一氧化碳对白桦悬浮细胞生长和三萜累积的影响

目的分析外源一氧化碳(CO)对白桦悬浮细胞生长和三萜累积的影响。方法在白桦悬浮细胞培养的第8天添加5、10、20、30μmol/L的CO供体高铁血红素处理0.25～8 d,采用高效液相色谱法、比色法和实时荧光定量PCR方法分析白桦三萜含量及其合成关键酶基因的表达。结果除20和30μmol/L CO处理2 d后显著降低白桦悬浮细胞干质量外,CO处理未对白桦悬浮细胞干质量产生显著影响。除30μmol/L CO处理提高pH值和丙二醛含量外,CO处理未对pH值和丙二醛含量产生显著影响。CO处理不同程度地增加了三萜、白桦酯醇和齐墩果酸含量,其中,30μmol/L CO处理1 d时三萜积累量达最大值,为同期对照的1.3倍;10μmol/L CO处理4 d时白桦酯醇含量达最高值,为对照的1.5倍;10μmol/L CO处理2 d时齐墩果酸含量达最高值,为对照的4.2倍。三萜合成关键酶FPPS、LUS、CAS1、CAS2和β-AS基因的实时荧光定量PCR检测结果进一步证实了CO对白桦三萜累积的促进作用。结论 CO处理促进了白桦悬浮细胞中三萜的合成。     

多胺介导真菌诱导子促进白桦三萜积累的初步研究

目的 明确内源多胺是否介导真菌诱导子诱导白桦三萜的合成。方法 将40 μg/mL真菌诱导子、1 mmol/L腐胺（Put）和2 mmol/L多胺合成抑制剂D-精氨酸（D-Arg）添加到培养8 d的白桦悬浮培养体系中,利用HPLC法和比色法分析多胺量和三萜量。采用药理学和恢复实验分析多胺在真菌诱导子诱导白桦三萜合成中的作用。结果 真菌诱导子或Put处理后,白桦悬浮细胞中的多胺量、三萜量和产量均呈增加趋势,其中处理24 h时,三萜量达最大值,分别增加了68.54%和30.34%。真菌诱导子和Put共同处理虽提高了三萜量,但其产量却低于真菌诱导子单独处理。真菌诱导子和D-Arg共同处理后三萜量低于真菌诱导子单独处理,处理24 h时降低程度最高,为40.57%。恢复实验发现,随着恢复时间的延长,真菌诱导子、Put以及真菌诱导子与D-Arg对白桦三萜合成的影响逐渐减弱,恢复到对照水平。结论 多胺介导了真菌诱导子促进白桦悬浮细胞中三萜的合成。     

多胺对白桦悬浮细胞生长和三萜积累的影响

目的 分析外源多胺对白桦悬浮细胞生长和三萜积累的影响。方法 在白桦悬浮细胞的生长末期添加0.1 mmol/L和1.0 mmol/L的腐胺（Put）、精胺（Spm）和亚精胺（Spd）,采用比色法和RT-PCR方法分析白桦三萜量及其合成关键酶羽扇豆醇合酶（LUS）基因的表达。结果 除1.0 mmol/L Spm处理使白桦悬浮细胞的活力和干质量积累降低外,其他处理均提高了白桦悬浮细胞的活力、干质量积累和三萜产量,且随着处理时间的延长,干质量积累和三萜产量呈增加趋势。其中1.0 mmol/L Put在处理的第2天对细胞干质量和三萜产量的促进效应最大,分别比对照增加了38.89%和116.35%。LUS基因的RT-PCR检测结果进一步证实了多胺对白桦三萜积累的促进作用。结论 Put可有效促进白桦悬浮细胞生长和三萜积累。     

腐胺与过氧化氢交互调控白桦三萜合成的初步研究

目的 分析腐胺和过氧化氢调控白桦三萜合成中是否存在交互作用。方法 在白桦悬浮细胞的生长末期添加1 mmol/L腐胺（Put）、0.1 mmol/L过氧化氢（H₂O₂）和40 μg/mL真菌诱导子,采用比色法、高效液相色谱法和荧光显微镜分析白桦悬浮细胞中三萜量、多胺量和H₂O₂荧光强度变化。结果 1 mmol/L Put增加了细胞中H₂O₂的荧光强度和三萜量。0.1 mmol/L H₂O₂促进了三萜合成,却抑制了多胺中亚精胺（Spd）、精胺（Spm）的合成,而对Put无影响。Put与H₂O₂同时处理组,细胞中H₂O₂的荧光强度和多胺的量均介于Put与H₂O₂单独处理组之间,而三萜量却显著高于其单独处理组;进一步药理学实验分析发现,真菌诱导子与H₂O₂清除剂过氧化氢酶（CAT）处理后,细胞中的Put和Spd量比真菌诱导后增加了0.62%和16.05%,而对Spm无显著影响。真菌诱导子与多胺（Pas）合成抑制剂D-精氨酸（D-arg）处理组,细胞中的H₂O₂荧光强度比真菌诱导子处理组有所降低了;在真菌诱导子、CAT和D-arg同时处理下,细胞中的H₂O₂荧光强度、PAs量和三萜量均低于真菌诱导子与CAT或D-arg处理,但三萜量仍高于对照组。结论 Put与H₂O₂在促进白桦三萜合成中存在交互作用。     

