套式PCA检测滤纸干血滴中恶性疟原虫的研究

建立简易、实用的套式ＰＣＲ检测恶性疟原虫的方法。方法：以小亚单位核糖体核糖核酸基因为目的片段的双温度点套式ＰＣＲ扩增滤纸干血滴中Ｐ．ｆ．ＤＮＡ，并将结果与镜检法进行比较研究。结果：１４３例标本中两法均阳性的均阴性分别有５５份和５１份，镜检阴性而ＰＣＲ阳性者３４份，镜检阳性而ＰＣＲ法阴性３份。套式ＰＣＲ总阳性率为６２％，显著高于镜检法的４１％，两者符合率为７４％。本法简便、快速、敏感性高，特异性强，     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的　评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。　方法　采集海南省疟疾混合感染流行区 3 0 4份滤纸干血滴样本 ,根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列 ,设计合成 3条引物 ,采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段 ,检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA ;同时与镜检法进行比较。　结果　在 3 0 4份样本中 ,PCR法阳性 15份 ,其中间日疟 7份 ,恶性疟 8份 ;镜检法阳性11份 ,其中间日疟 6份 ,恶性疟 5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性 ;镜检阴性而PCR阳性的 4份样本 ,其扩增产物经限制性酶切鉴定 ,证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。　结论　此PCR检测体系灵敏、特异 ,对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

套式PCR检测滤纸干血滴中恶性疟原虫的研究

目的：建立简易、实用的套式ＰＣＲ检测恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）的方法。方法：以小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）为目的片段的双温度点套式ＰＣＲ扩增滤纸干血滴中Ｐ．ｆ．ＤＮＡ，并将结果与镜检法进行比较研究。结果：１４３例标本中两法均阳性和均阴性分别有５５份和５１份，镜检阴性而ＰＣＲ阳性者３４份，镜检阳性而ＰＣＲ法阴性３份。套式ＰＣＲ总阳性率为６２％，显著高于镜检法的４１％，两者符合率为７４％。结论：本法简便、快速，敏感性高、特异性强，具有一定的现场应用价值。     

巢式PCR法在疟疾检测及虫种鉴别中的应用

根据疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸(SSU rRNA)基因序列设计疟原虫通用型和种特异性的引物,对60份血样进行巢式PCR检测及虫种鉴定,并与血样的吉氏染色镜检结果进行比较。巢式PCR检出40份疟原虫阳性血样,其中22份为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)阳性、13份为间日疟原虫(P.vivax)阳性、3份为恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染、1份为卵形疟原虫阳性(P.ovale)、1份未能分型。与镜检结果一致的血样为46份,占76.7%(46/60),其中恶性疟原虫阳性18份、间日疟原虫阳性11份和阴性17份。将两种检测结果不一致的血样进行扩增片段序列测定和实时荧光PCR分析,检测结果均与巢式PCR结果一致。卵形疟原虫阳性血样扩增片段的序列分析结果显示,该序列与卵形疟原虫SSU rRNA基因序列(GenBank登录号DQ845247)的对应部分同源性为100%,证实该病例为输入性卵形疟原虫感染病例。     

DNA探针诊断间日疟的进一步研究

对以间日疟原虫特异的0.24kb DNA探针用点杂交试验出现阳性反应的部分恶性疟患者血样和现场镜检阴性的发热病人血样用Southern blotting法加以甄别。结果显示,点杂交阳性反应者本试验亦呈阳性反应。证实在部分恶性疟患者及镜检阴性的发热病人中可能同时感染间日疟原虫。2份点杂交可疑阳性的上海献血员血样,本试验呈阴性。     

套式PCR法检测间日疟原虫的研究

以滤纸采集间日疟原虫患者血样，煮沸法萃取ＤＮＡ模板，用间日疟原虫ＳＳＵｒＤＮＡ特异序列为内外引物，进行双温度点套式ＰＣＲ扩增，其检测原虫率水平为０．８４×１０＾－６，特异性强。检测云南疟区发热患者血样１６６份，检出率为６３．９％，显著高于镜检法的４８．２％。以镜检法为参照，本法的敏感性为９７％，特异性为６１％，阳性预期值和阴性预期值分别为６５％和９７％，表明是检测间日疟原虫感染的一个良好手段，可作     

