乙型肝炎病毒197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响

目的研究197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响。方法构建EGFP-野毒株核壳蛋白、197L变异核壳蛋白融合表达载体（pEGFP—WT和pEGFP—L97）,酶切和测序鉴定;将pEGFP—WT、pEGFP—L97和对照质粒分别转染HepG2细胞．筛选阳性细胞株;荧光显微镜观察阳性克隆细胞荧光蛋白表达,Western—blot检测核壳蛋白表达：以TNF-α、Act-D诱导HepG2细胞株凋亡,0、16、32和48h采用流式细胞术检测细胞凋亡,32h时采用共聚焦检测细胞凋亡比例。结果成功建立了融合表达蛋白表达载体;荧光显微镜显示各细胞克隆有较好的荧光蛋白表达,Western-blot检测各细胞系核壳蛋白表达没有差异;16、32、48h时,pEGFP-WT、pEGFP-L97表达细胞株凋亡率均明显低于pEGFP-C1细胞株（P〈0．05）;32h和48h时,pEGFP-L97细胞株凋亡率明显高于pEGFP-WT细胞株（P〈0．05）;32h时激光共聚焦检测结果与流式细胞术检测结果一致。结论乙型肝炎病毒197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响与野毒株核壳蛋白不同,与野毒株核壳蛋白相比,197L变异核壳蛋白对凋亡因素可能更敏感。     

乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响

目的研究L60VI、97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响。方法构建变异核壳蛋白融合表达载体pEGFP-V60和pEGFP-L97和变异核壳蛋白阳性HepG2细胞株;荧光显微镜和western blotting检测核壳蛋白表达;以TNF-α、Αct-D诱导HepG2细胞株凋亡,0、16、32h和48h采用流式细胞术检测细胞凋亡,32h时采用共聚焦检测细胞凋亡比例。结果成功建立融合蛋白表达载体和融合变异核壳蛋白表达细胞系,各细胞株核壳蛋白表达量基本相同;16、32、48h时,pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97表达细胞株凋亡率均明显低于pEGFP-C1细胞株(P<0.05);32h和48h时,pEGFP-V60和pEGFP-L97细胞株凋亡率均明显高于pEGFP-WT细胞株(P<0.05);32h时激光共聚焦检测结果一致。结论乙型肝炎病毒L60VI、97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响与野毒株核壳蛋白不同,L60VI、97L变异可能是慢性肝炎活动的原因之一。     

乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响

目的研究L60V、I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响。方法构建变异核壳蛋白融合表达载体pEGFP-V60和pEGFP-L97和变异按壳蛋白阳性HepG2细胞椿；荧光显微镜和western blotting检测按壳蛋白表达；以TNF-α、Act—D谤导HepG2细胞株凋亡。0、16、32h和48h采用流式细胞术检测细胞凋亡，32h时采用共聚焦检测细胞凋亡比例。结果成功建立融合蛋白表达载体和融合变异极壳蛋白表达细胞系，各细胞株核壳蛋白表达量基本相同；16、32、48h时，pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97表达细胞椿凋亡率均明显低于pEGFP-C1细胞株（P〈0．05）；32h和48h时。pEGFP-V60和pEGFP-L97细胞株凋亡率均明显高于pEGFP-WT细胞椿（P〈0．05）；32h时激光典聚焦检测结果一致。结论乙型肝炎病毒L60V、I97L变异按壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响与野毒株按壳蛋白不同。L60V、I97L变异可能是慢性肝炎活动的原因之一。     

乙型肝炎病毒核壳蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的初步探讨乙型肝炎病毒野生型核壳蛋白和L60V、I97L变异核壳蛋白影响HepG2细胞凋亡的分子机制。方法将构建的野生型核壳蛋白融合表达载体(pEGFP-WT),L60V变异核壳蛋白(pEGFP-V60)和I97L变异核壳蛋白(pEGFP-L97)表达载体HepG2阳性细胞株复苏培养;Western blot检测各核壳蛋白表达;TNF-α、Act-D诱导各种HepG2细胞株凋亡,48h采用流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测NF-κB信号传导通路中IKK-α、IκB-α、NF-κBP65蛋白表达与caspase-8、caspase-3蛋白表达情况。结果Western blot检测pEGFP-WT组、pEGFP-V60组和pEGFP-L97组核壳蛋白表达基本相同;流式细胞术检测显示,与pEGFP-C1细胞株相比,48h时pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97表达细胞株的细胞凋亡率均明显偏低(P<0.01);4组细胞株IKK-α、IκB-α、NF-κBP65蛋白表达水平无明显差异,而pEGFP-WT组caspase-8、caspase-3蛋白表达水平明显低于pEGFP-V60和...     

