不同胶原酶消化对原代成骨细胞获得率及活性的比较

目的:比较Ⅰ、Ⅱ型胶原酶对新生大鼠颅盖骨的消化效果,选择效率较高的胶原酶,为日后从细胞水平研究中药治疗骨质疏松症的机制提供大量种子细胞.方法:新生24 h SD大鼠10只,雌雄不限,脱颈处死后取出颅盖骨,剪成约1 mm×1 mm的碎片,采用胰酶预消化15 min后将骨片按重量平分成两等份,随机分为Ⅰ型组、Ⅱ型组,分别用0.1％Ⅰ型、0.1％Ⅱ型胶原酶37℃消化1h×2次,所得细胞置于5％CO2培养箱中37 ℃恒温培养.原代细胞分别于培养0h、72 h时采用血球计数板进行计数,第2代细胞于培养48 h后采用NBT/BCIP染色液进行染色,并通过对硝基苯磷酸盐法(PNPP)进行ALP定量检测.结果:镜下观察所获得的细胞形态不规则,细胞计数显示Ⅰ型组细胞数量大于Ⅱ型组;ALP染色为阳性;PNPP法测得两组吸光度均值分别为0.427和0.262,Ⅰ型组显著高于Ⅱ型组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:两种胶原酶均适用于成骨细胞的原代消化,但采用Ⅰ型胶原酶获得的细胞数量更多、活性更好,可为日后骨质疏松症的机制研究提供优质的种子细胞.     

胶原酶阶梯消化法体外培养成骨细胞的研究

目的 采用胶原酶阶梯消化法进行鼠颅盖骨体外培养。方法 将新生的健康Wistar大鼠处死,无菌条件下取出颅骨,剔净,粉碎漂洗。依次用1．0％、0．5％及0．1％的Ⅰ型胶原酶分3次对颅骨进行消化。制成细胞悬液,接种培养,然后进行细胞内碱性磷酸酶（ALP）染色,最后将成骨细胞纯化、鉴定。结果 纯化处理的培养皿中,ALP染色阳性区域不少于95％,而对照皿中,不超过62％。结论 胶原酶阶梯消化法培养 的成骨细胞具有典型的成骨细胞特征,且成份单一。     

胶原酶与不同药物相配伍对其酶活性影响的研究

目的:观察注射用胶原酶与不同药物相配伍后酶活性变化的情况,探讨胶原酶与不同药物配伍对酶活性的影响。方法:将注射用胶原酶制剂与12种药物分别配伍后,将样品管、底物对照管和酶对照管各加入无水乙醇0.5 ml终止酶反应,冷却过滤。取滤液稀释后置于TU-1800 pc紫外可见分光光度计,将样品管的吸收度减去底物对照管和酶对照管的吸收度,再从标准曲线上查得亮氨酸的μg数,以胶原酶在37℃、pH7.5条件下作用于胶原蛋白,每小时从胶原蛋白中释放的多肽相当于茚三酮显色1μmol亮氨酸量为一个活性单位来计算注射用胶原酶制剂的活性。结果:12种药物对注射用胶原酶的活性均有不同程度的影响,轻者导致胶原酶的活性下降,重者导致胶原酶的活性丧失。结论:胶原酶的化学本质是蛋白质,任何能改变蛋白质性质的条件,都会使酶的活性下降或失活。忽视胶原酶的化学本质而随意配伍的不规范做法,有悖于酶促反应动力学的基本原理,在临床工作中不应提倡。     

不同纯化方法对大鼠胰岛收获效果的研究

目的 探讨不同纯化方法对提高大鼠胰岛收获效果的作用。方法 随机选取SD雄性大鼠20只,按胰腺消化和胰岛纯化的方法的不同分为4组,消化过程中胆总管灌注胶原酶V,每组5只：①A组：Ficoll-400法纯化胰岛。②B组：光镜下移液吸移管手工挑拣纯化（手工法）胰岛。③C组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000U／L．Ficoll-400法纯化胰岛。④D组：胰腺消化过程加入乌司他丁5000U／L,手工法纯化胰岛。结果 纯化后胰岛的收获量分别为A组（122±25．30）个,B组（179±21．02）个,C组（187±24．89）个和D组（276±24．85）个。乌司他丁灌注组（C组和D组）胰岛细胞的收获量与相应纯化方法的无乌司他丁灌注组（A组和B组）差异有统计学意义（P〈0．01）。手工法纯化组（B组和D组）胰岛的收获量与Ficoll-400纯化组（A组和C组）差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 手工法可明显提高胰岛的收获量,乌司他丁灌注胰腺对大鼠胰岛分离具有保护作用。     

