不同波动水平的高糖对大鼠骨骼肌细胞PI-3K表达的影响

目的:探讨不同程度血糖升高及血糖波动对原代培养大鼠骨骼肌细胞的葡萄糖转运活动及磷脂酰肌醇3激酶蛋白表达的影响。方法:原代培养大鼠骨骼肌细胞在5、25mmol/L及间断的细胞外高浓度的血糖(5-25mmol/L)波动(波动频者为B、波动小者A)中孵育48h,然后测定:葡萄糖转运活动;磷脂酰肌醇3激酶85亚单位(p85)的蛋白表达及其mRNA水平。结果:高糖抑制了这些细胞的葡萄糖转运活动,削弱了磷脂酰肌醇3激酶85亚单位(p85)的蛋白表达及下调其mRNA水平。且血糖波动范围大者更为明显。结论:高糖能抑制骨骼肌细胞的糖转运活动,诱导胰岛素抵抗。但是如果将培养基中葡萄糖浓度按高低循环的方式给予,即刺激血糖波动,那么血糖波动范围大者p85水平降低得更明显。     

P2Y嘌呤受体活化的PI-3K信号通路在前列腺癌细胞生长和侵袭中的作用

目的研究P2Y嘌呤受体激动剂对前列腺癌细胞PI-3K信号通路的激活及对肿瘤细胞生长和侵袭的影响。方法以高转移的人前列腺癌细胞系1E8为研究对象,以Western blot法,用特异性识别磷酸化Akt的抗体检测PI-3K信号通路的活化情况;以细胞计数、流式细胞术、Matrigel侵袭实验等方法检测P2Y受体激活的PI-3K／Akt信号通路在前列腺癌细胞生长和侵袭中的作用。结果P2Y嘌呤受体激动剂以时间和剂量依赖的方式激活了1E8细胞中的PI-3K／Akt信号通路。其持续刺激导致的生长抑制作用主要通过将细胞阻滞在S期实现（刺激组S期细胞分数比对照组提高22．3％）。应用特异性抑制剂LY294002阻断PI-3K通路明显影响1E8细胞的生长,但不能逆转P2Y受体介导的生长抑制作用。P2Y受体瞬时激活对前列腺癌细胞体外侵袭的促进作用主要通过增强细胞的运动能力（刺激组划痕修复率比对照组提高21．2％）,而非提高基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的酶解活性实现,且此促侵袭作用可被LY294002明显抑制。结论P2Y嘌呤受体可以激活人前列腺癌细胞的PI．3K信号通路,并通过这条通路促进肿瘤细胞的运动能力进而促进侵袭;该通路是前列腺癌细胞生长的重要调节通路,但不参与P2Y嘌呤受体对前列腺癌细胞生长抑制的调节。     

磷脂酰肌醇3激酶在支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞中的表达

目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）的表达。方法:根据随机化分配原则将16只Wistar大鼠随机均分成2组,即哮喘组和正常对照组;模型建立后分别从每只大鼠分离培养ASMC,流式细胞检测方法检测ASMC的生长分数,用免疫细胞化学荧光染色及Westernblotting方法进行PI3K表达的检测,并利用图像分析系统进行半定量对比分析。结果:流式细胞仪检测发现哮喘组ASMC的S+G2/M期细胞所占细胞总数的百分比(27.90±3.44)%显著高于正常对照组(13.00±1.56)%,P<0.05;免疫细胞化学荧光染色及Westernblotting方法检测发现哮喘组和正常对照组ASMC胞浆内均有PI3Kp85阳性表达,且哮喘组的表达明显高于正常对照组;大鼠ASMC中PI3K的表达与大鼠ASMC的生长分数呈显著正相关。结论:PI3K表达的增加可能在哮喘ASMC增殖中起重要作用。     

PI3K对心梗大鼠TNF-α表达的影响

目的 探讨磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)抑制剂LY-294002对心梗大鼠心肌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响。方法 45只SD大鼠,随机分为假手术组、心肌梗死组和PI3K抑制剂组。分别用Western blot和RT-PCR方法检测各组大鼠梗死区及其周围心肌TNF-α蛋白和TNF-α mRNA表达变化。结果 心肌梗死组心肌梗死区及其周围心肌TNF-α蛋白、TNF-α mRNA表达水平显著高于假手术组(p<0.05),PI3K抑制剂组心肌梗死区及其周围心肌TNF-α蛋白、TNF-α mRNA表达水平则明显低于心肌梗死组(p<0.05)。结论 PI3K能够上调心肌梗死大鼠TNF-α的表达。     