环介导等温扩增检测恶性疟原虫的应用研究

目的探讨环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测恶性疟患者血中疟原虫的敏感性和特异性。方法收集恶性疟患者和健康人血液样品,分别用LAMP、镜检法和巢式PCR检测恶性疟原虫,计算LAMP的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值,并与巢式PCR进行比较。结果共检测78份恶性疟患者和30份健康人血样,其中72份患者血样LAMP检测为阳性,以镜检法为金标准,LAMP筛检的灵敏度为92.3%,特异度为100%,阳性预测值和阴性预测值分别为100%和83.3%;以巢式PCR为参考,LAMP筛检的灵敏度为97.2%,特异度为94.4%。结论 LAMP方法检测恶性疟原虫的敏感度和特异度与巢式PCR方法相近,可应用于现场恶性疟检测。     

用体外培养的恶性疟原虫作抗原的疟疾血清学评价

鉴于疟疾血清学试验使用的同种人体疟原虫抗原的来源困难及使用体外培养的恶性疟原虫作抗原的研究报告尚少。本文采用体外培养的恶性疟原虫和夜猴体内感染的恶性疟原虫分别制备抗原,通过间接荧光抗体(IFA)及间接血凝(IHA)试验进行比较研究。试验所用的恶性疟原虫对氯喹是敏感的,用RPMI 1640培养基在体外培养保存。另以夜猴体内繁殖的恶性疟原虫制备抗原(称CDC抗原)作对照,以IHA及IFA试验同时检测14份血清,其中7份为已知阳性血清,3份已知阴性血清,另4份血清有否疟疾史不明。     

聚合酶链反应掺入法制备标记地高辛探针检测间日疟原虫感染的初步研究

根据间日疟原虫环子孢子蛋白基因设计合成特异性引物一对，采用ＰＣＲ技术，以Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ代替部分ｄＴＩＰ直接扩增并标记含间日疟原虫环子孢子蛋白基因中央重复序列的基因片段作为ＤＮＡ探针并用于检测间日疟原虫感染，结果表明：（１）采用ＰＣＲ法直接制备并标记地高辛探针的方法较ＰＣＲ扩增后再标记的方法更为快速、简便和经济；（２）探针只与间日疟患者血样核酸抽提物杂交阳性，而与其亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、利什曼原虫、弓形虫及正常人血核酸抽提物杂交阴性，该探针可以检测出相当于１００μｌ感染血样中４４虫／μｌ的水平；（３）将该探针用于深圳地区及湖北随州地区收集的间日疟患者血样的检测，１４７份镜检阳性的血样中，１１３份杂交阳性，与镜检的符合率为７６．８７％，２０份正常人血杂交阴性。     

用单克隆抗体——酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测人体疟原虫抗原的研究

采用兔抗恶性疟原虫(Fcc株)抗体包被,以现症疟疾病人滤纸血为检测样本,用两种单克隆抗体M_26-32。3F_9混合进行反应的ELISA双抗体夹心法检测红内期疟原虫抗原,取得较满意结果: 64份镜检阳性疟疾样本(海南岛恶性疟31份;江苏恶性疟16份,间日疟17份)和25份非疟疾对照样本测定结果,阳性和对照样本的平均增强率分别为77.5和     

镜检、抗原检测和核酸检测方法在疟疾诊断中的应用比较

目的 比较镜检、抗原检测(RDT)和核酸检测(PCR)三种方法对疟原虫的检测效果,为基层选择合适的 诊断方法提供依据。 方法 收集腾冲市 2015-2018 年发热病人的血样进行疟疾检测,以确诊结果为标准,对比分析镜检、RDT 和 PCR 三种疟疾检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值等指标。 结果 610 份血样中,阴性 295 份,阳性 315 份,其中恶性疟 67 份、间日疟 245 份、混合感染 2 份、三日疟 1 份。 与确诊结果比较,镜检、RDT 和 PCR 的灵敏度分别为 95. 87%、94. 60%和 99. 37%,特异度均为 100%;假阴性率分别为 4. 13%、5. 40%和 0. 63%,阴性预 测值分别为 95. 78%、94. 55%和 99. 33%;假阳性率均为 0,阳性预测值均为 100%;三种方法与确诊结果的总符合率分别 为 97. 87%、97. 70%和 99. 67%,Kappa 检验结果显示均与确诊结果高度一致(P 均<0. 001);对单一虫种恶性疟的检测, 镜检、RDT 和 PCR 的符合率分别为 88. 06%、100%和 97. 01%;对其他三种疟原虫检测的符合率,分别为 97. 97%、 93. 9%和 100%。 结论 三种检测方法均具有较高的敏感性和特异性,但综合考虑当前防治工作实际,抗原检测(RDT) 更适宜在基层推广和使用。     

