制可用于检测HIV-1p24抗原的试剂盒奠定了基础。     

LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)推定配体分布的研究

目的：研究LAIR-1（CD305）及LAIR-2（CD306）推定配体在多种细胞系上的分布，为鉴定LAIR-1／LAIR-2推定配体提供了实验依据。方法：建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系。以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色，用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达，并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点。结果：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达，在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达。LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合，可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体（mAb）FMU-LAIR-2．2和FMU-LAIR-2．1阻断。结论：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致，主要表达于WISH、C32、293T和ECV304细胞系。LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体。     

肿瘤患者外周血中抑制性受体LAIR-1表达升高

目的:研究LAIR-1在肿瘤患者中的表达,探讨其在抗肿瘤免疫应答中的作用.方法:应用夹心ELISA检测肿瘤患者血清中可溶型sLAIR-1的水平;应用免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察LAIR-1在患者PBMC中NK细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞和B细胞上的表达.结果:肿瘤患者血清sLAIR-1水平为(4.6±3.2) μg/ L,明显高于正常人血清sLAIR-1 水平(3.9±3.0) μg/L,P<0.05.NK细胞,CD4 T细胞及CD8 T细胞表达LAIR-1水平上调.肺癌患者CD4/CD8比值明显低于正常人,B细胞百分率明显高于正常人.NK细胞、CD4 T细胞CD8 T细胞中LAIR-1的表达阳性率高于对照组.结论:在肿瘤患者LAIR-1分子表达水平高于正常人.肿瘤患者抑制性受体LAIR-1 表达水平的上调可能与肿瘤的免疫逃逸有关.     

Establishment of an ELISA system for determining soluble LAIR-1 levels in sera of patients with HFRS and kidney transplant

LAIR-1, the leukocyte-associated Ig-like receptor-1, is a trans-membrane molecule that functions as an inhibitory receptor on natural killer cells, T lymphocytes and monocytes. It has been well known that many trans-membrane receptors can shed from the cell surface and be released into the circulation in soluble form when lymphocytes, endothelials and other immune cells are activated. In many cases, the levels of soluble receptors in the circulation can be used as markers of lymphocyte activation in transplant patients and virus infection patients. To investigate whether LAIR-1 is able to be released into the sera, we developed a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system based on two anti-LAIR-1 monoclonal antibodies (MAb) with different epitope specificities. Using this ELISA, we found that sLAIR-1 existed in the supernatants collected from PMA, PHA or CD3 MAb-stimulated lymphocytes cultures in vitro for the first time. Moreover, we found that LAIR-1 level in serum samples from healthy individuals was 6.2 +/- 3.3 ng/ml, whereas the levels in sera of patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and patients 3-7 days after kidney transplant increased to 47.2 +/- 35.9 and 24.4 +/- 16.0 ng/ml, respectively. Furthermore, HFRS patients in oliguric phase showed higher serum sLAIR-1 levels than those in other phases, and transplant patients with rejection showed higher serum sLAIR-1 level than those without rejection. These findings demonstrated that LAIR-1 can be released when lymphocytes are activated, suggesting sLAIR-1 may be used as a predictor for monitoring immune reaction in some virus infections and organ transplants which may be useful in clinical treatment of these diseases.     

一种快捷、定量检测烟曲霉GM抗原双mAb夹心ELISA的方法

目的 :建立一种快速诊断烟曲霉病的双mAb夹心ELISA法。方法 :应用 4株抗烟曲霉GM单克隆抗体 (mAb) ,分别包被和制备HRP mAb ,用双mAb夹心ELISA法配对试验 ,选择捕获及检测mAb。结果 :经筛选得到捕获及检测mAb的最佳组合 ,并建立了双mAb夹心ELISA法。该法检测GM抗原的灵敏度为 0 .1μg/L ,测出范围在 0 .1～ 10 μg/L之间。连续 6d用ELISA法检测同一份样品 ,所获CV的平均值为 ( 7.2± 3.8) %。结论 :建立了一种可快速、定量检测烟曲霉GM抗原的双mAb夹心ELISA法 ,灵敏度高、重复性好 ,对研制试剂盒应用于烟曲霉病早期诊断和防治 ,具有重要的临床应用价值     

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体( mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法.方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定.辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法.结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性.并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL.结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础.     

检测可溶型CD226双mAb夹心ELISA的建立及初步应用

目的 :建立一种检测可溶型CD2 2 6 (sCD2 2 6 )的双mAb夹心ELISA ,并用于临床标本的检测。方法 :确定包被mAbLeoA1和HRP mAbFMU3的最佳工作浓度及最佳稀释液后 ,建立双mAb夹心ELISA ,并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行鉴定。再以建立的方法检测临床标本。结果 :包被mAbLeoA1的最佳工作浓度为 2 .5mg/L ,HRP mAbFMU3的最佳工作浓度 1∶4 0 0 ,标准品及HRP mAb的最佳稀释液分别为 1g/LBSA 1mL/LTween2 0 PBS和 30 g/LPEG PBS .建立的双mAb夹心ELISA ,其特异性 (与人IgG无交叉反应 ,阻断实验中阻断效应呈剂量依赖性 )、敏感性 (检出下限为 110ng/L标准品CD2 2 6 /Fc融合蛋白 )及稳定性 (CV <10 .2 % )均较良好。对部分临床标本的检测中 ,发现 6例类风湿关节炎(RA)患者血清sCD2 2 6的水平升高 ,与正常人血清sCD2 2 6水平相比差异显著 (P <0 .0 1)。结论 :建立一种特异性高、重复性好、较敏感的检测sCD2 2 6的双mAb夹心ELISA ,初步证明可用于临床标本的检测     