糖尿病大鼠肺组织PI3K/Akt表达的变化及意义

目的研究糖尿病大鼠肺组织磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)表达的变化及意义。方法 40只大鼠随机分为对照组(10)和糖尿病组(30),通过高糖、高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。糖尿病模型建立后,检测血糖、血脂的改变;采用免疫组织化学方法和Western blot方法检测各组大鼠肺组织中PI3K、Akt和p-Akt表达的变化情况。结果与对照组比较,糖尿病模型组大鼠血糖、血脂值明显增高(0.01)。免疫组织化学和Western blot结果显示,糖尿病模型组大鼠模肺组织PI3K、Akt和pAkt的表达量均显著高于对照组。结论 PI3K/Akt信号通路可能参了与糖尿病肺组织病变的发生发展。     

磷脂酰肌醇3激酶促进支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在支气管哮喘大鼠气道重构中的作用。方法将24只SD大鼠随机分为3组:正常对照组,哮喘4周组和6周组,每组8只。测定气道反应性并观察气道壁嗜酸性粒细胞的浸润情况;图像分析软件测定支气管壁厚度、支气管平滑肌厚度及支气管平滑肌细胞核数量;用免疫组织化学染色方法检测PI3K蛋白表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PI3KmRNA表达。结果PI3K P85α主要在气道上皮细胞、气道平滑肌细胞表达。哮喘4周和6周组PI3K P85α蛋白及mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),且6周组高于4周组(P<0.05,P<0.01);哮喘4周和6周组支气管壁厚度、支气管平滑肌厚度及平滑肌细胞核数量均较对照组明显增加(P<0.01),且6周组高于4周组(P<0.01);哮喘4周和6周组的气道反应性均高于对照组(P<0.01),且6周组高于4周组(P<0.05)。结论PI3K信号通路可能通过促进气道平滑肌细胞增殖参与哮喘气道高反应性及气道重构过程。     

磷酸肌醇3－激酶调控缺氧诱导因子1α对大鼠缺氧性肺动脉高压的作用

目的:观察缺氧性肺动脉高压（HPH）大鼠肺组织中蛋白激酶B（AKT））和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达，探讨磷酸肌醇3-激酶（PI3K）通路与HIF-1α和VEGF的关系及其在HPH发病中的可能机制。 方法:40只成年雄性Wistar大鼠随机分成对照组、低氧3、7、14和21 d组，每组8只，测各组大鼠平均肺动脉压（mPAP）、右室肥大指数（RVHI）、血管形态学指标Western印迹检测磷酸化AKT(P-AKT)；原位杂交和免疫组化检测HIF-1α的表达。免疫组化检测P-AKT和VEGF水平。 结果:① 低氧7 d起大鼠mPAP、管壁厚度与血管外径比值及管壁面积与血管面积比值分别为(23.53 ±1.78)mmHg, (45.5±3.1)%和(54.7±3.2)%,与对照组［(16.15±1.97)mmHg、(36.8±2.5)%、(63.2±2.5)%］比较差异显著(P＜0.05),低氧14 d起稳定于高水平;低氧14 d RVHI为(26.5±2.9)%,与对照组［(22.9±2.2)%］比较差异也显著(P＜0.05)。②p-AKT蛋白在对照组表达不明显，缺氧3 d后表达上升，与对照组比较差异显著(P＜0.05)，且在缺氧3 d、7 d、14 d、21 d组肺小动脉内膜、中膜表达均为阳性。③HIF-1α蛋白对照组表达不明显，缺氧3 d、7 d、14 d、21 d组肺血管内膜均为阳性，肺血管中膜，缺氧3 d组表达开始升高（0.209±0.009），与对照组比较差异显著(P＜0.05),缺氧7 d达高峰（0.232±0.008,P＜0.05），14 d和21 d下降；HIF-1α mRNA在对照组肺动脉血管壁内表达弱阳性，缺氧3 d和7 d肺血管中表达无明显变化，与对照组比较差异无显著(P＞0.05)。缺氧14 d后表达增高(0.305±0.104, P＜0.05),并持续维持于高水平。VEGF蛋白水平在低氧7 d显著高于对照组(0.188±0.018, P<0.05),14 d达高峰(0.238±0.017, P<0.05)。相关分析表明mPAP与肺血管重塑呈正相关(r=0.983, P<0.01)。在肺小血管内膜:P-AKT与 HIF-1α蛋白呈正相关(r=0.883, P<0.01)， HIF-1α与VEGF蛋白呈正相关(r=0.897, P<0.01)。 结论:磷酸化AKT与HIF-1α和VEGF均在大鼠HPH的发病机制中发挥作用。磷酸化AKT可能通过使HIF-1α蛋白表达增加的方式上调HIF-1α，进而上调下游目标基因VEGF，导致HPH的发生和发展。     

