TRBP及其截短体真核表达载体的构建与表达

目的:构建TRBP及其截短体真核表达载体, 并检测其在HeLa细胞中的表达.方法:设计引物扩增TRBP全长及其截短体TAB、 TAC、 TBC基因序列, 然后将各基因片段克隆入真核表达载体pFlag-CMV4.用脂质体法转染HeLa细胞, 经 Western blot方法检测目的基因在转染细胞中的表达.结果:经过酶切鉴定与测序证实, TRBP全长及其截短体TAB、 TBC、 TAC基因真核表达载体构建成功, 经Western blot可检测转染细胞中各基因的表达.结论:成功构建了TRBP全长基因及其截短体TAB、 TAC和TBC基因真核表达载体, 在转染细胞中可以检测到目的基因的表达.     

CD146基因重组质粒的构建及其在骨髓癌NCI-H929的表达

目的构建CD146真核表达载体,证实融合蛋白在骨髓瘤细胞内的表达、定位。方法提取人工具细胞Hela细胞的总mRNA并进行反转。以反转录的cDNA为模板PCR扩增CD146全长编码基因,克隆至pCDNA3.1-3×Flag表达载体中。质粒转入骨髓癌NCI-H929细胞中,分别利用western blot和激光共焦扫描显微技术检测了重组质粒的表达以及在骨髓癌细胞中的定位。结果 CD146全长基因序列克隆真核表达载体中,酶切鉴定片段为1930bp。CD146在真核细胞中表达为113KD的糖蛋白,利用Western blot检测到真核转染的Flag-CD146表达,条带约为120KD,免疫荧光显示蛋白在细胞膜上有明显定位。结论成功构建了CD146真核表达载体,并验证了其表达定位。     

PcDNA3.1-rhGM-CSF表达质粒的构建及其对K562细胞生长与分化的影响作用

目的:观察GM-CSF对髓系白血病细胞(K562)生长、分化的影响作用。方法:采用PCR、T-A克隆及基因定向克隆技术,将rhGM-CSF基因插入PcDNA3.1(+)空载体中,构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核表达载体。经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定确认,转染人K562髓系白血病细胞、72小时后采用细胞形态学检测、MTT试验、免疫组化技术观察和分析PcD-NA3.1-rhGM-CSF在K562细胞中的表达及其影响该细胞生长与分化的作用。结果:①成功构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;②重组质粒PcDNA3.1-rhGM-CSF能在K562细胞中表达,并诱导K562细胞向单核细胞系、巨噬细胞系分化;③K562细胞增殖受到明显抑制。结论:成功构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;转染K562细胞能向单核细胞系、巨噬细胞系分化。     

hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-hisA表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位。结果hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-hisA中,酶切鉴定片段为500bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD。pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达。结论成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内。     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

目的构建携带免疫调节因子vIL-10c DNA的真核表达载体,转染至SD大鼠骨髓基质干细胞,观察免疫调节因子vIL-10在骨髓基质干细胞的表达。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10,获得目的基因vIL-10,目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体Pc DNA3.1(+),转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞,对照组为pcDNA3.1(+)直接转染的骨髓基质干细胞。结果经PCR、酶切、测序鉴定显示按设计构建的载体pc DNA3.1(+)-vIL-10,已成功转染骨髓基质干细胞。RT-PCR检测到510bp目的片段vIL-10在骨髓基质干细胞表达,SDS-PAGE电泳表明在骨髓基质干细胞有vIL-10蛋白的表达。结论vIL-10 mRNA和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。     

hLKB1基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的构建hLKB1真核表达载体,证实融合蛋白在胃癌细胞内的表达及定位。方法提取胃正常黏膜上皮细胞GES-1的总mRNA并进行反转录。以反转录的cDNA为模板PCR扩增hLKB1全长编码基因,克隆至pCDNA3.1/flag的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌SGC-7901细胞中,分别利用Western blot和激光共聚焦扫描显微技术检测其表达和在胃癌细胞中的定位。结果 hLKB1全长基因序列克隆到真核表达载体中,酶切鉴定片段为1300bp。Western blot检测到真核转染的Flag-hLKB1在胃癌SGC-7901细胞表达,条带约为50kD,免疫荧光显示蛋白广泛定位于细胞质和细胞核内。结论成功构建了hLKB1基因真核表达载体,并验证其在胃癌细胞表达。     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.     

CD59真核表达载体的构建及其对Jurkat细胞增殖的影响

目的构建pIRES-CD59融合基因真核表达载体,探讨重组CD59在Jurkat细胞增殖中的作用。方法 RT-PCR法选择性扩增编码CD59的基因片段,克隆入pIRES真核表达质粒。脂质体法将重组载体转染Jurkat细胞,通过G418筛选获得稳定表达CD59的细胞克隆,利用RT-PCR和Western blot检测细胞中CD59的表达,通过MTT法检测Jurkat细胞的增殖。结果经酶切和测序鉴定表明携带CD59基因的重组质粒构建成功,RT-PCR和Western blot结果显示转染Jurkat细胞的CD59基因高表达,MTT实验显示转染CD59重组质粒的Jurkat细胞增殖速度明显快于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-CD59真核表达载体在转染细胞Jurkat中可高表达CD59分子,并可影响Jurkat细胞的增殖,为研究CD59的生物学作用奠定了基础。     

pcDNA3.1-MORC2重组质粒的构建及其在胃癌细胞SGC-7901中的表达和定位

目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-MORC2并瞬时转染人胃癌细胞SGC-7901,观察融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以人MORC2 cDNA为模板,PCR扩增MORC2全长编码基因,亚克隆至pcDNA3.1-hisA表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,提取细胞蛋白进行Wester...     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