HBV X蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的:初步探讨HBV X蛋白表达对转染X基因HepG2细胞的影响。方法:磷酸钙沉淀法转染真核表达质粒pCDNA3.1(+)/x到人肝癌细胞株HepG2;72 h后,Western-blot检测X蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;MTT法测定细胞活力。结果:磷酸钙沉淀法能有效的导入X基因且Western-blot能检测到X蛋白表达;MTT法、流式细胞术结果显示X蛋白表达组细胞活力受抑制(P<0.01),凋亡率增加(P<0.01)。结论:HBV感染及其相关慢性肝病中,X蛋白的表达可能与肝细胞凋亡,炎症活性相关。     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达TLR3的影响

目的 乙肝病毒全基因组体外扩增,构建质粒并测序,酶切后瞬时转染HePG2细胞,观察对HBV抗原分泌,病原识别受体Toll样受体3(TLR3)的表达及细胞增殖的影响.方法 长片段PCR法扩增HBV DNA全长,构建pBlueScript-HBV质粒并转化宿主菌,摇菌后提取质粒经测序,用Sap Ⅰ酶切,获得HBV 3.2 kb基因组,采用脂质体瞬时转染HepG2细胞株,IMX检测HBV所分泌抗原,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR3的阳性细胞百分率,并与空白对照组对比.结果 HBsAg和HBeAg的分泌随着转染HBV DNA量的增加而升高,除4 μg和6 μg组两组间比较的表面抗原外,差异均有显著性(P＜0.05).TLR3在转染后均有上调,除4 μg与6 μg组间比较外,各组间差异有显著性(P＜0.05).台盼蓝拒染法示细胞存活随转染剂量的升高而减少(P＜0.05),但4 μg和6 μg两组间比较差异无显著意义(P＞0.05).而各转染剂量组HBsAg和e抗原的分泌及细胞的存活数均与TLR3的表达呈显著正相关(P＜0.01).结论 本研究初步表明乙肝病毒可能直接引起HepG2细胞TLR3的上调,而且上调可能启动了细胞的凋亡或坏死机制,成为HBV损伤细胞的非免疫细胞介导机制.     

辣椒素对肝癌HepG2细胞凋亡的诱导作用

目的:探讨辣椒素对肝癌HepG2细胞生长抑制及凋亡诱导作用的机制。方法:以100、200、400μmol/L浓度辣椒素处理肝癌HepG2细胞后分别培养12、24、48 h,MTT法测定细胞增殖抑制率;TUNEL法检测细胞凋亡;Western Blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bad的表达。结果:随着作用浓度及时间增加,经辣椒素处理的肝癌HepG2细胞增殖活性明显降低(P<0.01);抑制率均显著增加,呈浓度和时间依赖性(P<0.01);HepG2细胞凋亡率也随辣椒素浓度增加而上升;凋亡相关蛋白Bcl-2表达下降,Bax、Bad表达上升(P<0.05)。结论:辣椒素对肝癌HepG2细胞具有增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与调节凋亡相关蛋白有关。     

HepG2和HepG2.2.15细胞对一些凋亡刺激的不同耐受性

目的阐明ＨＢＶ对感染细胞凋亡的影响。方法在ＨｅｐＧ２及其转染ＨＢＶ的２．２．１５细胞培养中，加ＭＴＶ、ＡｃｔＤ或去血清培养，以ＦＣＭ检测细胞凋亡率。结果ＨｅＧ２．２．２．１５细胞加ＭＴＸ后２４ｈ和４８ｈ凋亡率分别为１０．８％和１３．３％，加ＡｃｔＤ后分别为１６．８％和３７．７％，去血清后第４天及第６天分别为１３．２％和１４．８％：而ＨｅｐＧ２细胞加ＭＴＸ后２４ｈ和４８ｈ凋亡率则为１２．６％和６５．３％，加ＡｃｔＤ后分别为４４．５％和８９．７％，去血清后第４天和第６天凋亡率为１９．８％和２８．８％。确认在这些条件下ＨｅｐＧ２．２．１５细胞较ＨｅｐＧ２细胞耐受凋亡。结论ＨＢＶ可能抑制肝癌细胞凋亡。     

白藜芦醇通过影响线粒体膜电位诱导HepG2细胞凋亡

目的 研究白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的机制,探讨白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡过程中线粒体膜电位的变化。方法采用MTT法测定白藜芦醇对HepG2细胞的生长抑制作用,通过荧光染色及流式细胞术检测细胞凋亡,电子显微镜观察细胞超微结构的变化,用Rhodaminel23和TMRE标记细胞线粒体膜电位（△ψ）,并分别通过流式细胞仪和共聚焦激光扫描显微镜检测。结果低浓度白藜芦醇（≤25μmoFL）对HepG2细胞的生长抑制作用不显著,而高浓度白藜芦醇（〉25μmol／L）显著地抑制HepG2细胞的生长,且呈时间和浓度的依赖性（F=18．532,P〈0．05）;流式细胞术分析显示,白藜芦醇能显著诱导HepG2细胞凋亡,且呈浓度依赖性（P〈0．05）;白藜芦醇能降低HepG2细胞线粒体膜电位。结论白藜芦醇抑制HepG2细胞增殖,并诱导细胞凋亡,白藜芦醇使HepG2细胞线粒体膜电位去极化,提示线粒体膜电位去极化在白藜芦醇诱导细胞凋亡的过程中起作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白表达及其对HepG2细胞凋亡的影响