低氧诱导因子1在低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡的影响,以及HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS蛋白表达变化在其中的作用与意义。方法:体外培养大鼠PASMC,设计常氧组、低氧组及ADM、L-NAME、PD98059干预组,用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定细胞增殖反应,用流式细胞仪检测细胞凋亡,用Westernblotting法检测HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS的蛋白表达。结果:（1）低氧24h组的A值明显高于常氧组(P<0.01),而PD98059及ADM干预组明显低于低氧组(P<0.01),L-NAME干预组明显高于低氧组和常氧组(P<0.01)。（2）免疫组化表明,低氧24h组呈阳性表达(P<0.01)。PD98059、ADM抑制了PCNA的表达(P<0.01),L-NAME促进了PCNA的表达(P<0.01)。（3）各组在低氧培养24h后,凋亡指数差异无显著(均P＞0.05)。（4）Westernblotting表明常氧组少量HIF-1α、iNOS、P-ERK1/2表达,低氧4h后均表达增高(P<0.01),8h仍维持在高峰(P<0.01),而HIF-1α、P-ERK1/2在低氧24h后表达下调。L-NAME促进了HIF-1α表达(P<0.01),PD98059部分抑制了HIF-1α、iNOS及P-ERK1/2表达(P<0.01);ADM部分抑制了HIF-1α表达,促进iNOS表达(P<0.01)。结论:低氧能促进肺动脉平滑肌细胞增殖,对细胞的凋亡无影响;HIF-1在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖中起重要作用。     

SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞原癌基因c-myc mRNA表达及细胞增殖的影响

目的：探讨SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）原癌基因c-mycmRNA表达及细胞增殖的影响。方法：以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至体外培养的PASMCs,G418筛选阳性克隆,应用免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3蛋白表达;缺氧处理转染组和对照组PASMCs,采用半定量RT-PCR检测转染前后常氧组、缺氧培养2h、6h、12h、16h、24h细胞c-mycmRNA表达水平变化;［3H］-TdR掺入法检测转染前后上述各时点细胞增殖情况。结果：免疫细胞化学法证实转染后细胞中有SOCS3稳定表达;半定量RT-PCR结果显示,SOCS3基因转染组细胞c-mycmRNA表达水平在缺氧各时点均显著低于同时点对照组细胞（P<0.01）;SOCS3基因转染组细胞在常氧和缺氧各时点［3H］-TdR掺入量显著低于对照组细胞（P<0.01）。结论：SOCS3蛋白可能通过下调c-myc基因表达从而抑制缺氧诱导的PASMCs增殖。     

PI3K在白细胞趋化中的作用

磷酸肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）也称磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K），是指能够磷酸化磷脂酰肌醇（Phosphatidyl inositol，PtdIns）及其衍生物肌醇环3位羟基的磷酸激酶。其产物的主要功能是作为膜引导信号介导质膜募聚相应的选择性蛋白。在真核细胞中，PI3K及其调节蛋白转位的功能是相当保守的。基因阻断或增强PI3K活性均对细胞和机体的功能产生较大影响心。大部分关于PI3K的早期研究主要集中在鉴定能够活化该酶的受体，以及观察激酶活化后继发的细胞应答。后来，学者们对PI3K的下游效应分子进行了鉴定。     

不同方法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞的性状

高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压等疾病均以血管平滑肌细胞的异常增生和迁移为特征。为此 ,近几年来 ,血管平滑肌细胞的培养已经成为研究工作的基础。目前 ,仍然多采用贴块片[1 ] 。因其方便经济、技术难度低 ,但贴块片确有不足之处 ,如细胞容易出现“去分化”或“调整”现象。故我们采用单纯胶原酶法 (Ａ)和复合胶原酶法 (Ｂ ,包括胶原酶弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂 )培养肺动脉平滑肌细胞 (ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ,ＰＡＳＭＣ) ,并初步观察两种方法培养的ＰＡＳＭＣ生长状况。材　料　和　…     