大鼠胰岛分离、纯化技术改良

目的:探讨SD大鼠胰岛分离、纯化的较优方案,并评价依该法分离所得胰岛的生物学特性。方法:以浓度为0.75mg/ml的Ⅺ型胶原酶经胆管充分灌注大鼠胰腺;完整分离后以37℃水浴振荡消化17min,Dextron70不连续密度梯度(1.091、1.081及1.037)离心法分离、纯化胰岛;以DTZ染色鉴定胰岛并计算得率,AO-PI染色检测胰岛活性,糖刺激试验判定胰岛功能,胰岛"细胞免疫细胞化学鉴定"细胞,光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果:纯化后,每只大鼠胰岛收获量为(743.60±43.07)个,胰岛纯度>90%,胰岛细胞活率>90%。在45min内每10个胰岛细胞在低糖和高糖刺激下分泌的胰岛素浓度分别为(25.35±7.00)μIU/ml和(86.48±12.75)μIU/ml。结论:依改良后的分离纯化方案分离大鼠胰岛可获得高纯度高活率的胰岛细胞,且细胞形态正常、功能良好。     

胰岛FasL基因转染对大鼠胰岛移植的影响

目的 探究胰岛细胞FasL基因转染对同种大鼠胰岛移植的影响。方法 通过磷酸钙沉淀法构建含目的基因FasL的重组腺病毒AdV-FasL,感染胰岛细胞后移植于糖尿病受者大鼠,通过RT-PCR和免疫组织化学检测移植物FasL表达,观察移植物存活情况及基因转染胰岛细胞凋亡情况。结果 单纯移植胰岛组平均存活期为（6.3±0.56）d,FasL基因转染组并未出现排斥延迟,反而排斥加速,存活期缩短至（3.4±0.24）d。FasL转染的胰岛细胞在移植后24h见FasL表达,在 48 h表达增强,AdV-5感染组及未转染组未见FasL表达。TUNEL标记见移植后FasL转染胰岛细胞凋亡。结论 尽管表达FasL的睾丸细胞与胰岛共移植可诱导活化的淋巴细胞凋亡,使胰岛移植物获得免疫豁免、存活期延长,但通过FasL基因转染使胰岛细胞直接表达FasL,引起胰岛细胞凋亡和粒细胞浸润,导致排斥加速。     

注射用胶原酶对磷脂酶A2活性抑制作用的体外实验研究

目的研究注射用胶原酶对炎性物质磷脂酶A2(PLA2)的水解作用和对其活性的抑制作用。方法制备不连续SDS-PAGE垂直平板凝胶,将3种酶促反应体系的不同酶解时间的反应液样品,进行电泳、固定、染色、脱色。同时在PLA2活性测定体系中,加入定量的胶原酶溶液,测定各反应体系的PLA2活性相当值。以不含胶原酶的PLA2活性测定体系为标准,求出不同活性单位胶原酶体系的PLA2相对活性,并依据实验所获得的数据,绘制Lineweaver-Burk图加以识别。通过对注射用胶原酶在PLA2水解卵磷脂过程中所起的作用,确定注射用胶原酶对PLA2活性的抑制机制。结果注射用胶原酶对PLA2无水解作用,但在体外对PLA2的活性有明显的抑制作用,其抑制类型为竞争性抑制,且抑制作用随胶原酶剂量的增加而增强。结论虽然注射用胶原酶在体外对炎性物质PLA2的活性有明显的抑制作用,但根据酶促反应动力学的基本理论,“针抵患处、酶达底物”是构成化学溶解术这一微创技术的基本要素和应用该技术时必须遵守的基本原则。     