茅苍术悬浮细胞系建立及内生真菌诱导子对其挥发油积累的影响

目的 建立茅苍术悬浮细胞系,研究2种内生真菌诱导子对茅苍术悬浮细胞产挥发油的影响.方法 用内生真菌诱导子对茅苍术悬浮细胞进行诱导处理后超声提取茅苍术细胞中的挥发油,利用气相色谱法测定挥发油中苍术酮、苍术醇、β-桉叶醇和苍术素的量.结果 获得的茅苍术悬浮细胞生长较快,于第21天生物量达到最大,为6.95 g/L.未经诱导处理的茅苍术悬浮细胞中仅检出β-桉叶醇,其在培养21 d的细胞中的量达到最大,为17.469μg/g.添加2种内生真菌(分别属于小克银汉霉属和孔球孢霉属,编号为AL4和AL12)的粗诱导子对茅苍术悬浮细胞生物量及挥发油积累均有影响,其中AL4粗诱导子综合效果更好.添加AL4粗诱导子到14 d的茅苍术悬浮细胞培养基中,诱导子质量浓度为每升培养基含糖20 mg,诱导处理7 d后收集细胞,发现其干质量比同期对照提高3.31%,且检出细胞中苍术酮、苍术醇、β-桉叶醇和苍术素的干质量分别达到14.715、28.395、38.794、8.310μg/g.其中β-桉叶醇的量是对照的2.22倍.结论 添加内生真菌诱导子对茅苍术悬浮细胞的生长及挥发油积累均有促进作用.     

前体饲喂和真菌诱导子对肉苁蓉悬浮培养细胞次生代谢产物的影响

目的:研究前体饲喂和真菌诱导子对肉苁蓉悬浮培养细胞生长、苯乙醇总苷(PeGs)和松果菊苷(Echin)含量的影响.方法:悬浮培养联合加入前体和真菌诱导子.结果:前体化合物L-苯丙氨酸+L-酪氨酸与番茄霉菌联合作用,肉苁蓉悬浮细胞干重、PeGs及Echin含量均达到最大值,分别为14.69 g DW/L、50.55 mg/g和23.86 mg/g,是对照的1.81、4.18和3.99倍.结论:前体和诱导子联合作用能显著提高肉苁蓉细胞悬浮培养体系中次生代谢物的含量.     

不同诱导子对甘草悬浮培养细胞中甘草酸积累的影响

 目的研究水杨酸、酵母提取物、水解酪蛋白、高糖、高盐、超声等诱导子对甘草悬浮培养细胞中甘草酸积累的影响。方法向细胞悬浮液中加入各种诱导子或对细胞悬浮液进行超声处理。结果加入10 mg·L^-1水杨酸可使甘草酸的含量为对照组的1.86倍。低浓度的酵母提取物对甘草酸的积累有显著的促进作用,加入1 mg·L^-1酵母提取物时,甘草酸的含量为对照组的3.71倍,达到14.20μg·g^-1。添加100 mg·L^-1水解酪蛋白时,甘草酸的含量为对照组的1.69倍。高盐胁迫对甘草酸的积累有较高的影响,其含量为对照组的1.96倍。结论甘草细胞悬浮培养中,添加水杨酸、酵母提取物、水解酪蛋白、高糖、高盐、超声等诱导子是提高细胞中甘草酸含量的有效方法之一。     

黑曲霉诱导子促进岩黄连悬浮细胞中生物碱的合成

目的为了提高岩黄连悬浮培养细胞中生物碱的产量。方法以不同浓度黑曲霉诱导子处理岩黄连悬浮培养细胞。结果生物碱的产量随着诱导时间的延长迅速提高,到第6天达到最大值;添加50mg/L诱导子时生物碱产量最高,达到89.2mg/L,比时照组高出2.5倍,当诱导子浓度进一步升高时,生物碱产量反而降低;随着诱导子浓度从0mg/L增大到150mg/L,细胞生物量反而逐渐减少。结论黑曲霉诱导子可促进岩黄连细胞中生物碱的合成,最佳诱导子浓度是50mg/L;过高浓度的诱导子并不利于细胞生长和生物碱合成,细胞生物量的减少是导致生物碱产量下降的一个重要原因。该处理提供了一种简单有效的方法提高岩黄连细胞培养中生物碱的产量。     