聚合酶链反应技术与镜检法诊断间日疟的对比研究

目的　评价聚合酶链反应技术在间日疟诊断中的应用价值。　方法　根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,扩增检测“四热”病人血样中间日疟原虫 DNA;同时作厚血膜镜检疟原虫。　结果　从间日疟患者血样中扩增出 341bp的 DNA片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ,而正常人血样及空白对照无特异性条带 ;对于 2 34份“四热”病人血样 ,PCR法检出 16份阳性 ,阳性率为 6 .8% ;厚血膜镜检 13份阳性 ,阳性率为 5 .6 % ;两种方法相比差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对于 3份 PCR阳性而镜检法阴性的血样 ,重新作 PCR,结果仍然为阳性。以镜检法为标准 ,PCR法的灵敏度为 10 0 % ,特异度为 98.6 %。　结论　PCR技术灵敏特异 ,可替代镜检法用于间日疟感染的临床及现场检测。     

疟疾胶体金免疫层析试条在间日疟流行区的诊断评价

目的 在现场评价疟疾胶体金免疫层析试条 （简称试条） 的诊断性能。 方法 2008年9～10月采集安徽省间日疟流行区蒙城县5个乡镇医院门诊部所有就诊的发热病人血样,用双盲法比较镜检法和试条测试的结果。 结果 共采集发热病人血样292份,镜检法检出疟原虫阳性181份,均为间日疟;试条检出疟原虫阳性163份,亦均为间日疟。两法检测结果一致的血样占92.8%（271/292）,其中均为阳性的163份,均为阴性的108份。两法检测结果不一致的21份血样中,镜检阳性的、试条检测阴性的有18份,镜检阴性的、试条检测阳性的有3份。原虫密度在＞1 000 个/μl、100～1 000 个/μl和＜100 个/μl时,试条检测阳性率分别为93.5%（115/123）、86.0%（43/50）和62.5%（5/8）。 结论 该快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条在疟疾流行区对间日疟有一定的诊断价值。     

逆转录聚合酶链反应检测和鉴定疟原虫的研究

在同一反应体系中建立能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟及混合感染的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于现场采集血样检测。先以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计1对针对恶性疟原虫的特异性引物,建立RT-PCR检测恶性疟原虫方法,在此基础上,增加1条针对间日疟原虫的种特异性引物,使在同一反应体系中,能够同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段。恶性疟原虫和间日疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小为359bp和449bp特定扩增带,健康人血样和空白对照均未见扩增带。用建立的RT-PCR检测方法对现场采集128份血样进行检测,与镜检的阳性符合率为9609%,14份镜检为阴性的发热病人全血标本中2份RT-PCR检测为间日疟阳性。RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

套式/多重PCR方法应用于疟疾诊断与监测的初步评价

目的 与镜检法比较评价标签引物-套式/多重PCR（UT-PCR）在疟疾监测中的应用价值。 方法 在海南、云南省恶性疟和间日疟混合流行区和广西疟疾控制区的疟疾监测中,采集初诊为疟疾或疑似疟疾的发热患者的血片与滤纸血样400份,在双盲条件下比较镜检法与UT-PCR的初检结果,对结果不一致的血片再次镜检复查,同时对其滤纸血样重复PCR 2～3次;评估UT-PCR与镜检法的敏感性和特异性。 结果 400例发热患者血样中,镜检法初检检出疟原虫阳性234例,其中恶性疟125例,间日疟109例;UT-PCR检出疟原虫阳性235例,其中恶性疟124例,间日疟109例;恶性疟和间日疟混合感染2例。两法初检结果一致的血样占92.5%（370/400）,其中阴性154例,阳性216例（间日疟117例,恶性疟99例）。复查25份初检结果不一致的血样,包括镜检阴性PCR阳性11例,镜检阳性PCR阴性10例,镜检为恶性疟PCR为间日疟3例,镜检为间日疟而PCR为混合感染1例,其中15份与UT-PCR的初检结果一致,7份“假阳性”原因不明,仅3份为PCR的假阴性。根据复查结果评估PCR的敏感性为99.6%,特异性为98.8%。 结论 采用更敏感的UT?鄄PCR疟疾诊断方法有助于解决疟疾诊断与鉴别诊断中的疑难问题,提高疟疾监测的质量和效率。     

