RBPJ与KyoT2真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有myc-RBPJ(R218H)(recombination binding protein-J)、myc-KyoT2融合基因片段的质粒,并在真核细胞中表达、鉴定。方法:由本科室保存质粒酶切分别得到RBPJ(R218H)和myc-KyoT2基因片段,将RBPJ(R218H)基因插入载体PCMV-myc中,获得融合基因myc-RBP-J(R218H),将myc-RBPJ(R218H)和myc-KyoT2插入真核表达载体pIRES2-EGFP,构建真核表达载体myc-RBPJ(R218H)-IRES2-EGFP、myc-KyoT2-IRES2-EGFP。以其瞬时转染HEK293细胞,应用免疫印迹与流式细胞术检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达。结果:正确获得myc-RBPJ(R218H)融合基因,DNA序列分析表明所构建的含myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的质粒与设计相同,myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合蛋白与绿色荧光蛋白均正确表达。结论:成功构建了含有myc-RBPJ(R218H)、myc-KyoT2融合基因的真核表达载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究慢性粒细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

PCR克隆技术构建抑癌基因NOEY2真核表达载体

在肿瘤分子生物学研究中,经常需要对PCR产物进行克隆,其最基本目的是为被检测的基因留下一份硬拷贝。基于PCR的克隆方法很多,最常被提到的策略是预先于引物的5′端设置限制性酶切位点,PCR产物经酶切后再与线性化的载体相连接[1,2]。但是,某些常用的限制性内切酶对线性PCR产物双链末端的位点识别和切割效率很差,这一路线有时难以实现[3]。最近我们利用这种方法构建最新报道的抑癌基因NOEY2的真核表达质粒失败后,改用T/A策略作为过渡,很快获得成功,现介绍如下。 1 材料与方法 1.1 主要材料、试剂及设备 Raji细胞株和大肠杆菌DH5α由本室保种。总RNA提取试剂Trizol,购自Gibcol BRL公司。逆转录PCR试剂：MMLV、RNasin、OligodT、dNTP、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、T4DNA连接酶、pGEMT载体均购自Promega公司。真核表达载体pc DNA3来自Invitrogen公司。引物合成：北京赛百胜公司。凝胶DNA纯化试剂盒QIAEXII购自Qiagen公司。PE9700型热循环仪、ABI310型自动DNA测序仪及测序试剂(BigDye Terminator Kit等),均为Perkin-Elmer公司产品。     

含绿色荧光蛋白及小鼠IFN-γ基因的高效真核表达载体的构建与鉴定

干扰素 γ(Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ γ ,ＩＦＮ γ)作为一种强有力的免疫调节剂已被广泛地应用于一些疾病的治疗 ,如肿瘤、慢性肉芽肿性疾病、肝纤维化等。既往的实验和临床研究中多采用重组的ＩＦＮ γ ,重组的ＩＮＦ γ和天然的ＩＮＦ γ在活性方面仍有一定的差距 ,且半衰期短 ,全身及局部应用有一定的毒副作用。因此 ,ＩＦＮ γ的转基因治疗或寻求开发其有效的基因治疗途径 ,具有重大意义。本研究中 ,我们构建了含绿色荧光蛋白的小鼠ＩＦＮ γ基因的高效真核表达载体 ,为进一步实施经呼吸道的ＩＦＮ γ转基因治疗打下了基础。1材料与方法1.…     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

ECM1-pEGFP-N2 真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的表达

目的构建细胞外基质蛋白1基因（ECM1）的真核表达载体ECM1-pEGFP-N2,检测其在人乳腺癌细胞系MCF-7中表达。方法采用PCR方法,以ECMleDNA为模板,扩增出ECM1基因,用Bg1 Ⅱ和KpnⅠ双酶切ECM1基因和pEGFP-N2载体,连接酶切目的片段,转化大肠杆菌DH5,筛选阳性克隆酶切、测序鉴定;利用脂质体介导的转染技术转染MCF-7细胞,荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP,免疫组化检测ECM1蛋白表达。结果利用PCR克隆出约1．6kb的ECM1基因;PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果证实成功构建ECM1-pEGFP-N2真核表达载体;转染MCF-7细胞后,可在细胞内观察到报告基因产生的绿色荧光,用免疫组化方法可检测到ECM1蛋白。结论成功构建了ECM1-pEGFP-N2真核表达载体,并在MCF-7细胞中表达,为进一步研究ECM1的功能奠定了基础。     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，构建真核表达载体，本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因，并与pcDNA3．1定向连接，构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3．1-CD，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。结果克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了真核表达载体，经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性。结论 pcDNA3．1-CD真核表达载体构建成功。     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.     