脑源性神经营养因子基因修饰的胚胎大鼠皮质神经干细胞及其在体外的分化

目的 探讨脑源性神经营养因子（BDNF）基因修饰大鼠脑皮质神经干细胞（NSCs）后BDNF的表达,并观察其对NSCs体外诱导分化的影响。 方法 体外分离、培养大鼠胚胎脑皮质神经干细胞并鉴定;构建BDNF基因重组质粒,非脂质体法转染NSCs,实验分为pcDNA3-1- BDNF组、pcDNA3-1组和未转染NSCs组。免疫细胞化学技术和RT-PCR检测转染后BDNF蛋白和mRNA的表达;在含5％胎牛血清的分化培养基中诱导分化,βIII微管蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP） 和突触素( SYP)免疫细胞化学染色对分化细胞进行鉴定,并观察pcDNA3-1-BDNF转染NSCs分化过程中SYP的表达变化。 结果 体外培养获得巢蛋白（nestin）阳性的NSCs。成功构建BDNF基因重组质粒,免疫细胞化学和RT-PCR检测均显示,与pcDNA3-1组和NSCs组比较,pcDNA3-1-BDNF组NSCs的BDNF表达明显增强（P<0.05）。pcDNA3-1组和NSCs组比较,无显著性差异（P＞0.05）。分化后第4天,各组细胞均可分化为Βiii-微管蛋白阳性和GFAP阳性细胞,pcDNA3-1-BDNF组可见少量SYP阳性表达细胞。分化后第7天,与pcDNA3-1组和NSCs组比较,pcDNA3-1-BDNF组NSCs分化为βIII微管蛋白阳性神经元的比例明显增高,有显著性差异（P<0.05）,SYP阳性细胞数增多,表达增强。 结论 BDNF转染NSCs具有体外分泌BDNF的能力,能够促进NSCs定向分化为神经元,SYP表达增强,可能在促进神经元之间的突触发生中发挥作用。     

GFP-hERα重组质粒的构建及蛋白表达和细胞内定位的研究

目的 构建hERα真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以pcDNA3.1-flaghERα仅重组质粒(Dr.Muyan M馈赠)为模板,PCR扩增hER α全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到乳腺癌细胞MCF-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利...     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

人ArgBP2基因真核表达载体的构建及其在胃癌细胞的表达

目的人ArgBP2基因真核表达载体的构建及其在胃癌细胞系中的表达。方法从人胃癌细胞系SCG7901中提取RNA,反转录为cDNA,并以此为模板,扩增ArgBP2的全长编码基因,并构建到真核表达载体pcDNA3.1/HisC中,同时应用Western blot方法检测其表达,然后利用RT-PCR方法检测在各种胃癌细胞系内源性ArgBP2的表达。结果人ArgBP2编码序列已被克隆至pcDNA3.1/HisC表达载体,双酶切鉴定片段大小为1935bp,Western blot验证其表达成功,大小为70kDa,并在RNA水平上检测ArgBP2在胃癌细胞系中的表达。结论成功构建了人ArgBP2基因真核表达载体,在胃癌细胞系表达,为进一步研究ArgBP2的生物学特性及其信号转导通路奠定了基础。     

骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位

目的:构建真核表达载体GFP-hArgBP2并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法:以pcDNA3.1-hArgBP2为模板,利用PCR扩增hArgBP2基因cDNA全长,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察GFP-hArgBP2在MG-63细胞中的定位,免疫沉淀的方法纯化hArgBP2蛋白。结果:hArgBP2基因cDNA全长成功构建到真核表达载体pEGFP-C1中,Western blot检测到了GFP-hArgBP2融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为97 000。GFP-hArgBP2在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化hArgBP2蛋白。结论:成功地构建了GFP-hArgBP2真核表达质粒,同时鉴定了GFP-hArgBP2融合蛋白的表达,并纯化hArgBP2蛋白。GFP-hArgBP2蛋白主要定位在细胞质和核周。     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达。方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒。重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞。RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达。结果成功构建了pcDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达。结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的表达、纯化及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌rPstS1-hspX (rph)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+)-rPstS1-hspX[pET-23b(+)-rph],表达、纯化rPstS1-HspX (rPH)融合蛋白,并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将PstS1和HspX编码基因通过多肽接头(GSGSG)的DNA序列进行连接,构建融合基因rph.将融合基因定向克隆入原核表达载体pET-23b(+),构建重组原核表达质粒pET-23b(+)-rph.将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3) pLysE感受态细胞,IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE和Western印迹法鉴定其表达情况.用镍离子鳌合亲和层析柱纯化融合蛋白,Western印迹法初步评价融合蛋白的免疫反应性.结果 融合基因rph及其原核表达载体pET-23b (+)-rph构建成功.融合蛋白rPH主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51 000,表达量约占菌体总蛋白的23％.经亲和层析后得到了纯度达92％的融合蛋白.Western印迹证实融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pET-23b(+)-rph,获得了rPH融合蛋白,为rPH融合蛋白在结核病诊断中的应用提供了依据.