四川省输入性卵形疟原虫wallikeri亚种实验室检测分析

目的 鉴定四川省疑似输入性卵形疟原虫感染病例wallikeri亚种感染情况,并对2014-2017年全省1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况进行分析。方法 对2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例进行血涂片镜检、快速诊断试纸条（RDT）检测和巢式PCR检测并进行测序分析,同时回顾性检测2014-2017年全省 1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况。结果 2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例镜检结果均为卵形疟原虫阳性,其中2例存在恶性疟原虫混合感染;RDT检测结果均为疟原虫阳性;常规巢式PCR检测除2例结果为恶性疟原虫阳性外,其余均为阴性;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物进行PCR检测,10例均为阳性,序列分析结果显示为卵形疟原虫wallikeri亚种。对2014-2017年全省1 079份复核血样进行回顾性检测,发现2例卵形疟原虫wallikeri亚种与恶性疟原虫混合感染病例,均为2017年报告,此前检测结果为单纯恶性疟原虫感染。结论 四川省首次鉴定发现输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例。     

质粒型pBF_4DNA探针用于疟疾诊断的研究

质粒pBF_4DNA 用~(32)P 标记后,与现场采集的50份疟疾病人血样进行斑点杂交,9份镜检为恶性疟者杂交全为阳性,与镜检符合率为100%;41份镜检为间日疟的标本,有3份出现杂交弱阳性;10份正常人血两者检查均为阴性。DNA 探针检测恶性疟原虫的灵敏度为0.001%原虫血症。血样存放2年之久,仍可用于 DNA 杂交。     

乳酸脱氢酶法检测恶性疟原虫融合蛋白-2.9免疫血清体外抑制效果

目的 用乳酸脱氢酶（LDH）法检测恶性疟原虫融合蛋白（PfCP-2.9）免疫兔血清体外抑制恶性疟原虫生长的效果。 方法 将恶性疟原虫起始培养物的原虫率稀释为（0.4±0.1）%，红细胞压积为2％，使用不同浓度恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9免疫兔血清进行恶性疟原虫体外生长抑制试验，40～42 h后分别用LDH检测法和传统镜检计数法检测原虫生长抑制率。 结果 PfCP-2.9免疫兔血清在体外对恶性疟原虫有较强的抑制作用。LDH测定法与传统镜检法测得体外恶性疟原虫抑制率相近（分别为97%和100%），两者差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 LDH法检测恶性疟原虫体外抑制试验是一种简单、可行的实验方法。     

应用巢式PCR评价低流行区疟疾诊断结果

目的初步评价大连市疾控人员对疟疾的诊断能力,为低流行区疟疾诊断方法的选择提供理论依据。方法收集2010--2012年大连市上报的27例疟疾阳性病例的血液样本．应用巢式PCR（nest—PCR）方法对诊断结果进行复核：以复核结果为标准,比较镜检和快速诊断试剂盒（rapid diagnosistest．RDT）方法的检测敏感性及对虫种鉴定的正确率。结果27份样本的巢式PCR结果为恶性疟23份,间日疟2份,卵形疟l份,阴性1份,无混合感染。镜检对阳性样本的敏感度为76．9％（20／26）,远低于RDT方法的96．2％（25／26）;镜检和RDT联合使用,敏感度可达100％。对虫种的鉴别,镜检对阳性样本的正确检测率为50％（13／26）：RDT方法仅能鉴别恶性疟和非恶性疟．对恶性疟阳性样本的正确检测率为100％（23／23）。结论采用镜检和RDT联合应用的方法,能够提高检测的敏感性。建议在有条件的疾控单位建立人体疟原虫的分子检测体系．更有效地防止对疟疾病例的漏诊和误诊。