真菌诱导子对铁皮石斛原球茎多糖含量的影响

目的：研究MF24真菌诱导子对铁皮石斛原球茎多糖含量的影响。方法 用不同方法制备的MF24真菌诱导子,以不同的剂量,在铁皮石斛原球茎生长的不同时间加入,并继续培养不同时间,观察诱导子对原球茎多糖含量的影响。结果 将MF24液体发酵的菌丝体作为诱导子（方法4）,以250mL·L-1（诱导子·培养基-1）的剂量（高剂量）加入培养基时, 铁皮石斛原球茎多糖含量最高（5.63%）,与对照（3.16%）相比提高了78.2%。在原球茎培养的第14d,以高剂量加入方法4制备的诱导子,继续培养2d,获得的多糖含量最高（5.92%）,与平均值（4.59%）相比提高了29.0%。结论：在铁皮石斛原球茎培养的后期加入MF24液体发酵菌丝体制备的诱导子,有利于提高原球茎的多糖含量。     

白桦叶中的二苯基庚烷类化合物

目的：对白桦叶的化学成分做系统研究,以更好的开发利用我国的植物资源。方法采用硅胶柱、凝胶柱及制备薄层色谱法进行了分离,通过波谱技术（^ＨＮＭＲ,^１３ＣＮＭＲ,^１Ｈ－^１ＨＣＯＳＹ,ＨＭＱＣ,ＨＭＢＣ,ＮＯＥＳＹ）进行结构鉴定。结果：分离鉴定了４种二苯基庚烷类化合物,槭木素丁（１）,氧杂二苯庚烯（Ⅱ）,１７－甲基－１５－甲氧基－７－７氧代槭木素丁 (Ⅲ）,槭木素十一（Ⅳ）,结论：化合物Ⅲ,Ⅳ均首次从本种植物中分离得以,并纠正了化合物Ⅲ的碳谱数据归属。     

腐胺对白桦悬浮细胞蔗糖代谢和三萜积累影响的初步研究

目的研究外源腐胺对白桦Betula platyphylla悬浮细胞中蔗糖代谢与三萜积累间的关系。方法在白桦悬浮细胞的生长末期添加0.1、1、5 mmol/L腐胺,采用比色法分析白桦悬浮细胞内蔗糖,果糖和葡萄糖量、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性以及三萜量。为进一步明确腐胺与蔗糖对白桦三萜积累的关系,分析蔗糖(5、10、20、40 g/L)和1 mol/L腐胺+5~40 g/L蔗糖处理对白桦三萜的影响。结果腐胺处理提高了白桦悬浮细胞内蔗糖量,而降低了培养液中的蔗糖量。其中,5 mmol/L腐胺处理6 h时增加幅度最大,比对照增加了169.41%。与蔗糖相比,腐胺对细胞内外果糖和葡萄糖量的影响程度较小,除了处理6 h细胞内的果糖和葡萄糖增加外,其余处理时间细胞内的果糖和葡萄糖量基本呈降低趋势。除5 mmol/L腐胺降低了蔗糖合成酶活性外,腐胺处理增加了蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶的活性。5~40 g/L蔗糖处理12 h后,悬浮细胞中的三萜量呈增加趋势,其中20 g/L蔗糖处理时增加幅度最大,比对照增加了52.16%。1 mmol/L腐胺分别与不同浓度蔗糖共同处理后,除腐胺与5 g/L蔗糖共同处理三萜量比单独腐胺增加27.37%外,其他处理均降低了三萜的积累。结论腐胺处理诱导了白桦悬浮细胞中蔗糖的合成和三萜的积累,同时推测腐胺诱导的蔗糖在一定程度上介导了三萜的积累。     

白桦BpHMGR基因的结构及表达模式分析

目的研究白桦Betula platyphylla 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-Co A reductase,Bp HMGR)全长基因结构特征及编码蛋白性质,揭示其节律表达模式以及对外源NO信号分子的响应机制。方法通过RACE技术克隆白桦Bp HMGR基因,应用生物信息学软件对Bp HMGR及其编码蛋白进行详细分析,利用实时荧光定量PCR定量分析Bp HMGR基因在昼夜节律变化中的表达模式。根据Bp HMGR氨基酸序列构建系统进化树,分析昼夜节律以及外源NO对白桦叶片中Bp HMGR转录水平的影响。结果 Bp HMGR基因全长1 764 bp,包含完整开放阅读框,已上传至NCBI,并获得登录号KJ452334,其编码蛋白由587 aa组成。白桦Bp HMGR基因与大豆(XP_003519474.1)、葡萄(XP_002275827.1)、苜蓿(XP_003617066.1)亲缘关系较近。结论 Bp HMGR随昼夜周期变化呈现出节律表达特性,在夜晚21:00时达到峰值。初步揭示了外源NO能诱导白桦细胞内三萜代谢途径的关键酶Bp HMGR基因上调表达,进而促进三萜产物齐墩果酸的合成。     