不同器官保存液对成人胰岛分离、纯化及功能的影响

目的探讨不同器官保存液保存胰腺对胰岛分离、纯化及功能的影响。方法以成人胰腺为研究对象,分别以高渗枸橼酸钾溶液(HCA液)与威斯康新大学器官保存液(UW液)灌洗、保存胰腺,进行胰岛分离及纯化,比较两组分离、纯化后收获的胰岛数及胰岛当量数(IEQ),并在体外评价其功能。结果两组在胰腺重量、热缺血时间、冷缺血时间没有明显差异的情况下,胰腺分离、纯化后所获得的胰岛数及胰岛当量数的差异无显著性(P>0.05),纯化后的胰岛细胞在体外低糖与高糖刺激下,其胰岛素的分泌量及C肽的释放量的差异也无显著性(P>0.05);两个组胰岛细胞的活率均在85%以上。结论在胰岛移植中,可以使用HCA液作为胰腺保存液。     

异搏定对急性胰腺炎大鼠磷脂酶A2影响的研究

目的探讨急性胰腺炎(AP)时胰组织磷脂酶A2(PLA2)的变化,以及钙通道阻滞剂异搏定对其的治疗作用.方法采用"十二指肠闭袢法”诱发AP大鼠模型,随机分组,观测AP组和异搏定治疗组PAL2活性变化,同期行胰腺组织进行光镜和电镜检查.结果诱发AP16h和24h,异搏定治疗组胰腺组织PLA2活性(32.34±3.87,35.26±4.52)较AP组(44.83±5.31,47.77±5.86)明显降低(P<0.01),病理改变明显减轻.结论大鼠AP时存在PLA2的活化,钙通道阻滞剂异搏定可通过抑制PLA2的活化而起到治疗AP的良好作用.     

不同热缺血时间再灌注损伤对大鼠移植胰的影响

目的探讨不同热缺血时间再灌注对大鼠移植胰的损伤情况。方法6只正常SD大鼠为对照组,18只糖尿病SD大鼠随机分为WIR0组(热缺血时间0min,n=6)、WIR15(热缺血时间15min,n=6)和WIR30(热缺血时间30min,n=6)。WIR0组、WIR15组和WIR30组均行胰腺移植。观测各组再灌注前后血糖,再灌注后2h血清TNF-α和NO的含量、移植胰组织中SOD、MPO和MDA含量,组织学变化及细胞凋亡情况。结果(1)WIR0组和WIR15组较再灌注前血糖即下降,再灌注后WIR15组和WIR30组较WIR0组、WIR30组较WIR15组血糖高。(2)再灌注后WIR0组、WIR15组和WIR30组较对照组、WIR15组和WIR30较WIR0组、WIR30较WIR15组血清TNF-α含量高、NO含量低。(3)再灌注后WIR0组与WIR15组和WIR30组较对照组、WIR15组和WIR30组较WIR0组与对照组、WIR30组较WIR15组与对照组胰腺组织中SOD活性低、MDA含量高、MPO活性高。(4)再灌注后2hWIR0组与WIR15组和WIR30组较对照组、WIR15组较WIR0组凋亡指数高。(5)WIR30组供胰组织病理损伤最为严重。结论缺血再灌注损伤可导致移植胰细胞凋亡;在冷缺血180min的条件下,大鼠供胰的最大耐受热缺血时间为15min。     

Isolation of porcine pancreatic islets for xenotransplantation studies: Effects of low collagenase digestion temperatures

Abstract: Islets of Langerhans were isolated from porcine pancreata by a modification of our previously described method. The modification involved the use of a low temperature of collagenase digestion (30°C) during the process of islet isolation. The resulting islets were then evaluated in vitro and in vivo and compared to islets isolated at the regular 37°C temperature.
The islets produced at the low temperature were more compact compared to the control islets. In the dextran density gradient these islets were deposited at the interface of the 1.060 and 1.068 g/ml density bands as compared to 1.050 and 1.060 g/ml for the control islets. In addition, the experimental islets contained a higher proportion of compact, unfragmented islets (68%) compared to the regular islets (55%), and their uptake of the dithizone stain was considerably slower than with the control islets. All ten batches of freshly isolated microencapsulated islets produced at both temperatures responded to the glucose stimulation. After 4 weeks of in vitro culture the islets of both groups microencapsulated in alginate-polylysine-alginate (APA) microcapsules still retained glucose responsiveness, with the experimental islets demonstrating significantly higher responsiveness to the high glucose (16.7 mM) and 0.1 mM IB MX stimulation. The morphology of unencapsulated islets in the experimental group following 4 weeks of in vitro culture indicates much firmer islet structure compared to the control islets. In addition, the unencapsulated experimental islets following the 4 week culture were still found to have secreted insulin when exposed to glucose. In transplantation studies both the experimental and the control islets normalized diabetic hyperglycemia in diabetic mice in a comparable fashion. In general, the low temperature digestion results in superior islets in terms of their morphology, viability, and physiological function.     