抑制性受体LAIR-1对巨核谱系分化的调节作用

 目的 研究抑制性受体LAIR-1在巨核谱系细胞的表达及其对巨核细胞分化的调节作用。方法 采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测LAIR-1在巨核谱系细胞的表达；免疫磁珠法纯化脐血CD34+细胞，体外无血清培养系统诱导CD34+细胞向巨核细胞分化，观察LAIR-1被抗体或配体交联激活后对巨核细胞分化的影响。结果 LAIR-1表达于人骨髓CD34+CD41a+和CD41a+CD42b+细胞以及脐血CD34+CD41a-和CD34+CD41a+细胞；脐血CD34+细胞向巨核细胞分化过程中，LAIR-1表达在倍性为2N和4N的不成熟CD41a+细胞上；交联激活LAIR-1分子能够抑制脐血CD34+细胞向巨核细胞的分化。结论 LAIR-1可能是参与巨核细胞早期分化发育的一种新的负调控分子。     

抗人白细胞介素15单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的 :制备鼠抗人白细胞介素 15(hIL 15)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。方法 :自重组人白细胞介素 15(rhIL 15)基因工程菌中 ,提取融合蛋白GST IL 15,以 12 0g/LSDS PAGE分离鉴定 ,切取含有目的条带的凝胶 ,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 / 0骨髓瘤细胞常规融合 ,依次进行HAT选择培养 ,间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及克隆化。对杂交瘤细胞株的稳定性及其分泌的mAb的特性进行鉴定。另外 ,以rhIL 15包涵体蛋白 (rhIL 15IBP)免疫新西兰白兔 ,制备抗hIL 15的多克隆抗体 (多抗 )。用抗hIL 15的mAb与多抗建立双抗体夹心间接ELISA。结果 :获得 1株可稳定分泌特异性抗hIL 15mAb的杂交瘤细胞。建立了双抗体夹心间接ELISA ,检测rhIL 15蛋白的敏感性达 10 μg/L。结论 :成功地制备抗hIL 15mAb ,并建立了一种可用于hIL 15检测的双抗体夹心间接ELISA。     

Development of a rapid, immunochromatographic strip test for serum asialo alpha1-acid glycoprotein in patients with hepatic disease

Serum asialoglycoprotein (desialylated glycoproteins) concentrations have been reported to be elevated in patients with hepatic disease as compared with that of normal subjects. We recently developed a solid-phase sandwich assay for asialo alpha1-acid glycoprotein (AsAGP) as a representative of the serum asialoglycoproteins and evaluated the utility of this AsAGP as a diagnostic marker for liver cirrhosis (LC) and/or hepatocellular carcinoma (HCC). In this study, we developed a rapid, one-step immunochromatographic strip capable of specifically detecting AsAGP in serum specimens. We have produced a monoclonal antibody (mAb) to AGP, and based on ELISA and Western blot analysis, we have selected four hybridoma clones which generated mAbs to recognize AsAGP. In the immunochromatographic strip test, one mAb was used for conjugation with colloidal gold microparticles. Ricinus communis agglutinin (RCA) was immobilized onto a nitrocellulose membrane strip to form a result line in the path of chromatographic migration. Likewise, a control line was created above the result line by the immobilization of anti-mouse IgG. A serum specimen was then applied to the sample pad. The AsAGP in the sample specifically bound to the microparticles via mAb (As16.89) and co-migrated upward until the AsAGP was sandwiched with the immobilized lectin (RCA), revealing a visible result line. The colloidal gold microparticles without bound AsAGP continued to migrate, forming a visible control line. Thus, an AsAGP-positive specimen (>1.5 microg/mL) yielded a result line and a control line, whereas an AsAGP-negative specimen (<1.5 microg/mL) produced only a single control line. The entire test procedure was completed in less than 5 min. In order to examine the reliability of the testing procedures, we carried out the immunochromatographic strip test with 102 serum samples and compared the results of these tests with those obtained by ELISA. The two methods showed excellent correlation, with 83-100% above/below the cut-off value (1.5 microg/mL). Therefore, we concluded that the results of the immunochromatographic test are in excellent accordance with those of the sandwich ELISA.     

A novel monoclonal antibodies-based sandwich ELISA for detection of serotype 4 fowl adenovirus

As a major causative agent for hepatitis-hydropericardium syndrome (HPS) in chickens, serotype 4 fowl adenovirus (FAdV-4) has caused huge economic losses in the poultry industry globally. However, there is no commercial diagnostic test for FAdV-4 antigens. To generate a rapid approach for specific detection of FAdV-4, a monoclonal antibodies (mAbs)-based sandwich ELISA was developed. In this ELISA, a purified mAb 4A3 and a HRP-labelled mAb 3C2 specific to the fiber-2 of FAdV-4 were used as the capture antibody and detection antibody respectively. Specificity assay revealed the ELISA only reacted with FAdV-4, not with other avian viruses tested. Sensitivity assay showed the limit of detection of the ELISA was 1000 TCID₅₀/ml and 12.5?ng/ml for the FAdV-4 and the purified GST-Fiber2 protein respectively. Moreover, the ELISA could be efficiently applied in detecting the FAdV-4 in tissue samples from a clinically-diseased chicken flock. All these data demonstrated that the ELISA developed here provides a promising tool for rapid and efficient diagnosis of clinical infection with FAdV-4.