人类α型叶酸受体基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 探讨如何以人类α型叶酸受体(FOLR-1)基因为基础构建核酸疫苗。方法 应用RT-PCR技术，从人类卵巢癌细胞系-SKOV3细胞中扩增FOLR-1基因，插入克隆载体pGEM-T Easy，经DNA自动测序仪测序证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3．1( )，并使用限制性内切酶酶切鉴定。结果 从卵巢癌细胞系SKOV3中成功扩增出FOLR-1基因，并克隆人pcDNA3．1( )载体。结论 成功构建FOLR-1的重组克隆及真核表达载体，为今后利用FOLR-1进行卵巢上皮性肿瘤的免疫及导向治疗研究打下了基础。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

MicroRNA-378真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建microRNA-378（miR-378）真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378。方法：根据miRBase提供的序列合成miR378前体序列,退火形成双链后,插入真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR,构建pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378。进行酶切和测序鉴定后,转染人胃癌细胞株SGC-7901,应用实时定量PCR检测转染后miR378的表达量。结果：pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378的酶切、测序表明与设计一致,实时定量PCR证实转染pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378能够上调miR378的表达水平。结论：成功构建了miR378真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/±EmGFP-miR378,为进一步探讨miR378在胃癌中的作用奠定了基础。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

Notch1 胞内段荧光表达质粒的构建及鉴定

目的：构建能够在鼻咽癌细胞株中高效表达人Notchl信号胞内段（NIC）的荧光质粒。方法：通过RT—PCR获得人NIC的cDNA;利用基因重组技术插入到pEGFP—N1中;在脂质体介导下转染人低分化鼻咽癌细胞CNE2后,经荧光显微镜、RT—PCR和Westernblot检测NIC的表达情况。结果：RT—PCR方法得到一条2424bp的特异性扩增产物,酶切和基因测序结果表明重组质粒构建成功。转染48h后,检测到绿色荧光表达,RT～PCR和Westernblot的结果显示NIC的表达量升高。结论：正确构建了人NIC荧光表达质粒。该质粒能够在鼻咽癌细胞株中高效表达,为研究Notch信号通路在鼻咽癌中的作用奠定了实验基础。     

bcr-abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的真核表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7中高效表达.方法 提取慢性粒细胞白血病K562细胞的RNA,经RT-PCR技术扩增得到bcr-abl基因后,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,并进行PCR和酶切鉴定.鉴定为阳性的克隆,再进一步进行测序分析.将构建成功的真核表达载体转入COS-7细胞中进行瞬时表达.结果 反转录PCR扩增后的产物,经琼脂糖凝胶电泳可以在约874 bp处看见一特异性的条带,序列分析证明扩增产物与GeneBank中的bcr-abl基因序列相同.将pEGFP-bcr-abl真核表达载体转入COS-7细胞后,经RT-PCR、Western blotting检测证明表达产物正确.结论 成功构建了含有bcr-abl融合基因的真核表达质粒,从而为进一步研究其结构和功能,寻找CML诊疗的新方法奠定了基础.     

中性粒细胞异常增殖相关的BCR/ABL-慢性白血病的临床特征

目的:探讨与中性粒细胞异常增殖相关的BCR/ABL-慢性白血病的临床特征.方法:报告3例不同类型与中性粒细胞异常增殖相关的BCR/ABL-慢性白血病并结合文献进行讨论.结果:3例均为老年男性,表现为以中性粒细胞为主的白细胞异常增多、BCR/ABL融合基因阴性.例1诊断为慢性中性粒细胞白血病(CNL),脾大,外周血以成熟中性粒细胞增高为特征,胞浆内中毒颗粒易见,无明显病态造血,中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色强阳性,骨髓粒系增生明显活跃.例2诊断为不典型慢性髓细胞白血病(aCML),血涂片示不成熟粒细胞比例增高伴粒系病态造血,尤其核染色质异常浓聚更为明显,骨髓象表现为髓系增生和病态造血,原始细胞轻度增多.例3诊断为慢性粒单核细胞白血病(CMML),外周血成熟单核细胞数量和比例异常偏高,粒系病态如核分叶过多、环状核和假性Pelger-Huet畸形等易见,骨髓髓系增生明显活跃伴病态造血,无原始细胞增多.结论:中性粒细胞异常增殖相关的BCR/ABL-慢性白血病较为少见,易于误诊,细胞形态学特征是诊断BCR/ABL-慢性白血病的基础.临床表现、多种实验室检查结果尤其是分子生物学等有助于正确诊断这类疾病.