目的探讨HBV X蛋白表达对转染x基因HepG2细胞的影响。方法构建真核表达质粒pCDNA3．1（＋）／x，磷酸钙沉淀法转染到人肝癌细胞株HepG2；Western—blot检测X蛋白表达；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率；MTT法测定细胞活力。结果磷酸钙沉淀法能有效的导入X基因且Western—blot能检测到X蛋白表达；MTT法、流式细胞术结果显示X蛋白表达组细胞活力受抑制（P≤0．01），凋亡率增加（P≤0．01）。结论HBV感染及其相关慢性肝病中，X蛋白的表达可能与肝细胞凋亡，炎症活性相关。     

乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.     

乙肝病毒C区基因变异对干扰素疗效的影响

目的：探讨乙肝病毒(HBV)C区基因变异与干扰素疗效的相互关系。方法：采用荧光定量PCR法对30例经干扰素治疗的慢性乙肝患者治疗前后病毒滴度进行检测。选取有反应、复发、无反应的患者各3例，进行基因序列分析。结果：干扰素治疗的总有反应率为26．7％(8／30)，C区的基因变异多发生于抗原表位附近，主要为点突变及缺失突变，多不引起氨基酸水平的改变。CTL表位氨基酸相对保守，总变异率约为9氨基酸／9人，而Th表位氨基酸变异相对较多，总变异率为55氨基酸／9人。结论：干扰素治疗后HBVC区核苷酸及编码的氨基酸突变率增加，且多集中于C区抗原表位，CTL表位变异可能与干扰素疗效有关。     

HCV核心基因转染对QBC939细胞凋亡及细胞周期的影响

[目的]研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)对肝门部胆管癌细胞(QBC939)细胞凋亡及细胞周期的影响.[方法]将包含HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA HCV-C和空载体,利用脂质体介导将其转染QBC939,经G418筛选获得稳定转染HCV-C的QBC939细胞(QBC939 HCV-C ),RT-PCR和免疫荧光法检测HCV-C蛋白表达,MTT法检测QBC939 HCV-C 细胞、空白质粒转染QBC939(QBC939pcDNA)细胞和未转染QBC939细胞生长增生率;流式细胞术(FACS)检测3组细胞凋亡率和细胞周期,以及QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡后的细胞周期变化.[结果]①QBC939 HCV-C 细胞增殖率显著高于空白质粒转染QBC939和未转染QBC939细胞增殖率;②细胞未经Fas抗体诱导凋亡时,QBC939 HCV-C 细胞S期(20.1%±1.8%)高于未转染QBC939细胞S期(14.2%±3.6%),QBC939 HCV-C 细胞凋亡率(5.0%±0.7%)低于无HCV-C转染QBC939细胞凋亡率(9.2%±0.7%);③QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡时,细胞S期低于未经诱导凋亡细胞S期.[结论]HCV-C蛋白具有抑制QBC939细胞凋亡和促进细胞增殖作用.     

沈阳地区乙型肝炎病毒DNA前C区变异研究

用限制性酶切片段长度多态性分析对沈阳地区７０例血清经巢式聚合酶链反应扩增ＨＢＶ ＤＮＡ阳性的乙型肝炎患者的Ｃ基因前Ｃ区１８９６位点进行分析。结果：（１）急性乙型肝有Ｃ区变异检出率为４％（１／２０），慢性迁延肝炎为２５％（５／２０），慢性活动性肝炎为３８％（５／１３），肝硬化为３３％（４／１２）；（２）ＡＬＴ升高组中，ＨＢｅＡｇ及抗ＨＢｅ均阴性患者和ＨＢｅＡｇ阴性，抗ＨＢｅ阳性患者ＨＢＶ ＤＮＡ前Ｃ     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

体外培育牛黄诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的研究体外培育牛黄诱导人肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡的作用及机制。方法用单层培养法培养HepG2细胞，用不同剂量的体外培育牛黄作用于HepG2细胞不同时间，用荧光显微镜、透射电镜观察细胞形态的改变及细胞凋亡，用流式细胞仪检测HepG2细胞的亚G1峰细胞（凋亡）率的变化。结果体外培育牛黄100～800ug／ml作用于HepG2细胞48h后，HepG2细胞表现为细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形成等凋亡特征性形态学改变；流式细胞直方图上可见亚二倍体峰，不同浓度作用于HepG2细胞24、36、48、72h后的细胞凋亡率均显著高于空白对照组（P〈0．01），400ug／ml浓度组与阳性对照FT207（100ug／ml）组比较无明显差异。结论体外培育牛黄能诱导人肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡。