5-aza-dC和TSA对NIH/3T3细胞多能性基因表达作用的实验研究

目的本实验通过联合应用甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichstatin A,TSA)对NIH/3T3胎鼠成纤维细胞进行DNA去甲基化重编程,以期使其表达与多向分化潜能性密切相关的基因。方法药物处理组与正常对照组NIH/3T3细胞的形态学观察。流式细胞技术检测药物处理前后NIH/3T3细胞的DNA甲基化水平。应用RT-PCR的方法检测多能性基因Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4的表达情况。结果经过药物处理后的NIH/3T3细胞与对照组的细胞比较,从细胞形态来观察,没有明显的区别,均呈现成纤维细胞的外观。药物处理组的DNA甲基化水平较对照组明显降低。药物处理后细胞均呈现出Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4基因的阳性表达。结论 5-aza-dC和TSA对NIH/3T3细胞进行表观重编程,可以使重编程后的体细胞中呈现与多向分化潜能基因的阳性表达。     

调节性T细胞foxp3基因表达的表观遗传学调控

机体的免疫系统主要通过免疫应答与免疫耐受维持机体的免疫平衡.调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)通过选择性抑制作用在调节免疫耐受中发挥着非常重要的功能.自1995年Sakaguchi等首次发现清除天然CD4~+ CD25~+ Treg细胞可导致自身免疫疾病,而补充这种细胞又可以防止自身免疫疾病的发生以来,CD4~+ CD25~+ Treg细胞已成为免疫学研究的热点领域之一~([1,2]).Foxp3分子做为Treg细胞的关键的转录因子,对其发生、发育以及功能的发挥起着重要作用,但是我们对调控foxp3基因表达的机制尚不十分清楚.最近,从表观遗传学的角度研究Foxp3分子的表达调控取得了很大进展,这将有助于我们进一步阐明Treg细胞的发生、分化以及功能发挥的机制.现对foxp3基因表达的表观遗传学调控机制做一综述.     

电磁脉冲辐射诱导小鼠成纤维细胞系NIH/3T3凋亡的研究

目的 研究电磁脉冲（EMP）辐射对小鼠成纤维细胞系（NIH／3T3）凋亡的影响，并探讨EMP对生物体损伤的可能机制。方法 利用场强为60kV/m的EMP对生物体损伤的可能机制。方法 利用场强为60kV/m的EMP照射细胞后，采用细胞计数，MTT比色法，流式细胞术及免疫组化染色等方法，分别观察EMP对HIN／3T3细胞的活力，凋亡以及Bcl-2和p53蛋白表达等的影响。对免疫组化染色阳性的细胞，在高倍镜下用CMIAS－Ⅱ图像－分析系统进行图像分析，所有数据均经SPSS8．0软件进行分析。结果 EMP可明显抑制NIH／3T3细胞的增殖与活力（P＜0．05）；非贴壁细胞率在辐射后明显增加，6h达高峰（33．9％），并可诱导细胞明显凋亡，6h达高峰（15．07％）。图像分析结果表明，EMP辐射后，有不同程度的Bcl-2蛋白表达的下调及p53蛋白表达的上调（P＜0．05）。结论 EMP可诱导NIH／3T3细胞凋亡及Bcl-2及p53蛋白异常表达，提示Bcl-2及p53可能参与了NIH／3T3细胞的凋亡过程。     

表观遗传学修饰对BDNF基因表达的影响

<正>脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)是继神经生长因子(NGF)之后发现的又一重要的神经营养因子。它能够维持神经元在中枢及周围神经系统正常的生理功能,对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用,并能促进损伤神经元的再生等。近年来对BDNF基因表     

优化建立猪多能性细胞及向神经谱系细胞特异性分化

目的探讨建立猪多能性细胞(iPPCs)的优化方案,并探求其向神经谱系细胞特异性分化的方法。方法利用经典的Yamanaka方法,联合应用组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)、甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-AZA)及Oct4病毒的重复感染,优化重编程方案,诱导巴马小型猪胚胎成纤维细胞为诱导的iPPCs。通过Real-time PCR检测重编程过程中多能性基因的分子表达。通过维甲酸(RA)及细胞外基质(ECM)的联合培养,诱导iPPCs向神经谱系细胞特异性分化,免疫荧光细胞化学方法检测神经特异性标记物表达。结果应用优化方案,将猪胚胎成纤维细胞重编程为iPPCs。Real-time PCR显示,VPA和Oct4病毒的重复感染可显著促进重编程过程中多潜能基因的表达。5-AZA未显著提高多潜能基因的表达。RA及ECM的联合培养可诱导iPPCs向神经谱系细胞分化,并表达神经特异性标志基因神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(Tuj1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论在利用优化方案建立猪多能性细胞的基础上,将其向神经谱系细胞特异性分化,对人类神经性疾病的细胞替代治疗具有重要意义。     

巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程为诱导多能性细胞的研究

目的探讨巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程为诱导多能性细胞的方法。方法应用经典的逆转录病毒介导方法,将Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4四种人源性转录因子转导入巴马小型猪的胎儿成纤维细胞中,建立形态和特征类似猪上胚层细胞来源的猪多能性细胞(pig induced pluripotent cells,piPCs)。免疫荧光化学方法检测多能性细胞标记物,RT-PCR检测了该细胞体外三胚层相关基因表达水平。结果巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程的piPCs细胞呈AKP染色阳性,体外长期传代都保持正常的染色体核型,猪上胚层多潜能性细胞标记分子Oct4,Sox2,Nanog,Tra-1-60,Tra-1-81和SSEA-4呈阳性表达,并且表达小鼠胚胎干细胞(ES)多潜能性细胞标记分子SSEA-1,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达,但是体内分化能力存在缺陷。结论巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程成功诱导成多能性细胞。     

HMGA1基因转染诱导NIH3T3细胞恶性转化实验研究

目的：通过建立稳定转染外源HMGA1基因的NIH3T3细胞，探讨HMGA1基因表达与肿瘤发生、发展的相关性。方法：脂质体转染法将真核表达载体pcDNA3．0-HMGA1稳定转染NH3T3细胞，G418筛选获得阳性细胞克隆；RT-PCR法及基因测序技术，确定外源HMGA1基因在阳性细胞克隆转录水平的表达；MTT法绘制细胞生长曲线以及流式细胞术测定细胞周期观察细胞增殖能力的变化；软琼脂集落形成实验判断转染细胞的非锚定依赖性生长能力；RT-PCR法检测转染细胞免疫抑制因子VEGF和FasL mRNA表达。结果：筛选获得稳定转染HMGA1基因的NIH3T3细胞克隆，与对照细胞相比稳定转染HMGA1基因，细胞生长增殖速度加快，在软琼脂中形成细胞集落，并表达免疫抑制因子VEGF和FasL mRNA。结论：HMGA1基因转染可诱导正常NIH3T3细胞恶性转化，并参与调控免疫抑制因子mRNA表达，揭示HMGA1是肿瘤发生发展、转移以及免疫逃逸的关键分子。     

Brn-3a诱导胚胎干细胞向神经样细胞定向分化的研究

目的　探讨转录因子Brn 3a诱导胚胎干细胞 (ES细胞 )向神经细胞定向分化的可能性。　方法　将带有目的基因 (Brn 3a转录因子 )的重组表达载体pJ5Brn 3a ,通过脂质体转染到小鼠ES细胞株中进行表达 ,促使ES细胞向神经细胞分化 ,并采用免疫组织化学技术检测转染前后转录因子Brn 3a蛋白及分化后具有神经元表型特征的神经样细胞特异抗原的表达。　结果　 1 转染前ES细胞Brn 3a免疫反应阴性 ,转染后 2 4h检测Brn 3a免疫反应呈阳性 ;2 转染细胞经 1周培养 ,70 %以上的细胞具有明显的神经细胞样突起 ,神经细胞特有标记抗原NFH L、NSE及SY呈免疫反应阳性 ;神经胶质细胞特有标记抗原GFAP为阴性。　结论　转录因子Brn 3a能成功诱导ES细胞向神经细胞定向分化     

急性髓系白血病患者表观遗传学修饰基因突变的分析

目的探讨急性髓系白血病(AML)患者表观遗传学修饰基因突变(EMMs)的携带率及其临床特征。方法选取2011年5月至2021年2月于连云港市第一人民医院初诊的172例AML患者为研究对象。应用二代测序技术检测42种髓系基因的变异情况, 回顾性分析EMMs患者的临床及分子学特征, 以及去甲基药物(HMAs)对其生存的影响。结果在172例初诊的AML患者中, 71例(41.28%)携带EMMs [EMMs(+)], 变异基因分别为TET2(14.53%, 25/172)、DNMT3A(11.63%, 20/172)、ASXL1(9.30%, 16/172)、IDH2(9.30%, 16/172)、IDH1(8.14%, 14/172)、EZH2(0.58%, 1/172)。EMMs(+)患者的外周血血红蛋白低于EMMs(-)患者(72 g/Lvs. 88 g/L, Z=-1.985, P<0.05)。老年AML患者的EMMs(+)携带率显著高于青年患者[71.11%(32/45)vs. 30.70%(39/127), χ2 = 22.38, P<0.001]。EMMs与NPM1...     

小鼠不同细胞间表观遗传修饰的变化对Pdx-1基因转录表达的影响

目的:通过比较小鼠不同细胞类型之间Pdx-1基因转录起始区的表观遗传修饰差异,探讨表观遗传修饰对Pdx-1基因转录表达的作用。方法:采用免疫共沉淀-实时定量PCR法检测小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞和小鼠β细胞株NIT-1细胞Pdx-1和MLH1基因转录起始区DNA甲基化和组蛋白修饰(H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化)的状况。同时采用实时定量RT-PCR检测上述3种细胞各基因mRNA表达水平。分析基因的DNA甲基化水平、H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化修饰与基因表达之间的相互关系。结果:(1)以mES细胞为对照,NIT-1细胞的Pdx-1基因转录起始区呈低DNA甲基化和高H3K4m3修饰(P0.05),NIH3T3细胞的Pdx-1基因的转录起始区的DNA甲基化、H3乙酰化、H3K4m3和H3K9m3修饰水平明显增高(P0.05);(2)Pdx-1基因仅在NIT-1细胞表达,其表达与DNA甲基化存在等级负相关(r=-0.802,P0.01),与H3K4m3修饰存在直线相关(r=0.997,P0.01),与H3K9m3修饰存在等级负相关(r=-0.879,P0.01);(3)管家基因MLH1的表达与所检测的表观遗传修饰无相关性。结论:DNA甲基化、H3K9m3与H3K4m3修饰能相互协调,共同调控Pdx-1基因的表达,对胚胎干细胞向β细胞分化具有重要意义。     

胚胎大鼠脑室下区神经细胞体外培养和向黑质细胞定向诱导的实验研究

本研究目的在于探寻体外培养和定向诱导胚胎大鼠脑室下区(SVZ)神经细胞向黑质细胞分化的新方法。采用成年大鼠黑质匀浆上清液(HSN)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及HSN+bFGF对取自胎龄期12~16d(E12~E16)胚胎大鼠SVZ培养的神经细胞(经nestin抗体免疫组化及透射电镜识别)进行体外诱导培养48h后,以TH单抗免疫组化方法检测其是否向黑质细胞分化;并用荧光分光光度法测定HSN+bFGF诱导后0、24、48hSVZ神经细胞培养液中多巴胺含量。结果显示:(1)HSN+bFGF诱导组,TH单抗免疫组化出现阳性细胞;(2)HSN+bFGF诱导后0、24、48h多巴胺含量对比分析:48h与24h(P<0.01)、48h与0h(P<0.05)相比,多巴胺含量明显增加,而24h与0h相比则无增加趋势(P>0.05)。以上结果表明:(1)用成年大鼠HSN+bFGF能定向诱导胚胎大鼠SVZ神经细胞向黑质细胞分化,诱导而成的黑质细胞已具有多巴胺分泌功能,诱导后24~48h为多巴胺分泌的一个高峰;(2)透射电镜显示胚胎大鼠SVZ神经细胞超微结构是除免疫组化外识别该神经细胞的另一种新方法。     

萝卜硫素促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的分子机制研究

目的 探讨萝卜硫素（Sul）促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化的分子机制。方法 将BMSCs分为对照组（不做任何处理）、诱导组（诱导成骨分化）、诱导+Sul组（诱导成骨分化并加入40μmol/L Sul）;分别向BMSCs转染腺病毒-shRNAMock、-shRNA-TET1、-shRNA-TET2、-shRNA-TET3,作为shRNA-Mock组、shRNA-TET1组、shRNA-TET2组、shRNA-TET3组;BMSCs于含成骨分化诱导培养液及添加40μmol/L Sul的细胞培养液中培养,然后转染腺病毒-shRNA-TET1、-shRNA-TET2、-shRNA-TET3、-shRNA-Mock,作为诱导+Sul+shRNA-TET1组、诱导+Sul+shRNA-TET2组、诱导+Sul+shRNA-TET3组、诱导+Sul+shRNA-Mock组。qPCR法和Western blot法测定BMSCs向成骨细胞分化后Runx2 mRNA和蛋白的表达水平。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验测定BMSCs向成骨细胞分化后,与Histone H3结合的Runx2启动...     

bFGF2抑制BMP9诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2向成骨细胞分化

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)对于骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响,并探讨其机制.方法 用BMP9和FGF2重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞,测定成骨早期标志物碱性磷酸酶(ALP)活性变化,茜素红S染色观察成骨晚期标志物钙盐沉积,pl2SBE-luc荧光素酶报告基因活性检测,Western blot检测经典信号通路smadl/5/8和成骨关键转录因子RUNX2的变化,以及晚期成骨标志物骨钙素(OCN)的表达.结果 FGF2抑制了BMP9诱导的早期成骨指标ALP和晚期成骨指标钙盐沉积和骨钙素的表达,抑制了经典的BMPs-Smad信号通路,抑制了成骨关键的转录因子Runx2的表达.结论 FGF2可抑制BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化.     

低营养及低氧状态下NIH3T3细胞增殖及细胞周期的变化及对bFGF的影响

目的： 体外模拟慢性创面缺氧、低营养环境，观察成纤维细胞在该状态下增殖及细胞周期的变化及对外源性生长因子（bFGF）的反应,探讨低氧、低营养条件下成纤维细胞的病理生理变化。方法: 单纯缺氧环境采用厌氧培养箱，通入混合气，氧分压（PO₂）分为27 mmHg和44 mmHg 2个水平；低营养环境则控制培养液新生牛血清（NCS）浓度。用MTT法检测细胞活性以及其对外源性生长因子的反应，用流式细胞仪检测细胞周期。结果: PO₂ 44 mmHg时细胞增殖速度较同期对照组无明显差异；PO₂ 27 mmHg时，细胞增殖速度较同期对照组明显减慢（P<0.01），细胞被阻滞于G₀期，S期细胞比例明显减少，bFGF未显示促增殖作用。NCS浓度为0.5%的低营养状态下细胞增殖速度较同期对照组明显减慢（P<0.01），细胞被阻滞于G₀-G₁期（P<0.01）；bFGF能明显改善低营养状态下的增殖减慢（P<0.01），使G₂-M期细胞比例增加（P<0.05）。结论: 27 mmHg PO₂或NCS浓度为0.5%的低营养环境使细胞阻滞于G₀-G₁期，影响成纤维细胞增殖；bFGF可以改善低营养条件下细胞增殖减慢的状态，但对极度缺氧条件下的成纤维细胞增殖障碍无明显作用。     

CKLF1-C19多肽对TGF-β诱导原代人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的干预作用

目的:探讨CKLF1-C19多肽(C19)对TGF-β诱导原代人肺成纤维细胞(LFB)向肌成纤维细胞(MFB)转化的干预作用。方法:培养原代人肺成纤维细胞并鉴定。用适宜的TGF-β浓度处理LFB,制备LFB向MFB转化的细胞模型。随后将实验分为对照组、TGF-β(5μg/L)组及4个浓度(1、0.1、0.01、0.001 mg/L)C19与TGF-β合用组。以细胞生长状态、细胞增殖率、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及I型胶原蛋白(collagen I)的表达变化为观察指标。结果:经显微镜检测,证实成功培养出原代人LFB。5μg/L TGF-β明显刺激LFB增殖及α-SMA和collagen I表达(P0.05)。与TGF-β组相比,C19-0.01 mg/L+TGF-β及C19-0.001 mg/L+TGF-β组LFB的细胞增殖率、α-SMA和collagen I的mRNA及α-SMA的蛋白表达均明显降低(P0.05)。结论:0.01 mg/L及0.001mg/L的CKF1-C19多肽对TGF-β诱导的LFB向MFB转化有一定的抑制作用,可在一定程度上抑制气道重塑和纤维化的发生。     

γ射线对C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺成纤维细胞生物学行为影响的比较研究

目的比较C57BL/6J和C3H/HeN两种小鼠肺成纤维细胞以不同剂量的60Coγ射线照射后生物学行为的异同。方法原代分离培养C57BL/6J和C3H/HeN两种小鼠肺成纤维细胞(LF),应用2、4、6和8Gy的60Coγ射线照射后,通过MTT比色法、流式细胞术、AgNOR染色和免疫荧光细胞化学染色法,检测照射后两种LF的增殖活力、细胞周期以及a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达的变化。结果以2~8Gy照射后,C57BL/6J和C3H/HeN小鼠的LF增殖活力与正常对照组相比较未见明显增强。照射后,C57BL/6J小鼠的LF非整倍体增多,a-SMA高表达,MMP-1的表达呈弱阳性,TIMP-1的表达呈增强趋势。照射后,C3H/HeN小鼠的LF出现G2-M期阻滞,a-SMA的表达减弱至消失,MMP-1和TIMP-1的表达均呈增强趋势。结论以60Coγ射线照射后,C57BL/6J和C3H/HeN两种小鼠的LF生物学行为不同,C57BL/6J小鼠的LF呈“活化”状态,为该种小鼠易发生肺纤维化的细胞学基础提供了实验依据。     

淫羊藿苷对小鼠皮肤成纤维细胞重编程为心肌样细胞的作用

目的研究小鼠成纤维细胞重编程为心肌样细胞(induced cardiomyocytes,iCMs)过程中淫羊藿苷(icariin,ICA)的作用及心血管发育中胚层相关蛋白1(mesoderm posterior 1,Mesp1)的表达。方法 MTT法筛选ICA的最佳药物浓度。GMT转染小鼠皮肤成纤维细胞,建立重编程心肌样细胞模型。qRT-PCR检测转染后重编程细胞中肌球蛋白重链6(myosin heavy chain 6, Myh6)的mRNA表达,免疫荧光细胞化学方法检测心肌肌钙蛋白I (cardiac troponinI, cTnI)及Mesp1的表达情况。结果 ICA最佳药物浓度为10-7mol/L。ICA组诱导iCMs高表达cTnI,是GMT组的1.3倍。Myh6 mRNA在重编程第3周达到高峰,且ICA组显著高于GMT组(P0.01)。Mesp1与c TnI的表达趋势正好相反。结论 ICA可以提高成纤维细胞重编程为心肌样细胞的效率;Mesp1参与促进成纤维细胞重编程的过程。     

用共聚焦及电子显微镜比较干扰素β诱导的神经母细胞瘤和非神经细胞水疱性口炎病毒感染情况的变化

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)复制活动对干扰素(IFN)诱导的抗病毒反应高度敏感。对敏感的培养细胞进行IFN-β预处理可使感染性VSV颗粒释放降低上万倍。但是,感染性颗粒滴度下降的机制在神经母细胞瘤和非神经细胞来源的细胞中并不相同。使用免疫荧光共聚焦显微镜观察L929-成纤维细胞来源的细胞发现,在对照条件下,VSV基质磷     

LPS诱导L929细胞β防御素2和schlafen-2基因的表达及其信号转导

目的:通过研究LPS对于小鼠成纤维细胞(L929)β防御素(defb)和schlafen(slfn)基因表达的影响及其信号转导通路,探讨纤维细胞对病原微生物的防御作用。方法:LPS(200ng/ml)处理L929细胞2、4、6小时,提取细胞总RNA,用RT-PCR和荧光定量PCR的方法检测defb1,2和slfn1,2,3基因表达;应用Westernblot的方法检测了defb2蛋白的表达。NF-κB和P38MAPK两种信号转导通路的化学抑制剂BMS345541和PD169316检测defb2和slfn2基因表达的信号转导通路。结果:LPS能诱导小鼠成纤维细胞defb2的表达,并增强slfn2的表达;P38MAPK和NF-κB信号转导通路调控小鼠成纤维细胞defb2和slfn2的表达。结论:在感染时,小鼠成纤维细胞可能通过诱导defb2的产生而发挥抵御病原微生物的作用。