Reproducible high yield of rat islets by stationary in vitro digestion following pancreatic ductal or portal venous collagenase injection

Pancreatic distension with collagenase solution followed by stationary in vitro digestion yields large numbers of intact islets. We compared in rats two routes of collagenase injection, pancreatic ductal (PD) and portal venous (PV), for islet yield, in vitro insulin secretory capacities, and in vivo functional viability. The islet yield in the PD method (n = 11) was greater than that in the PV method (n = 8) (682 +/- 27 vs. 417 +/- 39 per pancreas, P less than 0.025). The insulin release from the PD islets in response to 16.7 mM glucose increased gradually following culture, 3.2 +/- 0.8 ng/10 islets/30 min (fresh) to 12.3 +/- 2.1 (24-hr culture). In contrast, insulin release from the PV islets increased during the first 6 hr of culture, but decreased after 24 hr in culture. Under electronmicroscopic examination, the PD islets revealed a well preserved structure with healthy endocrine cells, while the PV islets showed a dilated capillary network and distorted endocrine cell continuity. When 100 PD islets were transplanted into streptozotocin-induced diabetic B6AF1 mice (n = 8), all the recipient mice restored normoglycemia (less than 200 mg/dl) within 1-4 days following transplantation and maintained it until rejection. However, the recipient mice given 100 PV islets showed a significant delay in restoring normoglycemia, and 3 of 8 mice given 100 PV islets were still hyperglycemic on day 4 postgrafting. In summary, pancreatic ductal collagenase injection followed by stationary in vitro digestion reproducibly yields higher numbers of intact and viable islets when compared with portal venous collagenase injection, indicating the superiority of this method to portal venous injection.     

三种不同部位移植胰岛细胞治疗糖尿病

目的 对比通过肝脏、静脉、胰腺三种途径移植胰岛细胞对糖尿病大鼠的治疗作用.方法 24只糖尿病大鼠模型随机分为A、B、C组,A组在肝脏被膜下多点移植1000个胰岛细胞,B组通过尾静脉移植1000个胰岛细胞,C组在胰腺被膜下移植1000个胰岛细胞,于不同时间点测定大鼠随机血糖,对比大鼠血糖变化趋势及维持正常的时间.结果 A组大鼠血精于术后3 d内开始下降,血糖可降至正常水平(7.98±2.28)mmol/L,血糖维持正常水平(3.71±0.95)d,B组移植后24 h 血糖降至正常水平(7.35±1.40)mmol/L,可维持(7.85±1.46)d,C组移植后24 h血糖降至正常水平(7.06±2.11)mmol/L,可维持(24.90±2.60)d,不同部位移植对大鼠血糖水平变化的影响不同,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在胰腺被膜下移植胰岛细胞血糖维持正常时间最长,是一个较理想的移植部位.

Abstract：

Objective To study the curative effectiveness of pancreatic islets transplantation through the liver, tail vein and pancreas. Methods Twenty-four diabetic rats were randomly divided into groups 1,2, 3. The rats in group Ⅰ were transplanted with 1000 pancreatic islets beneath the liver capsule,those in group 2 with 1000 pancreatic islets through tail vein, and those in group 3 with 1000 pancreatic islets beneath the pancreas capsule. Plasma glucose levels at different time points were determined and compared. Results In group 1, plasma glucose levels were reduced at the 3rd day post-transplantation,reached the normal level (7.98 ±2. 28) mmol/L and maintain (3.71 ±0. 95) days. Group 2 start to activate after 24 h. Plasma glucose level reach to (7.35 ± 1.40) mmol/L and maintain (7.85 ± 1.46) days.Group 3 start to activate after 24 h. Plasma glucose level reach to ( 7.06 ± 2. 11 ) mmol/L and maintain (24. 90 ± 2. 60 ) days. There is statistical significance in plasma glucose level and maintain normal time after transplantation pancreatic islet in different sites ( P ＜ 0. 05 ). Conclusion Transplantation pancreatic islets beneath the pancreas capsule maintain plasma glucose for the longest time. The pancreas is a ideal transplantation site.     

大鼠胰腺移植急性排斥反应中调节激活正常T细胞表达和分泌因子的作用

目的　探讨在大鼠胰腺移植急性排斥反应中调节激活正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)的作用。方法　对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型施行胰腺移植。术后1、4、7、10d4个时间点取材,采用酶联免疫吸附法检测受体血清RANTES的浓度,免疫组织化学法测定移植胰腺组织RANTES蛋白表达水平。结果　急性排斥反应在术后7d达高峰。术后1、4、7、10d受体血清RANTES浓度在同系移植组分别为(3 5 7.87±63 .2 6)、(2 74.77±5 8.2 2 )、(2 65 .87±43 .40 )、(2 67.5 5±48.91)ng/L ,除1d外与对照组比较差异无统计学意义(2 5 1.18±44 .94)ng/L ;在异系移植组分别为(3 88.48±10 4.45 )、(5 86.72±90 .0 6)、(746.2 8±92 .64 )、(63 1.49±10 6.3 4)ng/L ,与对照组比较差异有统计学意义(P <0 .0 5 )。移植胰腺组织RANTES蛋白的表达强度在同系移植组中与对照组比较无显著变化,而在异系移植组随排斥反应的发展呈动态变化,在4d为中度阳性,至7d表达为强阳性。结论　胰腺移植急性排斥反应过程与RANTES的表达密切联系,移植术后对RANTES进行动态检测有助于胰腺移植急性排斥反应的早期诊断     

不同加载速度对大鼠骨生物力学特性的影响

本实验观察了在三点弯曲力学实验中,在不同运动速度（５ｍｍ／ｍｉｎ,２０ｍｍ／ｍｉｎ）的加载条件下,即在不同的加载速度时,大鼠肱骨最大载荷、弹性载荷、最大挠度、弹性挠度、最大应力、弹性应力、最大应变、弹性应变８项骨生物力学指标的变化特点。结果表明：与５ｍｍ／ｍｉｎ加载速度相比较,在２０ｍｍ／ｍｉｎ加载速度下,骨最大载荷、弹性载荷、最大挠度、弹性挠度显著增加（Ｐ＜０．０５）;骨最大应力、弹性应力、最大应变、弹性应变无明显变化。提示：三点弯曲力学实验中,在一定范围内提高加载速度,主要影响骨结构力学特性,而对骨材料力学特性无明显影响     

大鼠自体肝移植后胰腺损伤的研究

目的 探讨大鼠自体肝移植后胰腺损伤的原因.方法 42只SD大鼠按随机数字表法分为自体肝移植1、6、12、24、48、72 h组和假手术组(每组各6只).假手术组在术后立即取样,自体肝移植各组分别在术后1、6、12、24、48、72 h取样.测定血清淀粉酶、脂肪酶,了解胰腺外分泌功能;光镜、电镜观察胰腺组织形态学改变情况.采用单因素方差分析检验结果.结果 自体肝移植1 h组的大鼠血清淀粉酶、脂肪酶含量高于假手术组,随着术后时间的延长,其含量逐渐增加,自体肝移植48 h组的大鼠血清淀粉酶、脂肪酶含量达到高峰,随后下降.各组比较差异有统计学意义(F=538.622,489.417,P<0.05).光镜下,自体肝移植1 h组大鼠胰腺组织有水肿型胰腺炎的表现,自体肝移植6 h组大鼠胰腺组织有出血坏死型胰腺炎的表现,自体肝移植48 h组大鼠胰腺组织达到损伤高峰.电镜下,自体肝移植1 h组大鼠胰腺细胞出现线粒体增多、肿胀,内质网、高尔基体肿胀,线粒体的面积、周长、比表面、线粒体平均灰度值分别为(312±40)mm~2、(80.3±3.8)mm、0.332±0.039、113±11.随着时间延长,损伤逐渐加重,出现自噬体.自体肝移植48 h组大鼠胰腺细胞达到损伤高峰,其线粒体的面积、周长、比表面、平均灰度值分别达到(466±7)mm~2、(108.8±3.7)mm、0.298±0.009、195±12.各组线粒体比表面和平均灰度值比较差异有统计学意义(F=9.322,76.560,P<0.05).结论 大鼠自体肝移植后胰腺损伤与缺氧引起细胞能量代谢有关.