白桦BpNOS基因的生物信息及表达模式分析

目的 克隆白桦Betula platyphylla一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS),探讨其生物信息及表达模式,并考察非生物胁迫对其NOS基因表达的影响.方法 通过RACE技术克隆了白桦NOS基因,命名为BpNOS.初步对该基因进行了生物信息学分析、分子进化分析、非生物胁迫处理以及信号诱导.结果 该基因全长1 806 bp,含有完整的开放读码框,编码601个氨基酸(Genebank登录号：KJ197336).BpNOS基因为不稳定疏水性蛋白,可能存在信号肽,具有跨膜能力,α-螺旋、延伸链、无规则卷曲分布于整个蛋白.分子进化分析结果表明,BpNOS基因与葡萄等物种的遗传距离较近,说明有着较近的亲缘关系;与大豆、苜蓿的遗传距离较远,说明其亲缘关系较远.BpNOS基因的表达具有节律性,在15:00时达到最大值,为0:00时的12倍.盐、低温、重金属镉胁迫均能抑制BpNOS基因的表达,但响应模式不同;水杨酸(SA)和外源一氧化氮可以促进BpNOS基因的表达.结论 非生物胁迫能够在一定时间范围内抑制NOS活性,SA和外源一氧化氮可以通过NOS途径调控内源一氧化氮的合成,为进一步研究白桦一氧化氮的代谢调控奠定了基础.     

白桦植株中三萜前体及不同三萜分支产物积累特征

目的 以三年生白桦为试材,研究白桦植株中三萜合成前体及其三萜组分积累变化,并对白桦植株中三萜组分积累消长特征进行分析。方法 利用高效液相色谱仪及紫外分光光度计对白桦枝皮和叶进行总三萜、白桦脂醇和黄酮等8种成分检测。结果 白桦植株枝皮和叶中三萜物质各组分积累特征显著不同。在生长季节（5～9月）枝皮中2, 3-氧化角鲨烯、白桦脂酸、白桦脂醇、齐墩果酸、达玛烯二醇、固醇及总三萜积累高峰基本为7～9月,其中2, 3-氧化角鲨烯量较低,最高为0.067 mg/g（7月）,白桦脂酸量达8.34 mg/g,而齐墩果酸量高达37.51 mg/g（9月）;达玛烯二醇量最高为14.18 mg/g,总三萜量达168.17 mg/g（7月）。叶中总三萜量为8月份较高,达126.11 mg/g,而2, 3-氧化角鲨烯、白桦脂醇和齐墩果酸量均极低,甚至未能检测到。枝皮和叶片中黄酮积累高峰分别为5月和8月,其中2个月份质量分数分别为53.02 mg/g和58.49 mg/g。消长分析表明,白桦枝皮和叶中三萜组分积累与总三萜积累规律不相吻合,枝皮总三萜、达玛烯二醇、齐墩果酸、白桦脂酸呈S型曲线,白桦脂醇积累呈倒“V”曲线,且黄酮积累与总三萜积累趋势相反。叶中总三萜和黄酮物质积累趋势相近,达玛烯二醇和2, 3-氧化角鲨烯积累趋势相近。结论 明确了三年生白桦枝条和叶片中三萜及黄酮物质积累、分布特征,为白桦枝条皮和叶中三萜资源的挖掘、可持续利用及代谢调控奠定了基础。     

白桦树皮中1个新的降三萜

目的研究白桦Betula platyphylla树皮的化学成分。方法采用硅胶柱色谱及HPLC等色谱技术进行分离纯化,通过理化性质与波谱数据分析鉴定结构。结果从白桦树皮的醋酸乙酯萃取物中分离得到10个化合物,分别鉴定为(17α,20R)-20,29-二羟基-28-降羽扇豆-3,7,16-三酮(1)、12β,20β-二羟基-达玛烷-24-烯-3-酮(2)、5-甲氧基-1,7-双(4′,4′′-羟基苯基)-庚烷-3-酮(3)、(2S)-4-对羟基苯基-2-丁醇(4)、对羟基苯丙醇(5)、对羟基苯乙醇(6)、反式肉桂酸(7)、儿茶素(8)、3,5-二羟基-1,7-双(4′,4′′-羟基苯基)-庚烷(9)、胡萝卜苷(10)。结论化合物1为未见报道的新化合物,命名为白桦素B,化合物3、5、7、9为首次从该植物中分离得到。