红景天甙对低氧培养的兔肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究红景天甙(Salidroside,Sal)对低氧(3%)条件下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞内钙离子浓度的影响。方法:应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入试验、Fluo-3和激光扫描共聚焦显微术测定细胞内Ca²⁺浓度等方法。结果:低氧24h可直接刺激PASMC,使MTT的A值增加62%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量增加138%(P＜0.01)。在低氧的PASMC培养液中加入Sal(32×10^-5mol/L)可抑制低氧的这种促增殖作用,与低氧组相比MTT的A值下降29%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降37%。在低氧的PASMC培养液中加入钙通道阻滞剂verapamil也可抑制低氧的促增殖作用,与低氧组相比较,MTT的A值下降23%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降51%(P＜0.01)。PASMC的低氧培养可使细胞内Ca²⁺浓度明显增加(P＜0.05),Sal可抑制低氧所致的细胞内Ca²⁺浓度的上升。结论:红景天甙可抑制低氧促进PASMC增殖、DNA合成的作用,其机制可能与抑制低氧时细胞内Ca²⁺浓度增加有关。     

肾上腺髓质素抑制肺动脉平滑肌细胞低氧性增殖

目的:观察肾上腺髓质素(AM)对肺动脉平滑肌细胞低氧性增殖的影响。方法:体外培养猪的肺动脉平滑肌细胞,采用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定其增殖反应。结果:低氧+AM组MTT比色法平均吸光度(A值)为0.394±0.025,显著低于缺氧组的0.514±0.035(P＜0.01),PCNA表达减少,图像分析平均吸光度(A值)为0.168±0.049,显著低于低氧组的0.307±0.078(P＜0.01)。结论:肾上腺髓质素能抑制低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖,提示AM在肺动脉高压的发生发展中起一定的保护作用。     

缺氧对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞5-羟色胺转载体基因表达的影响

目的：探讨无氧（Ｏ％Ｏ２＋９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２）和低氧（２５～３％Ｏ２＋９２％Ｎ２＋５％ＣＯ２）对新生小牛肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）和肺动肺平滑肌细胞（ＰＡＳＭ）５－羟色胺转载体基因表达的影响。方法：应用细胞培养，核酸分子杂交技术。结果：无氧组和低氧组（１５ｈ、３ｈ、６ｈ）ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体ｍＲＮＡ表达显著高于常氧组（Ｐ＜００５），而无氧和低氧１２ｈ至４８ｈ对ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体ｍＲＮＡ表达无明显影响。无氧和低氧（３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ）组ＰＡＳＭ５－羟色胺ｍＲＮＡ表达均显著高于常氧组（Ｐ＜００１），结论：推测缺氧早期通过促进ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体基因表达，加强ＰＡＥＣ对５－羟色胺的摄取和降解，随缺氧时间的延长，ＰＡＥＣ的此功能受损。缺氧ＰＡＳＭ５－羟色胺转载体基因表达的持续增加，则可能参与缺氧肺动脉高压的形成。     

低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖及其作用机制初探

目的和方法：实验采用ＰＤＧＦ生物活性检测法,流式细胞术,「＾３Ｈ」－ＴｄＲ掺入以及细胞免疫线化等方法探讨了低氧状态下,血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）及其受体与肺动产滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）增殖间的相互关系。结果：低氧可以增强ＰＤＧＦ的活性,上调ＰＧＦ受体促进ＰＡＳＭＣ增殖以ＰＤＧＦ作为刺激嘲一步促进低氧的促增殖作用。结论：低氧状态下,ＰＡＳＭＣ的ＰＤＧＦ及其受体进一步活化,从而增强了ＰＤＧＦ自分泌、旁     

连代低氧培养肺动脉平滑肌及内皮细胞的急性低氧反应中环核苷酸的作用

目的:探讨环核苷酸在慢性低氧动物的低氧性肺血管收缩反应(HPV)弱化机制中的作用。方法:用RIA法测定连代常氧与连代低氧培养猪肺动脉平滑肌细胞(PASMC)和内皮细胞(PAEC)的cAMP和cGMP及其在急性低氧时的变化;用图像分析系统检测常氧与低氧培养PASMC在急性低氧时的收缩程度。结果:低氧组PASMC的cAMP、cGMP和PAEC的cGMP基础值较常氧组低(P＜0.01)。急性低氧状态下,低氧组PASMC的cAMP、cGMP含量升高(P＜0.01);低氧组弱收缩反应PASMC的百分率明显高于常氧组。结论:慢性低氧PASMC和PAEC的cAMP、cGMP基础值下降可能与慢性低氧动物肺动脉基础张力增高有关;慢性低氧PASMC在急性低氧反应时cAMP、cGMP含量升高可能是慢性低氧机体HPV弱化的机制之一。     

一氧化碳促进肺动脉平滑肌细胞血红素氧合酶基因的表达

目的:观察低浓度一氧化碳(CO)和低氧处理肺动脉平滑肌细胞(PASMC)后,血红素氧合酶(HO)基因表达的状况。方法:培养大鼠PASMC成功后并进行鉴定,应用免疫组织化学、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Westernblot的方法研究低浓度CO和低氧作用后PASMC的HOmRNA及HO蛋白质含量。结果:①HO-1抗体免疫组织化学染色低氧组细胞胞浆呈黄色,中等强度;CO处理组的细胞胞浆呈棕黄色,强阳性,比低氧组的颜色显著深。HO-2抗体染色各组细胞胞浆均呈淡黄色,弱阳性。②低氧组细胞HO-1mRNA的表达水平为1.25±0.37,明显高于常氧组细胞(0.12±0.04);低浓度CO组细胞HO-1mRNA的表达水平为3.52±0.68显著高于低氧组。各组细胞HO-2mRNA的水平无明显差异。③低氧48h组细胞HO-1的蛋白含量为1.07±0.15,高于低氧24h组细胞(0.52±0.04);低浓度CO组细胞HO-1的蛋白含量为3.65±0.43,显著高于低氧组细胞,48h蛋白质含量为最高。结论:低浓度CO和低氧处理PASMC,可以促进HO-1mRNA和蛋白质的表达,而HO-1在细胞低氧损害中发挥调节作用,部分减轻低氧的损害。     

低氧对肺动脉平滑肌和内皮细胞蛋白激酶C α mRNA表达的影响

目的：探讨低氧对肺动脉平滑肌和内皮细胞蛋白激酶C(PKC)αmRNA表达的影响。方法：应用原位杂交技术了大鼠不同节段肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞PKCαmRNA的分布及低氧对在体和离体肺动脉平滑肌细胞及内皮细胞PKCαmRNA表达的影响。结果：正常大鼠各级肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞均有PKCαmRNA的表达,腺泡内肺动脉平滑肌细胞中的表达明显高于肌型肺动脉（P＜0．01）,低氧14d和28d肌型动脉和腺泡内肺动脉内皮细胞的表达均明显增高（P＜0．01）,腺泡内腺动脉平滑肌细胞的表达较对照组明显升高（P＜0．01）,低氧14d肌型肺动脉平滑肌细胞表达升高不明显,但低氧28d明显升高（P＜01）,正常条件下离体培养猪肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞均有PKCαmRNA的表达,低氧1h对其表达无明显影响,48,72h表达明显升高,以72h升高最显著（P＜0．001）,结论：低氧可促进肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞PKC amRNA 的表达,而以腺泡内肺动脉平滑肌细胞的变化最明显,PCKα在低氧性肺动脉高压的形成中可能起一定作用。     

一氧化氮诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡机制研究

目的:研究一氧化氮(NO)诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)凋亡的作用机制。方法:体外培养Wistar大鼠PASMC,加入NO供体硝普钠(SNP)于常氧和低氧条件下孵育12h或24h,通过流式细胞术碘化丙啶染色法观察PASMC细胞周期时段及凋亡亚二倍体峰变化,应用细胞免疫化学法检测PASMCcaspase-3和NF-κB的表达,同时行DNA断裂琼脂糖凝胶电泳。结果:SNP作用后PASMC出现剂量-依赖性促凋亡作用(P＜0.01),表现为凋亡指数与caspase-3表达的不同程度的增强。随凋亡的进展,出现PASMC凋亡核小体DNAladder,同时PASMCNF-κB阳性核表达较对照组少(P＜0.01)。结论:外源性NO诱导大鼠PASMC凋亡,caspase-3与NF-κB可能涉及PASMC凋亡的调控信号途径。